Хомозиготен Dab1−// е потенциална нова причина за автозомно-рецесивни вродени аномалии на бъбреците и пикочните пътища на мишки

edmund.chen@wecistanche.com

Въведение

Yotari мутантни мишки, получени чрез спонтанно придобиване на мутация в гена Dab1, проявяват хистологични аномалии в централната нервна система [1, 2], много подобни на тези на reeler (reelin//) мишки, което предполага, че reelin и DAB1 принадлежат на същия сигнален път [1–4]. Съобщава се, че аберациите в пътя reelin/DAB1 са свързани с различни психиатрични разстройства [5–7]. Интересното е, че освен в централната нервна система, присъствието на протеини DAB1 и reelin също е потвърдено в периферната нервна система и някои екстраневрални тъкани. Наличието на DAB1 е установено в миши подоцити [8] и човешки плодбъбреци[9], докато се съобщава за експресия на рилин по време на феталното развитие на мишки и хора, както и в някои ендотелни клетки по кръвоносните съдове при възрастни мишки [9–11]. Каноничният път на reelin/DAB1 може да задейства отделни протеини надолу по веригата, включително NOTCH2 рецептори, които играят критична роля в решенията за клетъчна съдба и диференциация по време набъбрекразвитие [12–14]. NOTCH2 рецепторите са необходими за образуване на проксимални тубули и подоцити [13], но след като се постигне съзряване на нефрона, този път е предимно заглушен [15]. При състояния на остърбъбречни заболявания,повишената експресия на NOTCH2 може потенциално да допринесе за регенерация, докато продължителната експресия е причинно свързана с интерстициална фиброза и гломерулосклероза [15]. Понижаването на NOTCH сигнализирането може значително да намали аутофагията и да причини увреждане на диференциацията на подоцитите по време на развитието [16].

Следователно, дисфункционалните подоцити играят решаваща роля в гломерулната болест, особено при човешки идиопатичен нефротичен синдром [17,18] и при нефротичен синдром с минимална промяна (MCNS) [19]. Следователно автофагията поддържа клетъчната хомеостаза при нормални физиологични условия, докато при патологични състояния тя може да прогресира до автофагична смърт [20]. Широко използван биомаркер за автофагия е LC3B, структурен протеин на автофагозомни мембрани [21]. Сложното пресичане между аутофагията и апоптозата също допринася за поддържането на хомеостатичния баланс като отговор на микросредата на клетката. Добре известно е, че апоптотичните събития се увеличават по време набъбрекразвитие [22] и значително намалява след като съзряването приключи, освен в условията набъбречно увреждане[23]. Безспорно апоптозата е сложен механизъм, регулиран чрез взаимодействието на няколко пътя, но най-вече завършва с активиране на каспаза3 (CASP3), чието активиране е един от най-често използваните маркери за откриване на апоптоза [23].

В този доклад ние имахме за цел да анализираме как влияе функционалното заглушаване на гена Dab1бъбрекморфология и експресията и локализацията на протеини reelin, NOTCH2, LC3B и разцепени CASP3 в постнатални мишкибъбреци. Предполагаме, че тези протеини се експресират в постнатална мишкабъбрек,и тяхното функционално взаимодействие допринася за поддържането на тяхната структура и функция. В допълнение, тъй като присъствието на DAB1 е потвърдено по време на човешкия плодбъбрекразвитие [9], може да се предположи, че неговото инактивиране може да причини разстройство в широк спектър от вродени аномалии набъбреки пикочните пътища (CAKUT).

Ключови думи:йотари; бъбречна функция; постнатално развитие на бъбреците; имунофлуоресцентно оцветяване; трансмисионна електронна микроскопия

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ФУНКЦИЯ

Материали и методи

Колекция от пробиКато Dab1 нулеви конвенционални мутанти, ние използвахме yotari (Dab1/) мишки, описани по-рано от Howell et al. [24]. PCR праймерите, използвани за генотипиране на мишките, са yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT и CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, див тип на Dab1 локус: GCCCTTCAGCATCACCATGCT и CCTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. C57BL/6 N мишки бяха отгледани и групирани в стандартни поликарбонатни клетки (включително поне една от всеки генотип) с ad libitum достъп до храна и вода в стая с контролирана температура (23 ± 2 ◦C) с 12 h светлина/ тъмен цикъл. На постнатални дни 4, 11 и 14 (P4, P11 и P14), мишките бяха дълбоко анестезирани с пентобарбитал и транскардиално перфузирани за 1 0 минути с фосфатно буферен физиологичен разтвор (PBS, pH 7,2) и 4 процента параформалдехид (PFA ) в 0.1 М PBS.Бъбрецибяха отстранени и фиксирани с 4 процента PFA в 0.1 М PBS за една нощ за конвенционални хистологични анализи (хематоксилин-еозин (H&E), имунохистохимично и имунофлуоресцентно оцветяване) и в смес от 2 процента PFA плюс 2,5 процента глутаралдехид (GA) за изследване с електронен микроскоп. След фиксиране тъканта беше подготвена за по-нататъшно хистологично изследване, както описахме по-рано [25,26].

Имунофлуоресценция и имунопероксидазно оцветяванеСлед депарафинизация и рехидратация, срезовете се нагряват в продължение на 2 0 минути в 0.01 М цитратен буфер (рН 6,0) във водна пара и след това се охлаждат до стайна температура. Блокиращ буфер (ab 64226, Abcam, Cambridge, UK) се прилага за 30 минути, за да се изключи неспецифично оцветяване. След това срезовете се инкубират във влажна камера за една нощ с първични антитела (Таблица 1). След промиване в PBS, вторични антитела (Таблица 1) се прилагат за един час и се промиват отново в PBS. След това ядрата се оцветяват с 4060 -диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в продължение на 2 минути, промиват се в PBS и се покриват с покривно стъкло. Извършихме теста за предадсорбция, така че всяко първично антитяло да се използва със съответния пептид и да приложим тяхната комбинация към секциите. Резултатите не показват оцветяване на антитела. В допълнение, бяха извършени контроли с пропускане на първичното антитяло за определяне на нивата на неспецифично свързване на вторични антитела.

За оцветяване с имунопероксидаза, заешко поликлонално анти-CASP3 (1:100 разреждания, ab13847, Abcam, Кеймбридж, Обединеното кралство) се прилага като първично антитяло за един час във влажна камера след третиране на среза с 0,1 процент H2O2. След промиване в PBS, беше извършено вторично откриване с помощта на връзка и стрептавидин пероксидаза, всяка за петнадесет минути (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) и диаминобензидин (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), внимателно контролирани, за да се избегне преоцветяване на фона. Ядрата се оцветяват с хематоксилин, изплакват се с чешмяна вода в продължение на 10 минути, за кратко се дехидратират във възходяща серия от етанолови разтвори и се покриват с покривно стъкло.

Подготовка на тъканите за трансмисионен електронен микроскоп (TEM)След фиксиране със смес от 2 процента PFA и 2,5 процента GA в 0.1 М PBS за 2 часа, пробите се промиват с PBS и се фиксират след това във воден разтвор на 2 процента осмиев тетроксид за 2 часа. Всички проби се промиват два пъти в PBS, дехидратират се във възходящи степени на етанол и се вграждат в Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, UK). Серийни срезове (с дебелина 70 nm) се нарязват на ултрамикротом Ultracut UCT (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия) и се оцветяват с 1% уранил ацетат и оловен цитрат.

Събиране и анализ на данниАнализът беше извършен с епифлуоресцентен микроскоп (Olympus BX51, Токио, Япония), оборудван с цифров фотоапарат DP71 (Olympus), трансмисионен електронен микроскоп JEM 1400 (JEOL, Токио, Япония), работещ при 80 kV и сниман с JEOL заряд- система от камери със свързано устройство (CCD) (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA, САЩ) и накрая микроскоп с ярко поле (BX40, Olympus, Токио, Япония). Всички анализирани изображения бяха обработени със софтуер ImageJ и Adobe Photoshop (Adobe, Сан Хосе, Калифорния, САЩ). На изследвана група използвахме три до четири животни. Всички събранибъбрецибяха нарязани на секции с дебелина 5 µm и максимумбъбрек length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, което показва отлично съответствие [27].

Статистически анализБеше проведен двустранен t-тест, за да се анализират разликите в средния диаметър между PCT, DCT и G на животни от див тип и йотари. Диаметърът беше представен като средно ± стандартно отклонение (SD). Нивото на значимост беше определено на p < 0.05.="" двупосочен="" anova="" тест,="" последван="" от="" теста="" за="" множествено="" сравнение="" на="" tukey,="" беше="" използван="" за="" изследване="" на="" разликите="" в="" процента="" на="" положителни="" клетки="" между="" pct,="" dct="" и="" гломерули="" във="" всички="" времеви="" точки.="" процентът="" на="" положителните="" клетки="" се="" изразява="" като="" средна="" стойност="" ±="" стандартна="" грешка="" на="" средната="" стойност="" (sem).="" нивото="" на="" значимост="" беше="" определено="" на="" p=""><0.05. анализът="" беше="" извършен="" в="" софтуер="" graphpad="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" калифорния,="">

Резултати

Оцветяване с хематоксилин-еозин (H&E) и измерване на диаметъра на бъбрекаH&E оцветяване на средни сагитални участъци набъбрецивъв всички разгледани времеви точки откроява малкитебъбрекфенотип на мишки yotari в сравнение с див тип (Фигура 1а). При 4P среднобъбрекдиаметърът на животните йотари е около 55 µm, отколкото около 75 µm. В допълнение, тази разлика беше забележима в по-късни времеви точки поради по-бавния растеж набъбрецив йотари в сравнение с прогресивния растеж набъбреципри животни от див тип. За да се определи дали намаляването на общотобъбрекразмерът е причинен от намаляване на размера на сегмента на нефрона, ние осреднихме диаметъра на PCT, DCT и G за група. Наистина, имаше намаление на средния диаметър G, PCT и DCT в групата на йотари в сравнение с дивия тип (Фигура 1b, p < 0.05).="" освен="" това="" оцветяването="" с="" h&e="" разкри="" по-тънък="" кортекс="">бъбречнаразширение на таза при животни йотари и леко дифузно разширен DCT при 14P. Основната структура и модел на гломерулно съзряване са еднакви и в двете изследвани групи животни.

Описателен хистологичен анализ, базиран на ТЕМ микрофотографииНа микроснимки получени чрез ТЕМ, гломерулите на мишки от див тип показват типичния външен вид на всички части на фифилтрационната бариера, които са нормално развити и разпознаваеми (Фигура 2а). Подоцитите, процесите на краката на подоцитите и педикулите, фифилтрационните процепи, гломерулните базални мембрани и капилярният лумен с фенестриран ендотел бяха лесно различими (Фигура 2а). От друга страна, в гломерулите на мишки yotari може да се наблюдава прогресивно увреждане на подоцитите с изтриване на процеса на крака и липса на фифилтрационни процепи (Фигура 2b–d). Тези ултраструктурни промени се наблюдават при всичкибъбрециизследвани и обхванати повечето от изследваните гломерули. Не са забелязани аномалии в PCT или DCT на мишки yotari в сравнение с животни от див тип (Фигура 2e-h). В PCT клетъчните интерфейси са дефинирани лошо поради неравномерността на клетъчните мембрани и клетъчното интердигитиране с техните съседи. Цитоплазмата беше в изобилие, съдържаща добре разграничени ядра, удължени митохондрии, базални нагъвания и много тръбести вдлъбнатини между микровили, които образуваха четкова граница на апикалната мембрана. По-голямото увеличение разкри апикалната повърхност на PCT епителни клетки, съдържащи дълги микровили за образуване на границата на четката и плътни връзки между границите на луминалните клетки на съседни тубулни епителни клетки (Фигура 2e, f). От друга страна, апикалната повърхност на DCT епителните клетки съдържаше няколко къси микровили и множество везикули (Фигура 2g, h).

Фигура 2. Микроснимки от трансмисионен електронен микроскоп (TEM) на див тип и йотарибъбрециГломерулите на животни от див тип (a) показват нормално развита филтрационна бариера с фенестриран ендотел (E) на капиляра (C), базална мембрана (BM), подоцити (P) с педикули (PE) и фифилтрационни процепи (FS ). Вбъбреципри животни йотари може да се забележи изтриване на дръжките и липса на фифилтрационни процепи (звездички, b–d). Не са забелязани аномалии в проксималните извити тубули (PCT) или дисталните извити тубули (DCT) на мишки yotari в сравнение с животните от див тип (e-h). В PCT цитоплазмата е в изобилие, съдържаща добре разграничени ядра (N), удължени митохондрии (M), базални нагъвания (BI) и много тръбести ями (TP) между микровили, които образуват четкова граница (BB) на апикална мембрана (e,f). По-голямото увеличение разкри апикалната повърхност на PCT епителни клетки, съдържащи дълги микровили, за да образуват границата на четката и плътните връзки (TJ) между границите на луминалните клетки на съседните тубулни епителни клетки (e,f). От друга страна, апикалната повърхност на DCT епителни клетки, съдържаща няколко къси микровили и множество везикули (g, h). Мащабната лента в изображения (a–d) и вмъквания (e–h) е 1 µm; мащабната лента в изображенията (e–h) е 2 µm.

Локализация и колокализация на Reelin и DAB1Reelin беше слабо експресиран с лека до умерена реактивност (Таблица 2) в гломерулите и DCT на всички изследвани животни във всички наблюдавани времеви точки (p < 0.05,="" фигура="" 3a).="" само="" в="" pct="" на="" мишки="" yotari="" процентът="" на="" положителните="" клетки="" беше="" значително="" по-висок="" от="" дивия="" тип="" животни="" (p=""><0.05, фигура="" 3a).="" в="" гломерулните="" клетки="" локализацията="" на="" оцветяването="" е="" перинуклеарна,="" докато="" в="" pct="" и="" dct="" тя="" е="" разпръсната="" в="" цитоплазмата="" (фигура="" a,="">

Фигура 4. Имунофлуоресцентно оцветяване на постнатални йотарибъбрецис рилин маркер (a) и двойно имунофлуоресцентно оцветяване на постнатален див типбъбрецис DAB1 и маркери за макара (b). ( a, b ) Ядрено ДНК DAPI оцветяване, слято с DAB1, и имунофлуоресценцията на реелин е показана паралелно (сливане). Наблюдаваните времеви точки бяха P4, P11, P14. Експресията на изследваните маркери в гломерулите (G), проксималните извити тубули (PCT) и дисталните извити тубули (DCT) е маркирана със стрелките, докато звездичките показват експресията на reelin в извънклетъчния матрикс (a). Вложките показват най-видното изражение в изображението. Ядреното оцветяване с DAPI разкрива лоша колокализация на DAB1 и reelin, най-вече в DCT (върх на стрелка). Мащабната лента е 20 µm и се отнася за всички изображения.

Нямаше почти никаква имунна реактивност на DAB1 в гломерулите и PCT на животни от див тип при P4, докато процентът на положителните клетки с лека реактивност (Таблица 2) значително се увеличи при P11 и P14 (p < 0).05,="" фигура="" 3b).="" в="" dct,="" dab1="" се="" експресира="" предимно="" в="" апикалните="" и="" страничните="" части="" на="" клетъчните="" мембрани="" (фигура="" 4b)="" със="" силна="" реактивност="" (таблица="" 2).="" процентът="" на="" положителните="" клетки="" беше="" значително="" по-висок,="" отколкото="" в="" предишните="" структури,="" около="" 60="" процента="" (фигура="" 3b),="" особено="" в="" macula="" densa="" (фигура="" 4b).="" нямаше="" почти="" никаква="" колокализация="" на="" dab1="" и="" reelin,="" освен="" в="" dct="" на="" животни="" от="" див="" тип="" при="" p14="" (върх="" на="" стрелка,="" фигура="" 4b).="" biomolecules="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" от="" 14="" фигура="" 4.="" имунофлуоресцентно="" оцветяване="" на="" постнатални="">бъбрецис рилин маркер (а) и двойно имунофлуоресцентно оцветяване на постнатален див типбъбрецис DAB1 и маркери за макара (b). ( a, b ) Ядрено ДНК DAPI оцветяване, слято с DAB1, и реелин имунофлуоресценция е показана паралелно (сливане). Наблюдаваните времеви точки бяха P4, P11, P14. Експресията на изследваните маркери в гломерулите (G), проксималните извити тубули (PCT) и дисталните извити тубули (DCT) е маркирана със стрелките, докато звездичките показват експресията на reelin в извънклетъчния матрикс (a). Вложките показват най-видното изражение в изображението. Ядреното оцветяване с DAPI разкрива лоша колокализация на DAB1 и reelin, най-вече в DCT (върх на стрелка). Мащабната лента е 20 µm и се отнася за всички изображения. Нямаше почти никаква имунна реактивност на DAB1 в гломерулите и PCT на животни от див тип при P4, докато процентът на положителните клетки с лека реактивност (Таблица 2) значително се увеличи при P11 и P14 (p <0.05, фигура="" 3b).="" в="" dct,="" dab1="" се="" експресира="" предимно="" в="" апикалните="" и="" страничните="" части="" на="" клетъчните="" мембрани="" (фигура="" 4b)="" със="" силна="" реактивност="" (таблица="" 2).="" процентът="" на="" положителните="" клетки="" беше="" значително="" по-висок,="" отколкото="" в="" предишните="" структури,="" около="" 60="" процента="" (фигура="" 3b),="" особено="" в="" macula="" densa="" (фигура="" 4b).="" нямаше="" почти="" никаква="" колокализация="" на="" dab1="" и="" reelin,="" освен="" в="" dct="" на="" животни="" от="" див="" тип="" при="" p14="" (върх="" на="" стрелка,="" фигура="">

Пространствени и времеви модели на изразяване на NOTCH2 и LC3BПроцентът на NOTCH{{0}}позитивните клетки е по-малък от 20 процента в гломерулите и на двата животински генотипа във всички наблюдавани времеви точки. Само при P14 процентът на положителните клетки е значително по-висок в гломерулите на йотари животни, отколкото животни от див тип (р <0.05, фигура="" 3с).="" интензитетът="" на="" оцветяване="" е="" лек="" до="" умерен="" (таблица="" 2),="" предимно="" разположен="" перинуклеарно="" (фигура="" 5a-f).="" в="" pct="" и="" dct="" на="" двата="" животински="" генотипа="" процентът="" на="" положителните="" клетки="" нараства="" с="" времето.="" при="" p14,="" процентът="" на="" положителните="" клетки="" е="" значително="" по-висок="" в="" pct="" и="" dct="" на="" животни="" йотари,="" отколкото="" pct="" и="" dct="" на="" животни="" от="" див="" тип="" (p=""><0.05, фигура="" 3c).="" интензитетът="" на="" сигнала="" във="" всички="" наблюдавани="" времеви="" точки="" беше="" лек="" до="" умерен="" (таблица="" 2)="" и="" разпръснат="" в="" цитоплазмата="" (фигура="" 5a-f).="" фигура="" 5.="" имунофлуоресцентно="" оцветяване="" на="" постнатален="" див="" тип="" и="">бъбрецис NOTCH2 и LC3B маркери и имунопероксидазно оцветяване с разцепен каспаза3 (CASP3) маркер. ( a – f ) Оцветяването с DAPI на ядрена ДНК се слива с NOTCH2 и LC3B. Наблюдаваните времеви точки бяха P4, P11, P14. Експресията на маркерите NOTCH2 и LC3B в гломерулите (G), проксималните извити тубули (PCT) и дисталните извити тубули (DCT) е маркирана със стрелките. Особено силна LC3B реактивност може да се наблюдава в капсулата на Bowman на разлагащите се гломерули (звездичка, e). Вложките показват най-видното изражение в изображението. CASP3 беше слабо изразен във всички наблюдавани времеви точки. Единствената значима експресия беше в гломерулите на мишки yotari на P14 (стрелки). Мащабната лента е 20 µm и се отнася за всички изображения. Биомолекули 2021, 11, 609 9 от 14 3.4. Модели на пространствена и времева експресия на NOTCH2 и LC3B Процентът на NOTCH2-позитивните клетки е по-малък от 20 процента в гломерулите на двата животински генотипа във всички наблюдавани времеви точки. Само при P14 процентът на положителните клетки е значително по-висок в гломерулите на йотари животни, отколкото диви животни (р <0.05, фигура="" 3с).="" интензитетът="" на="" оцветяване="" е="" лек="" до="" умерен="" (таблица="" 2),="" предимно="" разположен="" перинуклеарно="" (фигура="" 5a-f).="" в="" pct="" и="" dct="" на="" двата="" животински="" генотипа="" процентът="" на="" положителните="" клетки="" нараства="" с="" времето.="" при="" p14,="" процентът="" на="" положителните="" клетки="" е="" значително="" по-висок="" в="" pct="" и="" dct="" на="" животни="" йотари,="" отколкото="" pct="" и="" dct="" на="" животни="" от="" див="" тип="" (p=""><0.05, фигура="" 3c).="" интензитетът="" на="" сигнала="" във="" всички="" наблюдавани="" времеви="" точки="" беше="" лек="" до="" умерен="" (таблица="" 2)="" и="" разпръснат="" в="" цитоплазмата="" (фигура="">

Фигура 5. Имунофлуоресцентно оцветяване на постнатален див тип и йотарибъбрецис NOTCH2 и LC3B маркери и имунопероксидазно оцветяване с разцепен каспаза3 (CASP3) маркер. ( a – f ) Оцветяването с DAPI на ядрена ДНК се слива с NOTCH2 и LC3B. Наблюдаваните времеви точки бяха P4, P11, P14. Експресията на маркерите NOTCH2 и LC3B в гломерулите (G), проксималните извити тубули (PCT) и дисталните извити тубули (DCT) е маркирана със стрелките. Особено силна LC3B реактивност може да се наблюдава в капсулата на Bowman на разлагащите се гломерули (звездичка, e). Вложките показват най-видното изражение в изображението. CASP3 беше слабо изразен във всички наблюдавани времеви точки. Единствената значима експресия беше в гломерулите на мишки yotari на P14 (стрелки). Мащабната лента е 20 µm и се отнася за всички изображения.

В гломерулите и DCT на двата животински генотипа, процентът на LC3B-позитивните клетки се увеличава с времето (p < 0.05,="" фигура="" 3d).="" при="" p11="" и="" p14,="" процентът="" на="" положителните="" клетки="" е="" значително="" по-висок="" в="" гломерулите="" на="" животни="" йотари,="" отколкото="" гломерулите="" на="" животни="" от="" див="" тип="" (p="">< 0.05,="" фигура="" 3d).="" в="" гломерулите="" на="" йотари="" животни="" интензитетът="" на="" оцветяване="" е="" предимно="" умерен="" до="" силен="" (таблица="" 2),="" разположен="" в="" перинуклеарното="" и="" ядреното="" пространство="" (фигура="" 5a-f),="" във="" всички="" наблюдавани="" времеви="" точки,="" докато="" в="" гломерулите="" на="" мишки="" от="" див="" тип="" интензитетът="" е="" предимно="" умерено="" (таблица="" 2).="" pct="" на="" йотари="" и="" животни="" от="" див="" тип="" съдържа="" около="" 20="" процента="" положителни="" клетки="" във="" всички="" наблюдавани="" времеви="" точки="" (p=""><0,05, фигура="">

Разцепен CASP-3 изразНямаше почти никакъв израз на активирания CASP-3 вбъбрецина животни от див тип във всички наблюдавани времеви точки. В PCT и DCT на мишки yotari няколко отделни клетки са CASP-3-положителни (Фигура 3e). Само в гломерулите на бъбреците на йотари при P14 (Фигура 5e), процентът на положителните клетки значително се увеличава в сравнение сбъбрецина мишки от див тип (p < 0.05, Фигура 3e).

Дискусия

Бъбрекморфогенезата и развитието са сложни процеси, прецизно координирани чрез взаимодействието на голям брой гени. Вродени аномалии набъбреки пикочните пътища (CAKUT) са най-честият вроден дефект, който съставлява 23 процента от всички подобни дефекти и представлява водещата причина за краен стадийбъбречно заболяванепри деца [28,29]. Разстройствата на единичен ген може да са основният източник на CAKUT и досега мутация в повече от 20 гена е идентифицирана като причина за CAKUT [30]. Тъй като предишната ни работа показа голяма експресия на DAB1 по време на нормален фетален човекбъбрекразвитие [9], ние предположихме, че DAB1 може да играе значителна роля по време на бозайницитебъбрекразвитие. За да докажем нашата хипотеза, ние изследвахмебъбрекморфология и модели на експресия на reelin, NOTCH2, LC3B и активирани CASP3 протеини в Dab1 нокаут мишки.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА

Разрез на мишките йотарибъбрециразкрива по-тънък кортекс и значително по-малка средна стойностбъбреки PCT, DCT и G диаметри в сравнение с животни от див тип. Намаляването набъбрекразмер, причинен от недостатъчно нефронно снабдяване, е известен катобъбречнахипоплазия, едно от най-честите разстройства на CAKUT, което предразполага към хипертония в зряла възраст и хронично бъбречно заболяване [31]. В допълнение, микроснимките, заснети с ТЕМ, разкриват, че мишките yotari показват видимо увреждане на подоцитите с изтриване на процеса на крака и липса на фифилтрационни процепи. След нараняването подоцитите претърпяват процеса на изтриване, при който губят своята структура, което води до намаляване на тяхната бариерна функция за фифилтрация [32]. Всички форми на нефротичен синдром, както и фокалната сегментна гломерулосклероза (FSGS), се характеризират с дефекти в структурата или функцията на подоцитите [33].

Нашето текущо проучване показа най-високата експресия на DAB1 в апикалните и страничните части на клетъчните мембрани на DCT, докато REELIN беше предимно разпръснат в цитоплазмата на PCT. В изследваните времеви точки не са наблюдавани морфологични промени в тубулите на мишки yotari, но е необходимо допълнително изследване, за да се изясни ролята на DAB1 в тубулоинтерстициалните отделения. Имаше случайна колокализация на протеините DAB1 и REELIN, най-вече в DCT. Тези открития следват нашата предишна работа относно експресията на тези два протеина по време на човешкия плодбъбрекразвитие [9]. Това може да предполага, че DAB1 и reelin имат подобни роли при човека и мишкатабъбрецичрез активиране на някои от низходящите пътища, като Crk, MAPK и PI3K/Akt/mTOR сигнални каскади [34–36]. Нашите данни също разкриват повишена експресия на релин в гломерулите на мишки йотари. Интересно е, че предишно проучване показа, че фосфорилирането на DAB1 и повишената експресия на рилин в гломерулите са придружени от хипертония, протеинурия и увреждане на подоцитите при плъхове, инфузирани с Ang II [10].

В допълнение, имунофлуоресцентното оцветяване разкрива повишена експресия на NOTCH2 рецептори в гломерулите на мишки P14 yotari. Добре известно е, че експресията на NOTCH2 се регулира надолу, след като се постигне съзряване на нефрона, освен в условията набъбречни увреждания,като диабетна нефропатия и FSGS [15,37]. Мишки с индуциран от адриамицин нефротичен синдром също показват повишена експресия на активиран NOTCH2, който подобрява фифиброзата [38]. В изследваните времеви точки не забелязахме повишена фиброза, но остава да изясним точната роля на експресирания NOTCH2 в постнаталния йотарибъбреци.Би било необходимо по-нататъшно наблюдение дали фиброзните промени се появяват в по-късните етапи. Въпреки това, вече има някои открития, които предполагат, че краткосрочният ефект от повишеното активиране на NOTCH2 е свързан със силна полза за оцеляването на увредени подоцити, която се губи при дългосрочни модели, като диабетна нефропатия [39].

По-високата експресия на LC3B в гломерулите на P11 и P14 мишки yotari вероятно отразява натрупване на автофагозоми в подоцитите. За да покаже ясно, че автофагията е ускорена. Необходимо е да се анализира съотношението на LC3-II и LC3-I протеинови експресии. При нормални условия автофагията е необходима за нормалнотобъбречна функция[40], особено в подоцитите. Поради ограничения си капацитет за клетъчно делене и заместване, те показват високо базално ниво на автофагия [41]. Въпреки тези констатации е докладвано повишаване на експресията на LC3B при няколко гломерулни заболявания [42–44], главно във връзка с изтриване на процеса на стъпалото и развитие на нефротичен синдром, както се наблюдава при мишки с условен нокаут на проренин рецептор [45,46]. Всички тези проучвания предполагат защитна роля на засилената аутофагия при патологични състояния, допълнително подкрепена от констатациите за индуцирана от адриамицин нефропатия, при която аутофагията се активира за защита срещу увреждане на подоцитите [43], както и при зависимо от възрастта гломерулно заболяване, където се забавя прогресивното функционално влошаване набъбречна функция[40]. Анализ на човекабъбрекбиопсиите също показаха доказателства за повишена аутофагия във връзка с изтриване на процеса на стъпалото при няколко гломерулни заболявания, включително нефротичен синдром на минимални промени (MCNS), който е една от най-честите причини за идиопатичен нефротичен синдром [19]. При състояния на диабетна нефропатия и липополизахарид-индуцирана остраувреждане на бъбреците,подобряването на автофагията с някои терапевтични средства чрез инхибиране на пътя PI3K/AKT/mTOR подобрява бъбречната функция [47,48]. Всички тези констатации предполагат, че аутофагията има незаменима цитопротективна роля за адаптиране на стреса вувреждане на бъбрецитеи неговата модулация може да бъде обещаваща терапевтична стратегия, въпреки че при някои обстоятелства автофагията може също да бъде вредна и да прогресира до клетъчна смърт.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА НЕДОСТАТЪЧНОСТ

С изключение на повишаването на аутофагията, повишено ниво на апоптоза може да се наблюдава и в гломерулите на мишки P14 yotari. Аутофагията обикновено предотвратява апоптозата, но при специфични патологични обстоятелства може да има и обратен ефект върху клетъчното оцеляване чрез засилване и насърчаване на апоптозата [42]. След раждането апоптозата вбъбрецие силно намалена, освен в условията наувреждане на бъбреците,като идиопатичен нефротичен синдром, където допринася за развитието на заболяването [23]. потенциална нова причина за автозомно-рецесивни вродени аномалии набъбреки пикочните пътища. Въпреки това, основната роля на DAB1 по време набъбрекразвитието остава неясно. В допълнение, тези мишки показват аномалии в процеса на стъпалото и повишено ниво на reelin, NOTCH2, LC3B и разцепени CASP3 протеини в гломерулите, което може да доведе до гломерулни увреждания, като нефротичен синдром, който във връзка с хипоплазия може да бъде потенциална причина за смърт от тези животни по време на периода на отбиване. За потвърждаване на тази хипотеза е необходимо да се предостави допълнителна информация относно кръвното налягане и други клинично-лабораторни параметри, като нива на серумен креатинин, албумин и протеини.