3-адренергичен рецептор върху инфилтриращи тумор лимфоцити поддържа IFN{2}}зависима експресия на PD-L1 и влошава антитуморния имунитет при невробластома

Невробластомът (NB) е хетерогенен екстракраниален тумор, възникващ в детска възраст. Отличителна черта на NB туморите е тяхната невроендокринна способност да секретират катехоламини, които от своя страна, чрез лигиране на -адренергични рецептори, могат да повлияят на различни сигнални пътища в туморната микросреда (TME). По-рано беше демонстрирано, че специфичният антагонизъм на 3-адренергичния рецептор (3- AR) върху NB туморни клетки повлиява растежа и прогресията на тумора. Тук, в миши сингенен модел на NB, ние имахме за цел да проучим дали 3-AR модулацията е повлияла на отговора на имунната система на гостоприемника срещу тумора. Резултатите показват, че 3-AR антагонизмът води до реактивиране на имунния отговор, частично зависимо от участието на сигналната ос PD-1/PD-L1. Наистина, 3- AR блокадата върху тумор-инфилтриращи лимфоцити (TILs) намалява способността им да секретират IFN-, което от своя страна намалява експресията на PD-L1, причинена от TILs инфилтрация, върху NB туморни клетки. По-нататъшни изследвания, чрез геномен анализ на пациенти с NB, показаха, че високата експресия на ген ADRB3 корелира с по-лоши клинични резултати в сравнение с групата с ниска експресия и че експресията на ген ADRB3 засяга различни имуно-свързани пътища. Като цяло резултатите показват, че 3-AR в NB TME е в състояние да модулира взаимодействието между тумора и имунната система на гостоприемника и че неговият антагонизъм засяга множество протуморни сигнални пътища.

Графичен абстракт

ВЪВЕДЕНИЕ

Невробластомът (NB) е сложно и хетерогенно заболяване и най-често срещаният тип рак, диагностициран през първата година от живота. NB е невроендокринен тумор, който възниква от ангажирани прекурсорни клетки на нервния гребен по време на развитието на симпатиковата нервна система (SNS). Този отличителен произход определя локализацията на тумора, която обикновено се среща в надбъбречните жлези и/или симпатиковите ганглии [1]. Клиничното поведение на NB е силно променливо, вариращо от тумори, които спонтанно регресират, до други, които са станали рефрактерни на всички налични терапии, включително интензивна химиотерапия, хирургия, лъчетерапия, автоложна трансплантация на стволови клетки и прилагане на ретиноиди (13-цис-ретиноеви киселина) [2]. Следователно са необходими алтернативни терапевтични цели за тези неповлияващи се тумори. Имунотерапията, базирана на инхибитори на имунни контролни точки (ICIs), представлява най-обещаващата стратегия за няколко солидни тумора [3]. Наред с другото, сигналната ос на програмираната смърт лиганд-1/програмирана смърт-1 (PD-L1/PD-1) уврежда ефекторния Т-клетъчен имунитет и повишава имунната толерантност на туморните клетки, играейки ключова роля роля в отслабването на антитуморните отговори както при миши, така и при човешки рак [4, 5]. Въпреки това, въпреки че многобройни проучвания вече са изследвали механизмите, лежащи в основата на сигнализирането на PD-1/PD-L1 при рак при възрастни, малко се знае за педиатричните тумори. Сложно кръстосано взаимодействие между SNS и имунната система, чрез освобождаването на катехоламин и активирането на сигнализирането на -адренергичните рецептори, е в състояние да определи съдбата на туморната прогресия в много тумори [6]. Това може да е особено вярно при пациенти с NB, при които наистина повишените нива на катехоламини отразяват тежестта на злокачественото заболяване [7]. Подтипът 3-адренергичен рецептор (3-AR) наскоро беше идентифициран като критичен регулатор на рака [8–10]. По-специално, неговата експресия и активиране, както върху туморни, така и върху стромални клетки на туморната микросреда (TME), предизвикват протуморни сигнални пътища, отговорни за прогресията на тумора в различни предклинични модели [11–14]. Тук, в сингенен миши модел на NB, ние демонстрирахме, че 3-AR върху тумор-инфилтриращи лимфоцити (TILs) поддържа IFN- - зависима регулация нагоре на PD-L1 върху туморни клетки, което от своя страна води до имуносупресивен ТМЕ, отговорен за избягването на тумора. В допълнение, 3-антагонизмът на AR успя да увеличи броя на имунно-реактивните CD8+, естествените убийци (NK) и дендритните клетки (DC) и да намали броя на имуносупресивните регулаторни Т клетки (Treg) и миелоидни супресорни клетки (MDSC) в TME. Освен това, анализ на Kaplan-Meier показа, че високата експресия на ген ADRB3 е свързана с лоша преживяемост на пациенти с NB, а анализите на различни налични публични набори от данни за експресия на NB разкриват значителна корелация между нивото на експресия на ген ADRB3 и гените, участващи в сигналните пътища, свързани с взаимодействието имунна система/тумор.

Ползи от cistanche tubulosa-антитуморен

МЕТОДИ

Клетъчна култура

Neuro-2A миши NB ракови клетки бяха получени от ATCC (CCL-131) и бяха отгледани в DMEM, допълнен с 10% FBS, 2 mM L-глутамин, 100 U·ml-1 пеницилин и 100 ug·ml-1 стрептомицин при 37 градуса в наситена с вода, 5% CO2 атмосфера. Невро-2a клетките бяха рутинно тествани за заразяване с микоплазма.

Сингенен миши модел на тумор

Женски NCI A/JCr мишки на възраст 4 седмици бяха закупени от Charles River Laboratories (Frederick). Невро-2a клетки (N2A) се имплантират подкожно в A/J реципиентни мишки чрез инжектиране на 1 × 106 клетки в 100 ul PBS в десния хълбок. Когато N2A клетки образуват осезаем тумор (около 8 дни), лечението започва. Леченията се прилагат два пъти на ден за SR59230A (Tocris Bioscience) и носител (физиологичен разтвор) и на ден 8 и ден 12 за антитяло PD-L1 (InVivoMAb анти-миши PD-L1 (B7-xhH1) #BE0101 , Bio X Cell) и изотип контрол (InVivoMAb плъши IgG2b изотип контрол # BE0090, Bio X Cell). Администрирането на IgG2b изотип контрол дава същите резултати за носители, следователно на фигурите е показано само състоянието на носителя. SR59230A се доставя при 10 mg/kg във физиологичен разтвор чрез интраперитонеално (ip); 250 µg от PD-L1 бяха доставени интраперитонеално в 100 µl InVivoPure™ pH 6.5 буфер за разреждане (#IP0065); 250 ug от IgG2b изотипна контролна мишка се доставя интраперитонеално в 100 ul InVivoPure™ pH 7.0 буфер за разреждане (#IP0070). Лечението с FTY720 (#6176, Tocris Biotechne) се прилага при 2 mg/kg per os (po) от ден 6. Скоростта на растеж на тумора се оценява чрез измерване на туморната маса с калибър и обемът на туморната маса се изчислява като обем {{ 41}} [(дължина × ширина)2 /2]. Мишките бяха умъртвени след 8 дни лечение.

Western blot анализ

Клетките бяха събрани и лизирани в RIPA буфер, съдържащ коктейл от протеазен инхибитор. След количествено определяне, 20 ug от общите протеини бяха използвани за извършване на SDS-PAGE и WB анализ. PVDF мембраните се инкубират за една нощ с първичните антитела анти-PD-L1 (ab238697, Abcam), фосфо-CREB (ab32096, Abcam), CREB (ab32515, Abcam), p-PKA / / (sc- 32968, Santa Cruz Biotechnology), -актин (sc-1615, Santa Cruz Biotechnology), 3-AR (ab94506, Abcam) при 4 градуса и след това със специфични вторични антитела за 1 час при стайна температура. Свързването на антителата със специфичните протеини е открито чрез използване на Clarity Western ECL субстрат (Bio-Rad) и изображенията са получени чрез Chemidoc Imaging System (Biorad®). Софтуерът ImageJ беше използван за извършване на количествени анализи и интензитетът на сигнала на лентите беше изразен като кратно увеличение спрямо контролните стойности.

Съвместно култивиране за PD-L1 цитофлуориметричен анализ

Туморните клетки се посяват върху MW24 (45 000 клетки/ямка) и след 24 часа се култивират съвместно с лимфоцити, получени от TDLNs на мишки, предварително третирани в продължение на 2 дни с носител или SR59230A (T2), в съотношение на засяване 1:10 (тумор/лимфоцити). В края на общия инкубационен период (48 часа) лимфоцитите се изтеглят заедно със средата на съвместната култура чрез леко пипетиране и след това туморните клетки се отделят чрез трипсинизация и се маркират с анти-PD-L1 антитялото (CD274 антитяло { {17}}, eBioscience™) за цитофлуориметрично количествено определяне. Оцветените клетки бяха получени на MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer (Miltenyi Biotec, Gladbach, Германия) и данните бяха обработени с помощта на софтуер Flowlogic (Miltenyi Biotec, Gladbach, Германия).

Съвместно култивиране за PD-L1 имунофлуоресценция и количествено определяне на IFN

Туморните клетки се посяват върху предметни стъкла под микроскоп (20 000 клетки/ямка) в камера Nunc Lab-Tek слайд 4 и след 24 часа се култивират съвместно с лимфоцити, получени от TDLNs на мишки, третирани в продължение на 2 дни с носител или SR59230A (Т2), в съотношение на засяване 1:10 (тумор/лимфоцити). След 48 часа, лимфоцитите в културалната среда се събират чрез внимателно пипетиране и след това се изхвърлят чрез центрофугиране; супернатантата се използва за количествено определяне на IFN- чрез технологията Luminex xMAP съгласно инструкциите на производителя. Накратко, количественото определяне на IFN в средата за съвместно култивиране беше извършено с помощта на Bio-Plex Pro Mouse Cytokine IFN-Set (#171G5017M, Bio-Rad) и данните бяха получени на MAGPIX System (Luminex, Тексас, САЩ). Анализът беше извършен с помощта на софтуера Bio-Plex Manager™ (BIO-RAD, Калифорния, САЩ). Туморните клетки върху микроскопски предметни стъкла бяха използвани вместо това за извършване на PDL1 имунофлуоресцентен анализ, както следва. За имунофлуоресцентен анализ клетките се фиксират в 3% параформалдехид в PBS за 20 минути. Пропускливостта се получава чрез добавяне на разтвор, съдържащ Tween-20 0.5% в PBS за 30 минути при стайна температура. След това клетките се блокират в 3% BSA за 1 час и се инкубират с първично антитяло анти-PD-L1 (ab238697, Abcam) за 2 часа. Впоследствие, след промивания в PBS, предметните стъкла се инкубират с Alexa-fluor 488 вторично антитяло за 1 час. Изображенията са получени с помощта на флуоресцентен микроскоп (DMi8 - Leica microsystems).

Китайска билка растение цистанче-Противотуморно

siRNA електропорация на лимфоцити за 1- 2- и 3-AR заглушаване

Лимфоцитите, получени от TDLN, бяха трансфектирани със siPHK за селективни 1- (SASI_Mm01_00090154, последователност: GUGAUCGUGGCCAUCGCCA, Merck), 2- (SASI_Mm{ {5}}, последователност: CCAAGUUCGAGCGACUACA, Merck) и 3-AR (SASI_Mm01_00145466, последователност: CAGUGGACGUGCUCUGUGU, Merck) заглушаване. Накратко, лимфоцитите бяха електропорирани със siRNAs (100 nM) с помощта на 4D-Nucleofector X Unit (Lonza) и P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit (V4XP-3024, Lonza). Програмата DN-100, специфична за електропорация на миши Т клетки, беше изпълнена. След електропорация, лимфоцитите се култивират в TexMACS Medium (130-097-196, Miltenyi Biotec) в продължение на 24 часа и след това се култивират съвместно с N2A туморни клетки в продължение на 48 часа, както е описано по-горе, за количествено определяне на PD-L1. Ефективността на заглушаване на -ARs в лимфоцитите беше оценена чрез PCR с цифрови капчици, както следва.

Дигитална капкова PCR за -ARs mRNA количествено определяне

РНК беше обратно транскрибирана с помощта на iScript Advanced cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). ddPCR се извършва с помощта на ddPCR Supermix за сонди (без dUTP) (Bio-Rad), съгласно производствените инструкции, на система QX200 (Bio-Rad) и C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad). Използваните анализи бяха: Adrb3-FAM (dMmuCPE5088688), Adrb2-FAM (dMmuCPE5089938), Adrb1-FAM (dMmuCPE5100184), Rps18-HEX (dMmuCPE5196447). ddPCR данните бяха анализирани с помощта на софтуер QuantaSoft™ (версия 1.7.4, Bio-Rad).

РНК-секвениране

Изрязаните тумори се поставят в буфер RLT (Qiagen) и механично се хомогенизират с gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec, Glad bach, Германия) с помощта на gentleMACS M Tubes (Miltenyi Biotec, Gladbach, Германия). Общата РНК екстракция се извършва с RNeasy Plus Mini kit (Qiagen), следвайки инструкциите на производителя. Количественото определяне на РНК беше извършено с помощта както на NanoDrop 2000/2000c спектрофотометри (ThermoFisher), така и на Qubit RNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher). Целостта на РНК беше оценена с помощта на Agilent RNA 6000 Pico Kit на Agilent Bioanalyzer и всички проби с число за интегритет на РНК (RIN) по-ниско от 6,00 бяха изключени. Подготовката на библиотеката се извършва с помощта на TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold Kit (Illumina) съгласно инструкциите на производителя, с първоначално въвеждане от 500 ng обща РНК. Качеството на библиотеката беше оценено с помощта на комплект Agilent DNA 7500 на Agilent Bioanalyzer, последвано от количествено определяне на библиотеката с помощта на 1X dsDNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher). Библиотеките бяха секвенирани на NextSeq 550 система за секвениране (Illumina), използвайки NextSeq 500/550 v2.5 (150 цикъла) комплекти реагенти с висока изходна мощност (Illumina). Пробите бяха извършени с конфигурация 2 × 76 bp.

Количествено определяне на иРНК и транскриптомични анализи

Salmon (v. 1.5.1) в базиран на картографиране режим беше използван за извършване на количествено определяне на транскриптите и референтния транскриптом GRCm38.98 на mus musculus. Получените qf файлове бяха анализирани от статистическия език R. Пакетът tximport беше използван за импортиране на данните в R, а транскриптите бяха свити върху гени от пакета AnnotationDbi и базата данни org.Mm.eg.db. Накрая извършихме статистическите анализи с DESeq2. Извършихме анализ на свръхобогатяване (ORA), като използвахме пакета ClusterProfiler, за да отправим запитване към базата данни GO: BP, с получените статистически анализи, за да открием променени клетъчни пътища. За да изберем гените за анализа на обогатяване, задаваме прага на log2FC на 0.5 (| log2FC|⋝ 0.5) и коригираната p-стойност на 0.{ {17}}5. След филтриране на резултатите с p-стойност от 0,05 ние извлякохме 45 статистически дерегулирани процеса сред 15158 тествани спрямо базата данни GO: BP.

Количествено определяне на цитокини Luminex

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Мишките бяха умъртвени след 2 дни лечение (Т2) с носител, SR59230A, PD-L1 и SR59230A + PD-L1 и туморната маса беше изрязана с ножица и хомогенизирана с помощта на комплекта за лизис Bio-Plex Cell (BIO-RAD, Калифорния , САЩ) и gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec, Германия). След това туморните лизати бяха тествани за техните концентрации на цитокини чрез Bio-Plex Pro™ анализи (BIO-RAD, Калифорния, САЩ) на базата на Luminex xMAP технология. Нива на IFN-, TNF-, IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IL-1 и IL-1 (pg/ml ) са измерени съгласно инструкциите на производителя. Данните бяха получени на системата MAGPIX (Luminex, Тексас, САЩ) и анализът беше извършен с помощта на софтуера Bio-Plex Manager™ (BIO-RAD, Калифорния, САЩ).

Поточен цитометричен анализ

Беше извършен анализ на поточна цитометрия върху туморни клетки и имунни клетъчни субпопулации на туморната микросреда, както следва. Накратко, туморите се хомогенизират с мишка Tumor dissociation kit (#130-096-730, Miltenyi Biotec) и тумор-инфилтриращите лимфоцити се изолират от общата клетъчна суспензия с помощта на CD45 (TIL) MicroBeads мишка (#130-110- 618, Miltenyi Biotec) или CD8 (TIL) MicroBeads мишка (#130-116-478, Miltenyi Biotec) през автоматичния Pro Separator (Miltenyi Biotec) съгласно инструкциите на производителя. След това клетките се инкубират и оцветяват с различни подходящо разредени комбинации от различни флуорохром-конюгирани антитела (допълнителна таблица 1). Оцветените клетки бяха анализирани с помощта на проточен цитометър MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec®) и данните бяха обработени с помощта на софтуер Flowlogic (Miltenyi Biotec®).

Имунофлуоресценция на клетки и тъкани

Имунофлуоресцентен анализ на миша туморна маса се извършва както следва. Пробите се изрязват бързо, фиксират се в буфериран 4% формалдехид за 24 часа и се поставят в парафин. Хистологични срезове с дебелина 5 μm се изрязват от пробите, депарафинизират се и се варят в продължение на 1 0 минути в натриев цитратен буфер (10 mM, pH 6.0; Bio-Optica) за извличане на антиген и се имунооцветяват за една нощ при 4 градуса с първично антитела (анти-PD-L1, ab238697, Abcam; анти- 3-AR, ab94506, Abcam; анти-CD4, 14-9766-82, eBioscience; анти-CD8, 14-0808-82, eBioscience; DBH, ab209487, Abcam). Имунна реакция беше открита при инкубиране на срезове с вторични антитела Alexa Fluor 488- конюгирани IgG или Alexa Fluor 594-конюгирани IgG (1:350; Jackson Laboratory). След обратно оцветяване с 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), представителни изображения бяха получени от микроскоп Olympus BX63, свързан с CellSens Dimension Imaging Software версия 1.6 (Olympus). Имунофлуоресцентното оцветяване се оценява чрез софтуера ImageJ (NIH, САЩ), тъй като интензитетът на флуоресценция на интересуващия ни протеин се нормализира към стойностите на DAPI.

Ползи от cistanche tubulosa-антитуморен

Kaplan-Meier и генен корелационен анализ при пациенти с NB

Корелация на гена ADRB3 с гените на имунната контролна точка на CD80, CTLA4, CD276, CD226, CD40LG, 4-1BBL и корелация между общата (OS) и вероятността за преживяемост без събития (EFS) на пациенти с NB и нивата на ARDB3 Експресията на иРНК се извършва с помощта на профила на генна експресия на 649 NB проби, генерирани с помощта на 44 К олигонуклеотидни микрочипове. Профилите и клиничните данни бяха извлечени от R2: платформа за геномен анализ и визуализация (http://r2.amc.nl), (Kocak, потребителски ag44kcwolf, n=649 случая). Последният квартил на разпределението беше използван като гранична стойност на експресията за висока спрямо ниска експресия на ADRB3 ген в анализа на Kaplan-Meier.

Статистика

Статистическият анализ беше извършен с помощта на GraphPad Prism (GraphPad, Сан Диего, Калифорния, САЩ) чрез еднопосочен или двупосочен анализ на дисперсията (ANOVA), последван от пост-хок теста на Bonferroni или несдвоен студентски t-тест. За in vivo експериментите, според предишни проучвания върху същия животински модел [12], са необходими поне 6 мишки на група, за да се гарантира мощност от 80%. Стойностите са представени като средна стойност ± SEM. Значимостта беше взета предвид, когато P беше<0.05 and described in each figure legend. Allocation concealment was performed using a randomization procedure (http:// www.randomizer.org/).

РЕЗУЛТАТИ

3-AR антагонизмът намалява експресията на PD-L1 в туморни клетки на A/J мишки, носещи NB

Скорошни проучвания показват, че сигнализирането на PD-1/PD-L1 в NB представлява решаващ механизъм за ограничаване на имунното наблюдение и че експресията на PD-L1 корелира с високи нива на туморни маркери [15, 16]. Вземайки предвид тези и нашите предишни данни, показващи способността на блокадата на 3-AR да предизвика имунокомпетентен TME при мишки, носещи меланом [13], ние се чудехме дали при NB тумор 3-AR антагонизмът може да доведе до активиране на имунния отговор в зависимост от участието на PD-L1 сигнализиране. Приложението на 3-AR антагониста, SR59230A, в миши сингенен модел на NB, намалява растежа на тумора в по-голяма степен, отколкото лечението с анти-PD-L1 антитяло mAb (PD-L1), но не се наблюдава синергичен ефект когато мишките са третирани и с двете лекарства (фиг. 1A, B). За да изследваме дали антитуморният ефект, предизвикан от приложението на SR59230A, разчита отчасти на модулацията на експресията на PD-L1, ние анализирахме нивото на експресия на PD-L1 в TME на мишки, носещи NB. Интересно е, че имунофлуоресценция (Фиг. 1C) и Western blot анализ (Фиг. 1D) върху миша туморна маса показват, че експресията на PD-L1 е намалена в TME на мишки, третирани с 3-AR антагониста в сравнение със състоянието на носителя. Тъй като обширните литературни данни показват, че при TME, в допълнение към раковите клетки, стромалните клетки като антиген-представящите клетки (APCs) MDSC, DCs и макрофагите са основните източници на PD-L1 [17–20], ние допълнително изследва къде в TME нивото на експресия на PD-L1 е засегнато след 3-AR блокада. Цитофлуорометричният анализ разкрива, че 3-AR антагонизмът намалява експресията на PD-L1 в туморните клетки (Фиг. 1E), като същевременно повишава нивото на експресия в DCs и макрофагите (Фиг. 1F, G). Не са наблюдавани промени в популацията на MDSC (фиг. 1H). Тези първи резултати показват, че 3-AR блокадата проявява значителна антитуморна активност в сингенен модел на мишки, носещи NB и че едновременното прилагане на PDL1 антитяло не предизвиква антитуморен синергичен ефект. Интересно е, че фармакологичният антагонизъм на 3-AR модулира нивото на експресия на PDL1 в TME, което предполага участието на PD-L1 сигнализиране в антитуморното действие, предизвикано от блокадата на 3-AR.

Фиг. 1 Ефект на третирането с SR59230A и PD-L1 върху растежа на тумора и експресията на PD-L1 в NB мишки, носещи тумор

3-AR антагонизмът и приложението на PD-L1 стимулират имунно-реактивен TME при NB

За да изследваме дали намалената експресия на PD-L1, наблюдавана в NB туморни клетки след 3-AR антагонизъм, води до имунна реактивация в TME, ние първо оценихме броя на перфорин от PD-1+CD{ {4}} клетки в туморна маса на SR59230A-, PD-L1- или SR59203A + PD-L1-третирани мишки в сравнение с носител (фиг. 4A, B). Освен това, тест за оцветяване с Ki67 показа тенденция, показваща повишена пролиферация на CD8+ Т клетки в NB тумори на мишки, третирани с 3-AR антагонист или PD-L1 антитяло, дори ако не успя да достигне значителни разлики (фиг. 4C). И накрая, измерването на цитокини показа в туморната маса на мишки, третирани с PDL1-, повишено ниво на цитокини, за които е известно, че упражняват антитуморни действия като TNF-, IFN- и IL-6, и съпътстващо намаляване на имуносупресиращия цитокин IL-10. Изненадващо, при мишки, носещи NB, третирани с 3-AR антагониста, наблюдавахме повишаване на TNF- и IL-6 и намаляване на нивата на IL-10, според имунната реактивен статус, предполаган от характеристиките на Т клетките, но понижено ниво на IFN- (фиг. 4D). Не са открити значителни разлики в други анализирани цитокини (GMCSF, IL-2, IL-1 и IL-1). Заедно тези данни показват, че 3-AR антагонизмът задейства имунния отговор на гостоприемника в TME на мишки, носещи NB, проследявайки същите ефекти, наблюдавани след прилагане на PD-L1 антитяло. По-специално, цитотоксичните функции на CD8+ бяха подсилени както от SR59230A, така и от PD-L1. Не са наблюдавани синергични ефекти, когато 3-AR антагонистът се прилага едновременно с PD-L1 антитялото, потвърждавайки, че имунната реактивация, предизвикана от 3-AR блокадата, разчита, поне отчасти, на PD-L1 сигнализирането участие на пътя.

Фиг. 2 SR59230A и PD-L1 стимулират имунно-реактивен TME при NB

Фиг. 3 Експресия на имунни контролни точки върху лимфоцити в TME и TDLNs след 3-AR антагонизъм и прилагане на PD-L1

Фиг. 4 3-Блокирането на AR задейства функциите на CD8 и регулира секрецията на имунни цитокини при ТМЕ.

3-AR върху инфилтриращите тумор лимфоцити модулира секрецията на IFN и повлиява експресията на PD-L1 върху NB туморни клетки

Експресията на PD-L1 върху туморни клетки може да бъде предизвикана от няколко фактора, но наред с други, TNF- и IFN- представляват основните цитокини, способни да повишат нивата на PD-L1 в различни тумори [23]. За по-нататъшно изясняване на сигнализирането, лежащо в основата на 3-AR/PD-L1 кръстосания разговор в нашия туморен модел на NB, ние първо анализирахме in vitro експресията на PD-L1 върху N2A туморни клетки след лечение с TNF- и IFN-. Резултатите показват, че експресията на PD-L1 е регулирана нагоре в NB клетки, третирани в продължение на 48 часа с IFN-, но не и с TNF-. Освен това, предварителното третиране на N2A туморни клетки с 3-AR антагониста SR59230A не е в състояние да отмени повишената експресия на PDL1, предизвикана от лечението с IFN (фиг. 5A). Като се има предвид, че литературните данни разпознават TIL като основен клетъчен източник на IFN- по време на адаптивен имунен отговор [24] и че нашите резултати разкриват, че 3-AR модулацията върху N2A туморни клетки не повлиява IFN- -зависимата PD -L1 експресия, ние се чудехме дали 3-AR модулация на TILs е отговорна за променена IFN-секреция, която от своя страна повлиява експресията на PD-L1 върху туморни клетки. За да докажем нашата хипотеза, лимфоцити, получени от TDLNs на мишки, носещи NB, третирани с носител или SR59230A, бяха изолирани и съвместно култивирани in vitro с туморни клетки. Имунофлуоресцентният и поточният цитометричен анализ потвърждават, че лимфоцитите, събрани от мишки, носещи NB, третирани с 3- AR антагониста, намаляват способността си да задействат експресията на PD-L1 върху N2A клетки в сравнение с нетретираните лимфоцити (Фиг. 5B, D). Освен това, измерването на нивото на IFN в среда за съвместно култивиране потвърди, че лимфоцитите, събрани от мишки, третирани с SR50230A, частично губят способността си да секретират IFN-, когато се култивират съвместно с NB туморни клетки (Фиг. 5C). Вече е показано, че 3-AR може да бъде свързан с Gs протеин в няколко тъкани и неговото активиране води до активиране на cAMP/PKA сигнален път [25]. В същото време проучвания доказаха критичната роля на свързването на отговорния елемент на цикличния AMP (CREB) като положителен транскрипционен регулатор на IFN- в Т клетки [25–27]. Започвайки от тези наблюдения, ние анализирахме дали сигналният път на cAMP/PKA/CREB е включен в 3-AR-зависимата IFN-секреция в TILs. Резултатите показват, че 3-AR антагонизмът на CD8+ TIL намалява фосфорилирането на PKA /PKA субединици и на CREB, което води до намаляване на експресията на IFN в CD8+ TIL (допълнителна фигура 1A). , B). Тези резултати потвърдиха, че 3-AR е в състояние да поддържа IFN-транскрипцията в TILs на NB чрез задействане на cAMP/PKA/CREB сигнален път. От друга страна, имуносупресивният цитокин IL-10 е намален в Treg на мишки, третирани със SR59230A в сравнение с носител (допълнителна фигура 1C), потвърждавайки имунната реактивност на NB TME след лечение с 3-AR антагонист на мишки, носещи NB. За да потвърдим селективния ефект на антагонизма на SR59230A върху подтипа 3-AR, ние извършихме анализ на съвместна култура с лимфоцити, заглушени с siPHKs за 1-, 2- и 3-AR подтипове. Резултатите показват, че лимфоцитите, заглушени за 3-AR, сред подтиповете -AR, частично са загубили способността си да индуцират експресия на PD-L1 върху N2A туморни клетки в сравнение с контролното състояние (Фиг. 5E и Допълнителна Фигура 1D). Освен това, протеиновата експресия на 3-AR върху миши лимфоцити на мишки, носещи NB, беше потвърдена чрез Western blot анализ на лимфоцити, получени от TDLNs (допълнителна фигура 2A) и имунофлуоресценция на CD4+ и CD{{ 90}} Т клетки, оцветени за 3-AR върху срезове от туморна маса (допълнителна фигура 2B). По-рано демонстрирахме, че специфичният антагонизъм на 3- AR върху N2A туморни клетки от SR59230A, инхибира растежа на NB и прогресията на тумора, чрез преминаване от стволови към диференциационни характеристики на туморните клетки [12]. Тук нашите резултати намекнаха, че антитуморният ефект от приложението на 3-AR антагонист разчита също на 3-AR сигнализиращата модулация върху TILs, което на свой ред доведе до възстановяване на имунните отговори срещу тумори. Следователно, за да потвърдим нашата теза in vivo, ние приложихме FTY720, за да ограничим Т клетките в TDLN и да намалим тяхната инфилтрация в туморна маса. FTY720 е аналог на сфингозин 1-фосфат (S1P) и приложението му индуцира интернализацията и разграждането на S1P рецептора, като по този начин предотвратява излизането на лимфоцитите от лимфните възли [28]. Както се предполага, предварителното третиране с FTY720 намалява антитуморния ефект, предизвикан от прилагането на 3-AR антагонист (фиг. 5F–H). За да потвърдим ефективността на FTY720 за ограничаване на Т клетките в TDLNs, ние измерихме броя на Т клетките в TDLNs след осем дни (T8) лечение. Резултатите показват, че както CD4+, така и CD8+ клетките са увеличени в TDLNs на мишки, предварително третирани с FTY720, в сравнение с нетретирани мишки (носител) (допълнителна фигура 2C). Според нашите и други предишни резултати, демонстриращи, че S1P сигнализирането е от решаващо значение за оцеляването на NB туморни клетки [12, 29], лечението само с FTY720 също е в състояние значително да намали растежа на тумора (фиг. 5F-H). Анализът на РНК секвениране върху NB туморни маси, изолирани от мишки, третирани с носител и SR59230A, идентифицира 5607 гена, сред които 267 са диференциално експресирани гени (DEGs), 127 са регулирани нагоре и 140 са регулирани надолу в тумори, третирани със SR59230A (Фигура 6А). По-специално, няколко гена, които са статистически диференциално експресирани, принадлежат към имуно-свързани пътища според GO: BP база данни (фиг. 6B). Нещо повече, регулирането надолу на PD-L1 иРНК (CD274 ген) в тумор, третиран със SR59230A, в сравнение със състоянието на носител и регулирането нагоре на различни други гени, участващи в свързани с имунитета процеси (фиг. 6C) потвърждава корелацията между 3-AR и имунната контролна точка PD-L1, наблюдавана на ниво протеин. И накрая, диференциален анализ на генна експресия върху публичен набор от данни (GSE14880 от GEO архив), състоящ се от 34 пациенти, засегнати от NBs, потвърди, че NB туморни маси с ниска експресия на ADRB3 показват положителна регулация на имунните отговори, активирането на Т клетките и имунния ефектор пътища в сравнение с туморна маса с високи нива на ADRB3 (фиг. 6D). Трябва да се отбележи, че докато при различните видове рак катехоламините се освобождават през неврони, свързани с рака, или просто достигат до тумора чрез кръвообращението, в NB прекомерните нива на катехоламини и техните метаболити (HVA, VMA, допамин), уникална характеристика на това злокачествено заболяване, произхождат от различен източник. В действителност, поради особения произход на NB клетките (от дефектни симпатикови невронални диференциращи клетки на невроналния гребен), тези тумори обикновено са способни да отделят катехоламини сами. Наистина, в нашия NB миши модел, имунофлуоресценцията върху туморни маси показа, че NB туморните клетки са положителни за допамин-хидроксилазата (DBH) (допълнителна фигура 3A), ензим, отговорен за синтеза на норепинефрин, независимо от 3- AR експресия върху тумор или негов антагонизъм. Взети заедно, тези данни подчертават решаващата роля, която играе адренергичната сигнализация в регулирането на различни биологични процеси, включени във взаимодействието между имунната система на гостоприемника и туморната микросреда в NB тумори. Антитуморните ефекти, наблюдавани след прилагане на 3-AR антагонист в нашия миши сингенен модел, разчитат, поне отчасти, на модулацията на 3-AR, експресиран върху лимфоцити, инфилтриращи туморната маса. По-специално, ние демонстрирахме, че селективната блокада на 3-AR върху TIL намалява секрецията на IFN, което от своя страна намалява експресията на PD-L1 върху NB туморни клетки, насърчавайки имунно-реактивен TME.

Фиг. 5 3-AR върху TILs поддържа IFN- -зависима експресия на PD-L1 в NB туморни клетки. А

Генната експресия на ADRB3 корелира с лоша прогноза при пациенти с NB

Някои проучвания предполагат, че {{0}}AR иРНК и/или протеинът са свръхекспресирани и в някои случаи корелират с неопластична пролиферация и трансформация при различни видове рак при хора [10, 30–32]. Съответно, нашите предклинични резултати, получени в сингенен миши модел на NB, показаха, че 3-AR сигнализирането може да поддържа различни протуморни процеси, благоприятстващи туморния растеж. Ето защо, за да проверим дали генната експресия на ADRB3 корелира с преживяемостта на пациентите с NB, извършихме анализ на Kaplan-Meier чрез R2: Genomics Analysis and Visualization Platform (http://r2.amc.nl), използвайки базата данни Kocak, която включва пълна информация за клиничните данни на 649 пациенти с NB. Резултатите показват, че експресията на ADRB3 ген е свързана с лоши резултати при пациенти с NB. Високата експресия на гена ADRB3 наистина беше значително свързана с намалена преживяемост без събития (p=3.2e−05) (Фиг. 7A) и обща преживяемост (p=8.4e−0.5) ( Фиг. 7B) на пациенти с NB. Освен това, анализ на генна корелация в някои кохорти показа положителна корелация между ADRB3 и гени за инхибиторни имунни контролни точки, като CD80, CTLA4 и CD276, и отрицателна корелация с гени за имунни контролни точки, активиращи имунната система, като CD266, CD40 лиганд (CD40LG) и 4-1BB лиганд (4-1BBL) (Фиг. 7C). Като цяло, получените данни подчертават отрицателната корелация на експресията на гена ADRB3 с изхода на пациенти с NB и потвърждават и засилват ролята на 3-AR като молекулярен играч, способен да потиска антитуморните имунни отговори чрез засягане на множество имунни контролни точки сигнални пътища.

ДИСКУСИЯ

Тъй като има особен неврогенен произход, високите нива на метаболити на катехоламини характеризират NB туморното състояние [7, 33]. В предишна работа спекулирахме, че освобождаването на катехоламин в TME може да се насочи към раковите клетки чрез активирането на -ARs, задействайки цикъл на растеж и злокачествено заболяване при NB рак. Наистина, експериментални данни показват, че 3-AR се експресира върху различни NB туморни клетъчни линии и биопсии от пациенти и че неговата модулация значително повлиява туморния растеж в сингенен миши модел на NB [12]. В допълнение към експресията на -ARs върху туморни клетки, широко известно е, че -ARs са разположени на повърхността на повечето клетки в TME, включително имунни клетки, и че лигирането на катехоламини към -ARs в имунните клетки регулира както вродения, така и адаптивния имунитет [34]. Трябва да се отбележи, че докато при физиологични условия модулирането на имунната система чрез -адренергично сигнализиране насърчава нормалния имунен отговор, при променени процеси, SNS/катехоламини/-ARs-удължената стимулация може да има вредни ефекти върху различни имунни клетки, включително лимфоцити [35, 36 ]. При тези променени условия, продължително стимулиране на адренергичното сигнализиране насърчава патологичните процеси и, наред с други, прогресията на рака [37]. Започвайки от гореспоменатите наблюдения, нашето проучване има за цел да проучи дали антитуморните ефекти, предизвикани от 3-AR антагонизма в NB тумори, могат отчасти да разчитат на възстановяването на антитуморния имунитет и дали това може да включва модулирането на сигналните пътища на имунните контролни точки. Предклиничните проучвания предполагат, че експресията на PD-L1 в метастатичен NB представлява решаващ механизъм за ограничаване на имунния надзор [15] и че комбинираната имунотерапия с анти-PD-L1/PD-1 и анти-CD4 антитела лекува сингенен дисеминиран NB [ 38]. Наскоро експресията на PD-L1 беше оценена в няколко педиатрични тумора и преди всичко оцветяването с PD-L1 беше свързано с по-ниска преживяемост сред пациентите с NB [16, 39]. Освен това беше показано, че PD-L1-позитивните тумори са локализирани в надбъбречната жлеза по-често отколкото PD-L1-отрицателните тумори и че катехоламиновите метаболити (NSE, VMA и HVA) са склонни да бъдат по-висока в PD-L1-позитивната група, отколкото в PD-L1-отрицателната група [16].

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Тези доказателства предполагат способността на сигналната ос PD-1/PD-L1 да контролира имунното избягване на тумора при първичен и метастатичен NB, но те не изследват точните механизми, лежащи в основата на PD-1/PD- L1 регулиране на сигнализацията. За да проучим дали 3-AR модулацията може да повлияе на експресията на PD-L1 в NB и последващата имунна реактивност в TME, ние третирахме A/J мишки, инокулирани със сингенни N2A NB клетки, с 3- AR антагонист SR59230A, PD-L1 моноклонално антитяло (PD-L1) или тяхна комбинация. Първо, ние наблюдавахме, че 3-AR антагонизмът е в състояние да намали растежа на NB тумор и същевременно да намали експресията на PD-L1 в TME на мишки, носещи NB. Проточната цитометрия разкри, че намаленото количество PD-L1, наблюдавано в туморната маса на третирани с SR59230A мишки, отразява най-вече намалената експресия на туморни клетки. В рязък контраст, експресията на PD-L1 върху DCs и макрофаги беше регулирана нагоре. Няколко научни доказателства приписват на PD-L1, локализиран както върху туморните клетки, така и върху APC, способността да потискат активирането на Т клетките, частично възпрепятствайки ефективната имунна реакция срещу тумора [40]. Въпреки това, скорошни проучвания показват, че по време на поглъщането на антиген и кръстосаното представяне на туморни антигени към Т клетките, решаваща стъпка в адаптивния имунитет, DC и макрофагите регулират нагоре PD-L1, като по този начин ограничават прекомерното активиране на Т клетките и ги защитават от цитотоксични активности на Т клетки [41, 42]. Следователно, ние предположихме, че намалената експресия на PD-L1 върху туморни клетки и съпътстващото му увеличение на APCs в третирана с SR59230A туморна маса вероятно отразяват възстановяване на имунната система в TME. Резултатите потвърждават увеличения брой инфилтриращи тумора имунно-реактивни клетки (NK, DCs и CD8+) и намаляване на туморно-инфилтриращите имуносупресивни клетки (Treg и MDSC). Анализът на експресията на имунната контролна точка PD-1 върху TILs показа значително увеличен брой PD-1+CD4+ и PD- 1+CD8+ Т клетки в TDLNs при ранен стадий на развитие на тумор (T2) и на PD-1+CD8+ в тумора след 8 дни (T8) на SR59230A, PD-L1 или тяхното комбинирано лечение в сравнение с контролата. Нарастващата тенденция беше отбелязана и в броя на CD4+ Т клетките, оцветени за TIM3 или LAG3 в тумори на SR59230A, PD-L1 лечения и тяхната комбинация, но те не успяха да достигнат статистическа значимост. За CD8+ Т клетки, оцветени за TIM3 или LAG3, вместо това наблюдавахме голяма променливост. Докато някои литературни данни предполагат, че PD-1, LAG-3 и TIM-3 експресиращи Т клетки са изтощени и дисфункционални [43–45], други показват, че тези имунни контролни точки, по-специално PD -1, също се регулират нагоре след активиране и ефекторна Т-клетъчна диференциация [46–48] и следователно експресията сама по себе си не отразява изтощен статус, по-скоро тези маркери идентифицират автоложния тумор-реактивен репертоар, инфилтриращ различни тумори [46– 49]. Съгласно по-задълбочените изследвания на нашия туморен модел потвърдиха, че 3-AR антагонизмът, тъй като лечението с анти-PD-L1 mAb, задейства цитотоксични функции на CD8+, както се вижда от увеличения брой PD 1+CD8+ клетки, оцветени за перфорин или гранзим B, потвърждаващи, че PD1+ TIL, намерени в туморна маса, са функционално активни. Доказано е, че високата инфилтрация на CD8+ цитотоксични Т клетки в тумора корелира с положителна прогноза при пациенти с няколко злокачествени заболявания, включително меланом, рак на главата и шията, рак на гърдата, колоректален рак, рак на яйчниците, простатата и други [50]. В NB, скорошно проучване показа, че тумори, обогатени с тумор-инфилтриращи Т клетки, имат по-добър клиничен резултат, независимо от други текущи показатели, приети за стадиране на тумора [51]. Освен това, скорошни открития показват, че присъствието на DC и NK клетки в туморната маса е положително свързано както с Т-клетъчната инфилтрация, така и с положителния клиничен резултат при пациенти с NB [52]. Всички тези клинични доказателства са в съответствие с нашите предклинични резултати, при които TME, обогатен на NK, DC и CD8+ Т клетки, наблюдаван след 3- AR антагонизъм или приложение на PD-L1, е функционално способен да контрол на NB туморния растеж. Основен аспект на предизвикателството на имунната система на гостоприемника срещу тумори е освобождаването на различни цитокини в ТМЕ, които могат да поддържат или отслабват антитуморните дейности. Измерването на цитокините в тумора потвърди при мишки, третирани със SR59230A и PD-L1-, състояние, изместено към имунно-реактивна ТМЕ. Въпреки това, докато сред антитуморните цитокини нивата на TNF- и IL-6 се повишават, нивото на IFN- спада в туморната маса на мишки, третирани с 3-AR антагонист. Започвайки от това наблюдение, ние предположихме, че модулирането на 3-AR сигнализирането върху тумор-инфилтриращите Т клетки, по-специално върху CD4+ и CD8+, може да бъде отговорно за променен IFN- секреция, което от своя страна повлиява експресията на PD-L1 върху туморни клетки. Резултатите потвърдиха нашата хипотеза. Селективният 3-AR антагонизъм върху TIL наистина прави тези клетки неефективни при индуциране на експресията на PD-L1 върху NB туморни клетки поради променена секреция на IFN- и де факто предотвратява установяването на адаптивна имунна резистентност. В TME, IFN-оркестрира както протуморогенните, така и антитуморните имунни отговори, действайки като цитотоксичен цитокин заедно с гранзим В и перфорин, за да удря туморните клетки, но също така задейства синтеза на инхибиторни имунни контролни точки, като по този начин стимулира имуносупресивните механизми [53]. Тази бимодална роля на IFN- в причиняването на противоположни ефекти зависи от сложни механизми, които все още не са напълно разбрани, но количеството секретиран IFN изглежда е решаващо при определяне на действията, предизвикани от този цитокин [54]. Съответно, ние предполагаме, че в нашия модел намаленото количество IFN-, донесено от 3- AR антагонизма върху TILs, благоприятства имунните отговори в сравнение с контролното състояние, при което хроничното излагане на IFN- предизвиква повече имуносупресивни механизми. Сред подтиповете -AR, 2-AR изглежда е най-експресираният на повърхността на различни имунни клетки. Все пак трябва да се отбележи, че 3-AR, последният идентифициран член на -ARs, е най-слабо проучен до момента. Следователно, за да потвърдим, че прилагането на SR59230A е довело до ефектите му, блокирайки главно подтипа 3-AR, първо изследвахме и потвърдихме експресията на 3-AR протеин върху лимфоцитите на TDLN и върху инфилтриращите тумор Т клетки. Демонстрирахме експресията на 3-AR протеина в тумор-инфилтриращ CD4+ и CD8+, а след това чрез селективни 1-, 2- и {{ 140}}заглушаване на AR, ние потвърдихме важната роля на подтипа 3-AR, разположен върху лимфоцити, за контролиране на IFN- -зависимата експресия на PD-L1 върху NB туморни клетки. Трябва да се отбележи, че обширни данни за различни тъкани и клетъчни модели показват, че докато 1- и 2-AR са по-склонни към феномена на хомоложна десенсибилизация след продължително излагане на ендогенни катехоламини, {{147} Доказано е, че подтипът }AR не е и когато въпреки това в някои клетки настъпи десенсибилизация на 3-ARs, тя беше по-слабо изразена в сравнение с тази на 1- и 2-ARs [ 55]. След това спекулираме, че при NB тумор, състояние, характеризиращо се с хронично излагане на катехоламини, подтипът 2-AR на TILs, най-изразеният физиологично, може да претърпи понижена регулация след десенсибилизация и обратното 3-AR печели основна роля в медиирането на предизвиканите от катехоламини протуморни ефекти. За да изследваме при хора протуморната склонност на 3- AR експресията, най-накрая извършихме генетичен анализ на 649 NB пациенти, използвайки R2 с отворен достъп: Genomics Analysis and Visualization Platform. Високата експресия на ген ADRB3 корелира с най-лошия клиничен резултат (обща преживяемост и преживяемост без събития) на пациенти с NB в сравнение с по-ниската експресия; освен това, положителната корелация на ген ADRB3 с различни имуносупресивни контролни точки като CD80, CTLA4 и B7-H3 (CD276) и отрицателната корелация с имуноактивиращи контролни точки като CD266, CD40LG и 4-1 BBL потвърди отрицателната роля на 3-AR в сложната регулация на имунната реактивност при NB. По-специално, положителната корелация на експресията на ген ADRB3 с имуносупресивни контролни точки, като CD276, NB-асоциирана молекула, открита в неотговарящи варианти на NB, която упражнява защитна роля от медииран от NK клетки лизис [56, 57], или с CTLA4, чието инхибиране е доказано, че не е излишно при усилване на убиването на антитуморни Т клетки в NB [58], подчертава способността на 3-AR сигнализирането да поддържа различни механизми, благоприятстващи имунното избягване на тумора. Можем да спекулираме, че корелацията между високата експресия на ген ADRB3 и повишената експресия на различни имунни контролни точки може да разчита на способността на 3-AR да поддържа тези механизми, чието свръхактивиране насърчава появата на туморна резистентност, като хронично излагане на някои про - възпалителни цитокини. Ранните проучвания на инхибирането на контролните точки при NB не винаги са били успешни. По-специално, както в модели на предклинични проучвания, така и при хора, по-добрите отговори, получени в терапевтични стратегии, приемащи множество ICI, предполагат, че насочването към различни имунни контролни точки представлява неизлишен ефективен антитуморен подход при NB [58, 59]. След това насочването към различни имуносупресивни пътища може да представлява най-добрата терапевтична възможност за избягване на резистентност на тумора към едноцелева терапия. Въпреки това, прилагането на множество лекарства винаги е проблематично, поради тежки странични ефекти и токсичност, и не винаги води до желаните резултати. Следователно е необходимо по-задълбочено познаване на молекулярните механизми, включени в регулирането на сложната мрежа на имунния двойник на TME, за разработването на нови имуно-онкологични подходи. В този контекст представените резултати предполагат, че насочването към 3-AR в NB TME може да представлява възможен подход за постигане на множество неизлишни протуморни сигнални пътища. По-специално, като засяга както имунната система на гостоприемника, чрез премахване на бариерата, предизвикана от сътрудничеството на имунните контролни точки, така и пътищата за оцеляване на туморните клетки, 3-AR антагонизмът може да представлява обещаваща стратегия с, надяваме се, терапевтични потенциал за пациенти, засегнати от NB злокачествени заболявания. Все още са необходими повече проучвания за задълбочаване на допълнителни механизми, лежащи в основата на сложното взаимодействие между имунната система на гостоприемника и туморния аналог в NB. Независимо от това, в светлината на това, което наблюдавахме, изследването на -адренергичното сигнализиране в TME на NB тумори заслужава да бъде взето под внимание.

Фиг. 6 Транскриптомични анализи на туморна маса на NB потвърждават важната роля на 3-AR при повлияване на имуносвързани процеси

Фиг. 7 Анализ на преживяемостта на Kaplan-Meier и корелация на имунните контролни точки с експресията на ген ADRB3 при пациенти с NB.

ПРЕПРАТКИ

1. Cheung NK, Dyer MA. Невробластом: биология на развитието, геномика на рака и имунотерапия. Nat Rev рак. 2013; 13: 397-411.

2. Matthay KK, Maris JM, Gudrun S, Nakagawara A, Mackal CL, Diller L, et al. невробластом. Nat Rev Dis Prim. 2016; 2: 16078.

3. Darvin P, Toor SM, Nair SN, Elkord E. Инхибитори на имунни контролни точки: скорошен напредък и потенциални биомаркери. Exp Mol Med. 2018; 50: 1–11.

4. Pardoll DM. Блокадата на имунните контролни точки при имунотерапията на рак. Nat Rev рак. 2012; 12: 252-64.

5. Zou W, Wolchok JD, Chen L. PD-L1 (B7-H1) и PD-1 блокада на пътя за терапия на рак: механизми, биомаркери за реакция и комбинации. Sci Transl Med. 2016;8:328rv4.

6. Коул SW, Sood AK. Молекулярни пътища: бета-адренергично сигнализиране при рак. Clin Cancer Res. 2012; 18: 1201–6.

7. Strenger V, Kerlb R, Dornbusch HJ, Ladenstein R, Ambros PF, Ambros IM, et al. Диагностично и прогностично въздействие на катехоламини в урината при пациенти с невробластом. Детски рак на кръвта. 2007; 48: 504-9.

8. Huang XE, Hamajima N, Saito T, Matsuo K, Mizutani M, Iwata H, et al. Възможна връзка между полиморфизми на бета2- и бета3-адренергични рецепторни гени с предразположеност към рак на гърдата. Рак на гърдата Res. 2001; 3: 264–9.

9. Babol K, Przybylowska K, Lukaszek M, Pertynski T, Blasiak J. Асоциация между Trp64Arg полиморфизма в гена на бета3-адренергичния рецептор и рак на ендометриума и затлъстяване. J Exp Clin Cancer Res. 2004; 23: 669-74.

10. Perrone MG, Notarnicola M, Caruso MG, Tutino V, Scilimati A. Повишаване на бета3-адренергичната рецепторна иРНК при човешки рак на дебелото черво: предварително проучване. Онкология. 2008; 75: 224-9.

11. Magnon C, Hall SJ, Lin J, Xue X, Gerber L, Freedland SJ и др. Развитието на автономните нерви допринася за прогресията на рака на простатата. Наука. 2013;341:1236361.

12. Bruno G, Cencetti F, Pini A, Tondo A, Cuzzubbo D, Fontana F и др. бета3- адренорецепторната блокада намалява туморния растеж и увеличава невронната диференциация при невробластома чрез SK2/S1P2 модулация. Онкоген. 2020; 39: 368-84.

13. Calvani M, Bruno G, Dal Monte M, Nassini R, Fontana F, Casini A, et al. бета3 -адренорецептор като потенциален имуносупресорен агент при меланома. Br J Pharm. 2019; 176: 2509-24.

14. Dal Monte M, Casini G, Filippi L, Nicchia MG, Svelto M, Bagnoli P. Функционално участие на бета3-адренергичните рецептори в растежа и васкуларизацията на меланома. J Mol Med. 2013; 91: 1407–19.

15. Dondero A, Pastorino F, Della Chiesa M, Corrias MV, Morandi F, Pistoia V, et al. Експресията на PDL1 в метастатичен невробластом като допълнителен механизъм за ограничаване на имунното наблюдение. Онкоимунология. 2016; 5: e1064578.

16. Zuo S, Sho M, Sawai T, Kanehiro H, Maeda K, Yoshida M, et al. Потенциална роля на експресията на PD-L1 и тумор-инфилтриращите лимфоцити върху невробластома. Pediatr Surg Int. 2020; 36: 137–43.

17. Keir ME, Butte MJ, Feeman GJ, Sharpe AH. PD-1 и неговите лиганди в толерантност и имунитет. Annu Rev Immunol. 2008; 26: 677-704.

18. Curiel TJ, Wei S, Dong H, Alvarez X, Cheng P, Mottram P, et al. Блокирането на B7-H1 подобрява антитуморния имунитет, медииран от миелоидни дендритни клетки. Nat Med. 2003; 9: 562-7.

19. Wu K, Kryczek I, Cheng L, Zou W, Welling TH. Потискането на клетките на Купфер на CD8+ Т клетки в човешкия хепатоцелуларен карцином се медиира от взаимодействията B7-H1/програмирана смърт-1. Cancer Res. 2009; 69: 8067–75.

20. Kuang DM, Zhao Q, Peng C, Xu J, Zhang JP, Wu C и др. Активираните моноцити в перитуморалната строма на хепатоцелуларен карцином насърчават имунната привилегия и прогресията на заболяването чрез PD-L1. J Exp Med. 2009; 206: 1327–37.

21. Rotte A, Jin JY, Lemaire V. Механичен преглед на имунните контролни точки в подкрепа на рационалния дизайн на техните комбинации в имунотерапията на рак. Ан Онкол. 2018; 29: 71-83.

22. Dammeijer F, van Gulijk M, Mulder EE, Lukkes M, Klaase L, van den Bosch T, et al. Контролната точка PD-1/PD-L1 ограничава Т-клетъчния имунитет в дрениращите тумори лимфни възли. Ракова клетка. 2020; 38: 685-700. e8.

23. Cha JH, Chan LC, Li CW, Hsu JL, Hung MC. Механизми, контролиращи експресията на PD-L1 при рак. Mol Cell. 2019; 76: 359–70.

24. Burke JD, Young HA. IFN-: цитокин в точното време, е на точното място. Semin Immunol. 2019;43:101280.

25. Schena G, Caplan MJ. Всичко, което винаги сте искали да знаете за 3-AR* (* но се страхувате да попитате). клетки. 2019; 8: 357.

26. Liu Y, Guo YL, Zhou SJ, Liu F, Du FJ, Zheng XJ и др. CREB е положителен транскрипционен регулатор на гама интерферон при латентни, но неактивни туберкулозни инфекции. Clin ad Vaccine Immunol. 2010; 17: 1377-80.

27. Samten B, Townsend JC, Weis SE, Bhoumik A, Klucar P, Shams H, et al. CREB, ATF и AP-1 транскрипционните фактори регулират секрецията на IFN-гама от човешки Т клетки в отговор на микобактериален антиген. J Immunol. 2008; 181: 2056-64.

28. Matloubian M, Lo CG, Cinamon G, Lesneski MJ, Xu Y, Brinkmann V, et al. Изходът на лимфоцитите от тимуса и периферните лимфоидни органи зависи от S1P рецептор 1. Природа. 2004; 427: 355-60.

29. Li MH, Hla T, Ferrer F. FTY720 инхибира туморния растеж и засилва туморния супресивен ефект на топотекан при невробластом чрез намеса в сфинголипидния сигнален път. Детски рак на кръвта. 2013; 60: 1418–23.

30. Chisholm KM, Chang KW, Truong MT, Kwok S, West RB, Heerema-McKenney AE. експресия на бета-адренергичен рецептор в съдови тумори. Мод Патол. 2012; 25: 1446–51.

31. Montoya A, Amaya CN, Belmont A, Diab N, Trevino R, Villanueva G, et al. Употребата на неселективни бета-блокери е свързана с намалени туморни пролиферативни индекси при ранен стадий на рак на гърдата. Oncotarget. 2017; 8: 6446-60.

32. Rains SL, Amaya CN, Bryan BA. Бета-адренергичните рецептори се експресират при различни видове рак. Онкознание. 2017; 4: 95-105.

33. Verly IR, van Kuilenburg ABP, Abeling NGGM, Goorden SMI, Fiocco M, Vaz FM, et al. Профили на катехоламини при диагностициране: Повишена диагностична чувствителност и корелация с биологични и клинични характеристики при пациенти с невробластом. Eur J Рак. 2017; 72: 235-43.

34. Eng JWL, Kokolus KM, Reed CB, Hylander BL, MA WW, Repasky и др. Нервна туморна микросреда: въздействието на адренергичния стрес върху раковите клетки, имуносупресия и имунотерапевтичен отговор. Рак Immunol Immunother. 2014; 63: 1115–28.

35. Dhabhar FS, McEwen BS. Острият стрес се засилва, докато хроничният стрес потиска клетъчно-медиирания имунитет in vivo: потенциална роля за трафика на левкоцити. Имунно поведение на мозъка. 1997; 11: 286-306.

36. Dhabhar FS. Индуцирано от стреса увеличаване на имунната функция - ролята на хормоните на стреса, трафика на левкоцити и цитокините. Имунно поведение на мозъка. 2002; 16: 785-98.

37. Qiao G, Chen M, Bucsek MJ, Repasky EA, Hylander BL. Адренергична сигнализация: целева контролна точка, ограничаваща развитието на антитуморния имунен отговор. Преден имунол. 2018; 9: 164.

38. Rigo V, Emionite L, Daga A, Astigiano S, Corrias MV, Quintarelli C, et al. Комбинираната имунотерапия с анти-PDL{2}}/PD-1 и анти-CD4 антитела лекува сингенен дисеминиран невробластом. Sci Rep. 2017; 7: 14049.

39. Majzner RG, Simon JS, Grosso JF, Martinez D, Pawel BR, Santi M, et al. Оценка на програмираната експресия на смърт-лиганд 1 и свързаните с тумора имунни клетки в педиатрични ракови тъкани. Рак. 2017; 123: 3807–15.

40. Gibbons Johnson RM, Dong H. Функционална експресия на лиганд на програмирана смърт 1 (B7-H1) от имунни клетки и туморни клетки. Преден имунол. 2017; 8: 961.

41. Peng Q, Qiu X, Zhang Z, Zhang S, Zhang Y, Liang Y и др. PD-L1 върху дендритни клетки отслабва активирането на Т клетките и регулира отговора на блокадата на имунната контролна точка. Nat Commun. 2020; 11: 4835.

42. Singhal S, Stadanlick J, Annunziata MJ, Rao AS, Bhojnagarwala PS, O'Brien S, et al. Свързани с човешки тумори моноцити/макрофаги и тяхната регулация на Т-клетъчните отговори в ранен стадий на рак на белия дроб. Sci Transl Med. 2019;11:eaat1500.

43. Blackburn SD, Shin H, Haining WN, Zou T, Workman CJ, Polley A, et al. Корегулация на изтощаването на CD8+ Т клетки от множество инхибиторни рецептори по време на хронична вирусна инфекция. Nat Immunol. 2009; 10: 29-37.

44. Jin HT, Anderson AC, Tan WG, West EE, Ha SJ, Araki K, et al. Сътрудничество на Tim-3 и PD-1 при изчерпване на CD8 Т-клетки по време на хронична вирусна инфекция. Proc Natl Acad Sci САЩ. 2010; 107: 14733-8.

45. Сакуиши К, Апето Л, Съливан Дж.М., Блазар Б.Р., Кучу В.К., Андерсън А.С. Насочване към пътищата на Tim-3 и PD-1 за обръщане на изчерпването на Т клетките и възстановяване на антитуморния имунитет. J Exp Med. 2010; 207: 2187-94.

46. ​​Agata Y, Kawasaki A, Nishimura H, Ishida Y, Tsubata T, Yagita H, et al. Експресия на PD-1 антиген върху повърхността на стимулирани миши Т и В лимфоцити. Int Immunol. 1996; 8: 765-72.

47. Vibhakar R, Juan G, Traganos F, Darzynkiewicz Z, Finger LR. Индуцирана от активиране експресия на човешки програмиран ген за смърт-1 в Т-лимфоцити. Exp Cell Res. 1997; 232: 25-8.

48. Freeman GJ, Long AJ, Iwai Y, Bourque K, Chernova T, Nishimura H, et al. Ангажирането на PD-1 имуноинхибиторния рецептор от нов член на семейството B7 води до отрицателна регулация на активирането на лимфоцитите. J Exp Med. 2000; 192: 1027-34.

49. Gros A, Robbins PF, Yao X, Li YF, Turcotte S, Tran E, et al. PD-1 идентифицира специфичния за пациента CD8(+) тумор-реактивен репертоар, инфилтриращ човешки тумори. J Clin Invest. 2014; 124: 2246-59.

50. Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, Кириловски A, Mlecnik B, Lagorce-Pagès C, et al. Типът, плътността и местоположението на имунните клетки в човешките колоректални тумори предсказват клиничните резултати. Наука. 2006; 313: 1960–4.

51. Mina M, Boldrini R, Citti A, Romania P, D'Alicandro V, De Ioris M, et al. Туморно-инфилтриращите Т-лимфоцити подобряват клиничните резултати от резистентния на терапия невробластом. Онкоимунология. 2015; 4: e1019981.

52. Melaiu O, Chierici M, Lucarini V, Jurman G, Conti LA, De Vito R, et al. Клетъчни и генни сигнатури на туморно-инфилтриращи дендритни клетки и естествени клетки убийци предсказват прогнозата на невробластома. Nat Commun. 2020; 11: 5992.

53. Jorgovanovic D, Song M, Wang L, Zhang Y. Роли на IFN-gamma в туморната прогресия и регресия: преглед. Biomark Res. 2020; 8:49.

54. Zhang J. Ин и Ян взаимодействие на IFN-гама при възпаление и автоимунно заболяване. J Clin Invest. 2007; 117: 871-3.

55. Океке К, Анже С, Бувие М, Мишел МС. Индуцирана от агонисти десенсибилизация на бета3 -адренорецепторите: къде, кога и как? Br J Pharm. 2019; 176: 2539–58.

56. Castriconi R, Dondero A, Augugliaro R, Cantoni C, Carnemolla B, Sementa AR, et al. Идентифициране на 4Ig-B7-H3 като свързана с невробластома молекула, която упражнява защитна роля от медииран от NK клетки лизис. Proc Natl Acad Sci САЩ. 2004; 101: 12640–5.