13-седмично изследване за субхронична токсичност на 2-(l-ментокси)етанол в F344 бъбрек на плъхове

За повече информация:emily.li@wecistanche.com

Такеши Тойода, Кохей Мацушита, Хиротоши Акане, Томоми Морикава и Кумико Огава

1 отдел по патология, Национален институт по здравни науки, 3-25-26 Тономачи, Кавазаки-Ку, Кавазаки 210-9501, Япония

Резюме:

{{0}}(-Ментокси)етанол често се използва като ароматизиращ агент; обаче данните относно токсичността на 2-(I-ментокси)етанол остават ограничени. Проведохме 13-седмично проучване за субхронична токсичност на 2-(I-ментокси)етанол при мъжки и женски плъхове F344 с дози от 0,15.d. или 250 mg/ke телесно тегло (BW ден, приложен перорално hw средно при използване на царевично масло като носител Не са наблюдавани значителни токсикологични промени в общото състояние, телесното тегло или приема на храна в която и да е група.Хематологичната оценка показва намален хемоглобин, хематокрит, среден корпускуларен обем и среден корпускуларен хемоглобин и повишен брой на тромбоцитите в групата мъжки 250 mg/kg Серумната биохимия разкри повишен общ холестерол в групата на 250 mg/kg мъжки и женски плъхове, намалени триглицериди в групата женски 250 mg/kg и повишен общ протеин в групата мъжки 250 mg/kg, което показва ефекти върху липидния метаболизъм и протеиновия синтез.За теглото на органите, абсолютното и относително тегло на черния дроб и надбъбречните жлези са повишени съответно в групата на 250 mg/kg от двата пола и групата на мъжете 250 mg/kg.Хистопатологичен анализ показа хронична нефропатия при мъже 15 mg/kg или по-високи групи, с повишени абсолютни и относителнибъбректежести, както и повишен серумен креатинин в групите мъже 60 и 250 mg/kg. Въпреки това, еозинофилни гранули, съдържащи a,-глобулин, бяха идентифицирани в проксималните тубули, което предполага 2-глобулинова нефропатия, специфична за мъжки плъхове и без токсикологично значение. Тези резултати показват, че нивото на ненаблюдаван неблагоприятен ефект на 2-(-ментокси)етанол е 60 mg/kg BW/ден и за двата пола (DOI; 10.1293tox2020-0091:J Toxicol Patho 1 2021;34:309-317)

Ключови думи:2-(-ментокси )етанол, 2-1-ментоксиетанол,хранадобавка, овкусител, Fischer rat, мент

Цистанче е полезно за бъбреците

Въведение

{{0}}(-Ментокси)етанол (CAS №.38618-23-4) е бистра и безцветна течност с характерна миризма и се използва широко като ароматизиращ агент. Съвместният експертен комитет на ФАО/СЗО по хранителните добавки (JECFA) оцени 2-(1-метокси)етанол като ароматизиращ агент, категоризиран като вещество, структурно свързано с ментола. Въз основа на структурния клас на ароматизаторите, 2-(-метокси)етанолът е причислен към клас I. В Съединените щати и Европа нивата на прием на 2-(I-метокси)етанол от хората са били оценени съответно на 12 ug/човек/ден и 0,01 ug/човек/ден, като и двете са под прага за клас I от 1800 ug/човек/ден. Въз основа на тези оценки се счита, че 2-(1-метокси)етанол може да не представлява проблем за безопасността при рутинна употреба като ароматизиращ агент.

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD.:>2,000 mg/kg телесно тегло [BW)1. Въпреки използването на 2-(1-ментокси)етанол като ароматизиращ агент. налични са ограничени данни относно токсичността при многократно прилагане на това съединение. Нашата лаборатория е изследвала токсичността на няколко хранителни добавки, включително представителни ароматизатори от всяка категория, в модели на гризачи2-7. За да изясним токсикологичния профил и да установим ниво без наблюдавани неблагоприятни ефекти (NOAEL), проведохме 13-седмично проучване за субхронична токсичност на 2-(1-етокси)етанол, което беше перорално приложен на F344 плъхове чрез сонда.

Материали и методи

Тестван химикал

2-(I-Ментокси)етанол (Партида № 510002, чистота 99,9 процента), произведен от Takasago Int. Corp. (Токио, Япония) е осигурено от отдела за стандарти и оценка, отдел за безопасност на храните, Министерство на здравеопазването, труда и социалните грижи, Япония, с подкрепата на Японската асоциация за вкусови и ароматни материали (Токио, Япония). Въпреки че изпитваното вещество е предоставено като смес от оптични изомери (CAS № 38618-23-4), то е потвърдено като 1-енантиомер (CAS № 75443-64-0) ​​от производителя. Орална сонда с царевично масло (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония) като носител беше избрана като път на приложение поради неразтворимостта във вода и летливостта на 2-(1-ментокси)етанол. Разтвори на 2-(1-ментокси)етанол се приготвят всеки ден, непосредствено преди приложение. След съхранение в продължение на 2 часа при стайна температура, остатъчните съотношения на 2-(-ментокси)етанол в 4, 40 и 400 mg/mL разтвор бяха потвърдени като 96,8 процента, 99,8 процента и 96,5 процента, съответно, чрез газова хроматография (Японската инспекционна асоциация на храните и околната среда на хранителната промишленост, Токио, Япония).

Опитни животни

Общо 40 мъжки и 40 женски плъха, свободни от патогени (F344/DuCrlCrlj, 5-седмична възраст) бяха закупени от Charles River Laboratories Japan (Йокохама, Япония) и използвани след аклиматизация за една седмица. По време на изследването животните бяха настанени в поликарбонатни клетки с мека постелка, държани в стая с бариерна система за контрол на цикъла светлина/тъмнина (12 часа), вентилация (скорост на въздухообмен 18 пъти/час), температура (24 ±1 градус) и относителна влажност (55±5 процента). Клетките и постелята с стърготини бяха сменени два пъти седмично. Всяко животно имаше свободен достъп до чешмяна вода и основна диета (CRF-1; ориенталски дрожди, Токио, Япония). В началото на експеримента животните бяха разпределени на случаен принцип в четири групи от по 10 мъжки и женски плъхове, всяка на базата на телесно тегло, измерено непосредствено преди започване на третиране с изпитвания химикал.

Уча дизайн

В предварително {{0}}дневно проучване, оценяващо 2-(1-ментокси)етанол, прилаган в дози от 0.200,400 и 800 mg/kg телесно тегло/ден, абсолютните и относителните тегла на черния дроб са значително повишени във всички третирани групи от двата пола (данните не са показани). Въз основа на тези резултати избрахме дози 2-(-ментокси)етанол от 0,15,60 и 250 mg/kg телесно тегло/ден за прилагане както на мъжки, така и на женски плъхове в настоящето 13- седмично изследване на токсичността.

Общото състояние и смъртността се оценяват ежедневно. Телесните тегла, както и количествата на приетата и остатъчна диета, се измерват веднъж седмично по време на експерименталния период. Всички плъхове бяха гладувани цяла нощ след завършване на лечението и бяха взети кръвни проби за хематология и серумна биохимия от коремната аорта под дълбока инхалационна анестезия с използване на изофлуран. Дизайнът на изследването е в съответствие с Насоките за определяне на хранителни добавки и преразглеждане на стандартите за употреба на хранителни добавки на Япония (1996) и одобрен от Комитета за грижа и използване на животните към Националния институт по здравни науки, Япония.

Хематология и серумна биохимия

Следните хематологични параметри бяха анализирани с помощта на автоматични хематологични анализатори ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, САЩ): брой бели кръвни клетки (WBC), брой червени кръвни клетки (RBC), концентрация на хемоглобин (HGB), хематокрит (HCT). ), среден корпускуларен обем (MCV), среден корпускуларен хемоглобин (MCH),

средна корпускулярна концентрация на хемоглобин (MCHC), брой на тромбоцитите (PLT) и диференциални левкоцитни клетки, включително неутрофили (Neut), лимфоцити (Lymph), моноцити (Mono), еозинофили (Eosino) и базофили (Baso). Серумният биохимичен анализ беше извършен от Oriental Yeast за следните параметри: общ протеин (TP), албумин (Alb), съотношение албумин/глобулин (A/G), общ билирубин (Bil). глюкоза, общ холестерол (T-Chol), триглицериди (TG), уреен азот (BUN), креатинин (Cre), калций (Ca), неорганичен фосфор (IP), натрий (Na), калий (K), хлор (Cl), ас-партат аминотрансфераза (AST), аланин аминотрансфераза (ALT), алкална фосфатаза (ALP) и у-глутамил транс-пептидаза (y-GTP).

Тегла на органи и хистопатологична оценка

За всички животни е извършена пълна аутопсия. и мозъка, тимуса, белите дробове, сърцето, далака,черен дроб, надбъбречнажлези,бъбреци, тестисите и яйчниците бяха претеглени. Тези органи, както и тъкани от гръбначния мозък, тригеминалния нерв, хипофизната жлеза, носната кухина, слюнчените жлези, езика, хранопровода, трахеята, аортата, щитовидната жлеза, паращитовидната жлеза, панкреаса, стомаха, тънките и дебелите черва, субмандибуларната и мезентериалната лимфни възли, вагина, матка, пикочен мехур, простатна жлеза, семенни везикули, епидидимис, бедрена кост и гръдна кост с костен мозък, прешлени, скелетни мускули, седалищен нерв, кожа и млечна жлеза, бяха фиксирани в 10 процента неутрален буфериран формалин; след това се приготвят срезове, включени в парафин и се оцветяват с хематоксилин и еозин за хистопатологично изследване. Тестисите и очите с Хардерови жлези бяха фиксирани съответно във фиксатора на Bouin и разтвора на Davidson. Костните тъкани, включително носната кухина, прешлените, гръдната кост и бедрената кост, бяха декалцифицирани с помощта на смес от 10 процента мравчена киселина и 10 процента буфериран формалин за период до 2 седмици. Извършена е хистопатологична оценка за всички тъкани, получени от животни в контролната група и групата, на която е приложена най-високата доза, освен ако не са наблюдавани лезии, свързани с лечението.

Имунохистохимия за ,-глобулин

При мъжки плъхове, натрупването на a.globulin в бъбрека се изследва чрез имунохистохимичен анализ на срезове, включени в парафин. За извличане на антиген, срезовете, получени от 5 плъха във всяка група, се инкубират с протеиназа К (DAKO, Glostrup, Дания) за 1 минута при стайна температура. Всички срезове се потапят в 3 процента разтвор на Н, О./метанол за 10 минути при стайна температура за инактивиране на ендогенната пероксидазна активност. След блокиране на неспецифичните реакции с 10 процента нормален заешки серум, срезовете се инкубират с първично антитяло за -глобулин (разредено 1:400; анти-плъх, глобулиново антитяло; R&D Systems, Минеаполис, Минесота, САЩ) за една нощ при 4 градуса s Визуализацията на свързването на антитялото се извършва с помощта на Vecta-Stain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, СА, САЩ) и 3,3'-диаминобензидин. Всички срезове бяха насрещно оцветени с хематоксилин.

Статистически анализ

Разликите в стойностите на данните за телесното тегло по време на експерименталния период, както и за хематологията, серумната биохимия и теглото на органите, бяха оценени за хомогенност с помощта на теста на Bartlett. Еднопосочен анализ на дисперсията и съответно тестът на Kruskal-Wallis бяха използвани за хомогенни и хетерогенни данни. При определяне на статистически значими разлики, тестът за множествено сравнение на Dunnett беше използван за сравняване на контролните и третираните групи. Сравненията на хистопатологичните случаи и степени бяха анализирани чрез използване на точния вероятностен тест на Fisher и съответно U/ теста на Mann-W Whitney. P стойности на<0.05 were="" considered="" statistically="">

Резултати

Параметри в живота, хематология и серумна биохимия Не са отбелязани значими клинични признаци през целия експериментален период и всички животни са оцелели до планираната аутопсия. Освен това не са наблюдавани значими разлики в телесното тегло и дневния прием на храна при мъжки и женски плъхове (Фиг. 1А и Б).

Хематологичните и серумните биохимични данни са показани съответно в таблици I и 2. Хематологичните анализи показват значително намалени HGB, HCT, MCV и MCH и повишени PLT при мъжки плъхове, на които са прилагани 250 mg/kg BW/ay 2-(1-ментокси)етанол (Таблица 1). В серумната биохимия, значителни увеличения на TP, T-Chol и Ca и понижения на Bil и ALP са отбелязани при мъже от групата на 250 mg/kg (Таблица 2). Значително увеличение на Cre и понижение на A/G са отбелязани при мъжките от групите 60 и 250 mg/kg. При женските, значително увеличение на Ca и понижение на ALP са регистрирани в групите с 60 и 250 mg/kg, докато повишени T-Chol и намалени A/G, Bil, TG.AST и ALT са открити в 250 mg/kg. кг група.

Въпреки че се наблюдава значително увеличение на TG и понижение на Cl при мъже, на които е прилагана доза от 60 mg/kg, липсата на каквато и да е връзка с дозата предполага, че тези разлики не са свързани с експозицията на тестваното вещество.

Тежести на органи

Данните за теглото на органите са обобщени в Таблица 3. Абсолютното и относително тегло на черния дроб са значително повишени и при двата пола в групата на 250 mg/kg (Таблица 3). Наблюдава се значително увеличение на относителното тегло на черния дроб при мъже от групата на 60 mg/kg, при мъже, абсолютно и относителнобъбректеглата са значително повишени в групите с 60 и 250 mg/kg. В мъжката група с 250 mg/kg са отбелязани значителни увеличения на абсолютното и относително тегло на надбъбречните жлези и относително тегло на далака и тестисите.

Хистопатология и имунохистохимия

Данните за хистопатологични и имунохистохимични находки са обобщени съответно в таблици 4 и 5. Хистопатологичните находки показват, че честотата на натрупване на еозинофилни гранули (фиг. 2A-D), базофилни тубули и хиалинова отливка, както и фокално интерстициално възпаление вбъбрек, са значително повишени в групите за лечение, включващи изцяло мъже, в сравнение с контролната група (Таблица 4). Въз основа на имунохистохимични анализи, мъжки плъхове, третирани с тестваното вещество, показват повишаване на имунореактивността на глобулин в епителните клетки на проксималните тубули, демонстрирайки ясна зависимост от дозата (Фиг. 2E-H) (Таблица 5).

При аутопсията един мъжки плъх в групата на 250 mg/kg показва силно разширение на дяснатабъбрекпоради хистологично характерен нефробластом. Въпреки че нефробластомът е необичаен при повечето щамове на плъхове9, този случай се счита за случаен, тъй като никое друго животно не показва подобни лезии. В допълнение, при проучвания за орална канцерогенност, честотата на спонтанен нефробластом при мъжки плъхове F344/DuCrlCrlj варира между 0-2.0 процента 10. Въпреки че няколко лезии са спорадично открити в други органи, няма значимо лечение- са очевидни зависими промени в честотата на тези лезии.

Дискусия

Към днешна дата 24 благоприятстващи вещества, включително 2-(-ментокси)етанол, са оценени от JECFA като вещества, структурно свързани с ментола, и всички са посочени като „без опасения за безопасността“ при текущите изчислени нива на прием. 2-(1-Ментокси)етанолът се класифицира в подгрупа на алициклични алкохоли или етери и се счита, че е основно конюгиран с глюкуронова киселина, последвано от екскреция в урината!. Въпреки че пероралните LD.стойности на тези вещества при гризачи са относително високи, данните от проучванията за токсичност при многократни дози остават ограничени. Едно 13-седмично проучване за токсичност при многократни дози разкри, че ментил пиролидон карбоксилат (CAS № 68127-22-0), съединение, структурно свързано с ментола, може да бъде свързано с увеличен относителен черен дроб ибъбректегло при мъжки и женски плъхове Wistar. Натрупване на .-глобулин в проксималните тубули на мъжки плъхове също се наблюдава при доза от 1,111 mg/kg BW/ден и NOAEL се определя като 109 mg/kg BW/ден.

В настоящото 13-седмично проучване за субхронична токсичност на 2-(1-ментокси)етанол не са наблюдавани токсикологични промени в общото състояние, телесното тегло и приема на храна. След хематологична оценка наблюдавахме понижение на HGB (96,6 процента спрямо контролните средни стойности), HCT (96,3 процента), MCV (98,4 процента) и MCH (98,2 процента) и увеличение на PLT (111 процента) при мъжете 250 mg/kg група, които се считат за токсикологични влияния на лечението с 2-(1-ментокси)етанол Както абсолютно (115 процента при двата пола), така и относително (119 процента при мъже и 111 процента при жени) ) теглото на черния дроб е значително увеличено и при двата пола в групите с 250 mg/kg. Въпреки че няма хистопатологични промени в черния дроб, повишени нива на серумния T-Chol (110 процента при мъже и 121 процента при жени) и TP (105 процента при мъже) и намаление на TG (60,1 процента при жени) в 250 mg/kg групи показват токсични промени, свързани с липидния метаболизъм и протеиновия синтез в черния дроб. Намален HGB и MCH и повишени PLT, T-Chol и TP при мъже и намален TG и повишено абсолютно и относително тегло на черния дроб при двата пола също бяха открити със статистическа значимост в 28--дневното предварително проучване (данните не са показани ), което потвърждава, че тези променени хематологични и серумни биохимични параметри, както и теглото на черния дроб, не са случайни, а свързани с изпитваното вещество ефекти. За разлика от това, значителното увеличение на относителните тегла на черния дроб, открито в мъжката група с 60 mg/kg в настоящото проучване, не е придружено от увеличение на абсолютното тегло или промени в свързаните биохимични параметри, което предполага, че това увеличение е адаптивна промяна.

Счита се, че значително увеличените абсолютни (120 процента) и относителни (118 процента) тегла на надбъбречните жлези в мъжката група с 250 mg/kg са свързани с изпитвания химикал. Освен това повишените абсолютни и относителни тегла на надбъбречните жлези и при двата пола показаха ясна зависимост от дозата в 28-дневното предварително проучване (данните не са показани), което показва връзка с третирането с тестов химикал. Въпреки че надбъбречната хипертрофия може да е резултат от стрес, няма открития, предполагащи стрес, като намалено наддаване на телесно тегло или атрофия на тимуса и други лимфоидни органи, както в настоящите, така и в предварителните проучвания. Тъй като може да няма хистопатологични промени в надбъбречната жлеза дори при нарушено производство на глюкокортикоиди в случаи на инхибиране на ензими, свързани със стероидогенезата12, не може да се изключи възможността повишеното тегло на надбъбречната жлеза да е токсично откритие. Обратно, увеличените относителни тегла на далака и тестисите в мъжката група от 250 mg/kg, които не са наблюдавани в предварителното проучване, се считат за токсикологично незначими поради липсата на хистопатологични лезии или значително увеличени абсолютни тегла. По подобен начин, серумната биохимия разкри понижение на A/G и увеличение на Ca и при двата пола, което се счита, че няма токсикологично значение, като се има предвид, че не са открити аномалии в свързани параметри. Освен това понижените нива на Bil и ALP при двата пола и намалените AST и ALT при жените са в контраст с очакваните токсични ефекти и се считат за незначителни.

Хронична нефропатия, характеризираща се с базофилни тубули, хиалинова отливка и фокално интерстициално възпаление, се наблюдава със статистическа значимост при мъже от всички третирани групи. В допълнение, повишен серум Cre и абсолютно и относителнобъбректегла са открити в групите мъжки 60 и 250 mg/kg; тези промени не са наблюдавани при групите за лечение на жени. В тези случаи степента на натрупване на еозинофилни гранули в проксималните тубулни епителни клетки се увеличава по очевидно дозозависим начин. Тези гранули са потвърдени като 2-углобулин чрез имунохистохимия, което показва появата на x-глобулинова нефропатия. -Глобулините, свързани с определени химикали, като d-лимонен, се натрупват в лизозомите и се наблюдават в проксималните тубули като еозинофилни или хиалинови гранули9. Това натрупване може да увреди епителните клетки, което води до хронична прогресивна нефропатия и последващо образуване на тумори. По този начин, въпреки че NOAEL за 2-(1-мен-токси)етанол, свързан с ., глобулинова нефропатия при мъжки плъховебъбрецине е идентифициран, този тип нефропатия се съобщава, че е специфичен за мъжки плъхове и следователно не е от значение за оценката на риска при хора. Повишеният риск от бъбречна недостатъчност, медииран чрез механизми, свързани с натрупването на β-глобулин, е много малко вероятен, тъй като този протеин отсъства при човека14. Поради това се счита за разумно да се изключат промените, свързани с хронична нефропатия, наблюдавани при мъже, от определянето на NOAEL.

В заключение, настоящото 13-седмично проучване за субхронична токсичност показа, че лечението с 250 mg/kg телесно тегло/ден 2-(/-ментокси)етанол причинява токсични промени в хематологията, серумната биохимия и теглото на органите при мъже и женски плъхове F344. Въз основа на наблюдаваните резултати, NOAEL на 2-(1-ментоксиетанол е оценен като 60 mg/kg BW/ден и за двата пола.

Препратки

1 ДЖЕФ. Серия хранителни добавки на СЗО: 60. Оценка на безопасността на определени хранителни добавки. 579–593. 2009 г.

2. Akagi J, Cho YM, Mizuta Y, Toyoda T и Ogawa K. Оценка на субхроничната токсичност на 5-хексенил изотиоцианат, идентично с природата ароматизиращо вещество от Wasabia japonica, при плъхове F344/DuCrj. Токсикол за хранителна химия. 122: 80–86. 2018. [Medline] [CrossRef]

3. Matsushita K, Toyoda T, Morikawa T и Ogawa K. 13--седмично изследване на субхронична токсичност на ванилин пропилей гликол ацетал при F344 плъхове. Токсикол за хранителна химия. 132: 110643. 2019. [Medline] [CrossRef]

4. Matsushita K, Toyoda T, Morikawa T, Takahashi M, Inoue K и Ogawa K. 13-седмично изследване на субхронична токсичност на 2-етилбутанал при F344 плъхове. Regul Toxicol Pharmacol. 100: 118–126. 2018. [Medline] [CrossRef]

5. Toyoda T, Cho YM, Matsushita K, Tachibana S, Senuma M, Akagi J и Ogawa K. 13-седмично изследване на субхронична токсичност на хексил ацетат при SD плъхове. J Toxicol Pathol. 32: 205–212. 2019. [Medline] [CrossRef]

6. Akagi J, Cho YM, Mizuta Y, Tatebe C, Sato K и Ogawa K. Оценка на субхроничната токсичност на изоевгенол метилов етер при F344/DuCrj плъхове чрез 13-седмично перорално приложение. Regul Toxicol Pharmacol. 102: 34–39. 2019. [Medline] [CrossRef]

7. Ide T, Mizuta Y, Akagi J, Masumoto N, Sugimoto N, Sato K, Ogawa K и Cho YM. 90--дневно проучване за токсичност при многократно перорално приложение на четири стереоизомера на 2,4-диметил- 4-фенилтетрахидрофуран, синтетично ароматизиращо вещество, при плъхове F344. Regul Toxicol Pharmacol. 114: 104664. 2020. [Medline] [CrossRef]

8. Furukawa S, Nagaike M и Ozaki K. Бази данни за технически аспекти на имунохистохимията. J Toxicol Pathol. 30: 79–107. 2017. [Medline] [CrossRef]

9. Seely JC, Hard GC и Blankenship B. Kidney. В: Boor Man's Pathology of the Rat, 2-ро изд. AW Suttie (изд.). Aca demic Press, Лондон. 125–166. 2018 г.

10. Takanobu K, Aiso S, Umeda Y, Senoh H, Saito M, Katagiri T, Ikawa N, Ishikawa H, Mine T, Take M, Haresaku M, Matsumoto M и Fukushima S. [Информационни данни за спонтанни тумори в F344 /DuCrlCrlj плъхове]. Sangyo Eiseigaku Zasshi. 57: 85–96. 2015 (на японски). [Medline] [CrossRef]

11. ДЖЕФ. Серия от технически доклади на СЗО: 891. Оценка на някои хранителни добавки (Петдесет и първи доклад на Съвместния експертен комитет на ФАО/СЗО по хранителните добавки). 111–118. 2000 г.

12. Wallig MA. Ендокринна система. В: Основи на токсикологичната патология, 3-то изд. MA Wallig, WM Haschek, CG Rousseaux, B Bolon и BW Mahler (ред.). Academic Press, Лондон. 565–624. 2018 г.

13. Swenberg JA. 2u-глобулинова нефропатия: преглед на участващите клетъчни и молекулярни механизми и техните последици за оценката на риска при хората. Здравна гледна точка на околната среда. 101 (Допълнение 6): 39–44. 1993. [Medline] [CrossRef]

14. Greaves P. Уринарен тракт. В: Хистопатология на предклиничните изследвания на токсичността, 4-то изд. Academic Press, Лондон. 537–614. 2012 г.