Актеозидът, получен от Cistanche, подобрява индуцираната от глюкокортикоиди остеопороза чрез активиране на пътя PI3K/AKT/mTOR

Резюме

Обективен

Глюкокортикоидите се използват широко в клиничната практика; те обаче могат да причинят странични ефекти, като напростеопороза. Актеозид(ACT) от Cistanche се използва за борба с различни заболявания. Проучването е проведено за оценка на ефикасността на ACT при индуциран от глюкокортикоидиостеопороза(GIOP) и неговия потенциален механизъм.

Методи
Дексаметазон (Dex) се инжектира интрамускулно за предизвикванеостеопорозав модел на плъх и ACT се дава орално. ACT беше допълнен in vivo в Dex-стимулираностеобластниMC3T3-E1 клетки. RT-qPCR се извършва за оценка на нивата на mRNA наобразуване на кости(Runx2, CoL1A1) и костна резорбция (OPG и RANKL). Беше приложен търговски комплект ELISA за оценка на серумните нива на OC и CTX. Беше извършен Western blot за оценка на протеиновите нива в PI3K/AKT/mTOR сигналния път. CCK-8 анализ и поточна цитометрия бяха проведени за оценка на жизнеспособността на остеобластите и апоптозата.

Щракнете тук, за да получите Cistanche Acteoside за лечение на Dex-стимулиран остеобласт

Резултати
ACT намалява предизвиканото от Dex влошаване на костната микроструктура, повишава серумните нива на OC и намалява нивата на CTX (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and насърчавана апоптоза; обаче, този ефект беше силно отслабен от ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Заключение
ДЕЙСТВАЙТЕ отЦистанчеможе да упражнява остеопротективни ефекти чрез активиране на сигналния път на PI3K/AKT/mTOR за облекчаване на индуцираната от Dex остеопороза.

Ключови думи:Актеозид Цистанчеиндуциран от глюкокортикоидиостеопороза

Въведение
Остеопорозата (OP) е генерализирано скелетно заболяване, характеризиращо се с ниска костна маса, разрушаване на микроструктурата на костната тъкан и дисбаланс в костната хомеостаза [1]. ОП причинява повече от 8,9 милиона фрактури годишно, а остеопоротичните фрактури се появяват почти на всеки 3 секунди и водят до увреждане или смърт през целия живот [2]. Глюкокортикоидите (GC) обикновено се прилагат за лечение на неинфекциозни възпалителни заболявания (като астма и възпалителни заболявания на червата), както и автоимунни състояния [3]. Въпреки това, дългосрочната употреба на GC предразполага към повече от 30 процента от случаите на ОП и повече от 10 процента от случаите на остеонекроза [4]. GC директно инхибират пролиферацията и диференциацията на остеобластите [5], намаляват съзряването и активността и индуцират апоптоза на остеобластите, което от своя страна води до развитие на индуцирана от глюкокортикоиди остеопороза (GIOP) [6]. Освен това нарастващите доказателства сочат, че остеобластната дисфункция е основната причина за загуба на костна маса. Следователно, увеличаването на броя и функцията на остеобластите изглежда е основната стратегия за предотвратяване на ОП, особено на GIOP.

Билковите лекарства, особено тези, базирани на природни съединения, се практикуват от хиляди години за лечение на различни заболявания [7]. Cistanche е ценна билка, записана в Китайската фармакопея, която расте в южната част на Синдзян-Уйгурския автономен регион и е известна като пустинен женшен [8]. Доказано е, че Cistanche има различни ефекти, като имунна защита, бъбречна защита, анти-стареене, антиоксидантни, противовъзпалителни и невропротективни ефекти [9].Актеозид(ACT) е фенилетанолов глюкозид в Cistanche, който има биологични активности, като инхибиране на невронална апоптоза [10], облекчаване на увреждане на черния дроб [11], противовъзпалително [12], антиоксидант [13] , профилактика на диабет [14] и затлъстяване [15], както и дегенерация на ставния хрущял [16]. Освен това, няколко проучвания съобщават за фармакокинетиката на ACT и потвърждават, че терапевтичният ефект съществува дори ако пероралното използване е само 0,12 процента. ACT се счита за пролекарство с активни метаболити in vivo [17].

Джан и др. демонстрира потенциален защитен ефект на ACT върху костна загуба, предизвикана от овариектомия при плъхове [18]. ACT модулира сигналния път на IGF-1/PI3K/mTOR, за да предотврати загубата на костна маса при плъхове с диабет [19]. Съобщава се, че пътят на PI3K/AKT/mTOR има критични регулаторни роли при различни заболявания, включително GIOP [20]. Нарингин облекчава GIOP чрез регулиране на сигналния път PI3K/AKT/mTOR [21]. Освен това този сигнален път регулира диференциацията на остеобластите [22], образуването на кост [23] и зарастването на фрактури [24]. Въпреки това, потенциалната роля на ACT върху GIOP и дали тя се регулира от модулацията на PI3K/AKT/mTOR сигналния път не е известна.

Настоящото проучване имаше за цел да разбере защитните ефекти на ACT в модел на плъх GIOP и остеобласти in vitro и да изясни основните молекулярни механизми.

Материали и методи
Опитни животни
Четиридесет 8-седмични мъжки плъхове Sprague-Dawley (SD) с тегло 280–340 g бяха получени от Шанхайския център за лабораторни животни (CAS, Шанхай, Китай). Процедурите за грижа за експерименталните животни бяха извършени в съответствие с протокола, одобрен от Комитета по етика на животните в Третата свързана болница на Медицинския университет Qiqihar. И проучването е проведено в съответствие с насоките на ARRIVE. Животните бяха настанени в центрове за животни, свободни от патогени, 24 ± 2 градуса, 12 часа цикъл на светлина и тъмнина, 50 ± 5 процента влажност и със свободен достъп до храна и вода.

Изграждане на GIOP модел
След 7 дни адаптивно хранене, плъховете се разделят на случаен принцип на контролни и моделни групи, като се използва методът на таблицата с произволни числа, инжектира се дексаметазон (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA) 5 mg/kg два пъти седмично в продължение на 6 седмици интрамускулно за индуциране на ОП при плъхове в моделната група [25]. Плъховете в контролната група (n = 10) бяха инжектирани с равно количество физиологичен разтвор. Не са наблюдавани значителни промени в телесното тегло при плъховете и в двете групи на 6-та седмица. Впоследствие плъховете в моделната група бяха подразделени на моделна група, ACT група с ниска доза (Модел плюс ACT-L) и ACT група с висока доза (Модел плюс ACT-H). ACT (HPLC 98 процента) беше получен от Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, Китай) и обработен с водна суспензия на разтворител. Доза от 50 mg/kg/ден и 100 mg/kg/ден ACT се прилага перорално на плъхове съответно в групите с ниска и висока доза (8 плъха на група), и продължи 8 седмици. Сред тях размерът на извадката е изчислен въз основа на предишно проучване [26]. Като се има предвид двустранно ниво на значимост от 0,05 [95 процента доверителен интервал ( = 0.05)], 80 процента мощност и размер на ефекта от 0,5, анализът на мощността изчисли необходимия размер на извадката от 6 животни на група, като се приеме, че съответно ниво на ефект от 30 процента остеопороза. Освен това, с процент на отпадане от 20 процента, 8 животни на група (общо 32 плъха) се считат за идеални.

Серумни проби от плъхове
След 8 седмици плъховете се анестезират с 10 процента хлоралхидрат (400 mg/kg, интраперитонеално, Solarbio, Пекин, Китай), кръвта се събира от коремната аорта, съсирва се при стайна температура и се центрофугира при 3500 rpm/min за 10 минути. Серумът се съхранява в 1.5 mL центрофужни епруветки до следваща употреба.

Оценка на костната минерална плътност
Костната минерална плътност (BMD) се използва от DAX костен денситометър за малки животни (Ranzhe Instrument Equipment Co., Шанхай, Китай). Накратко, плъховете се поставят в легнало положение и задните крайници се позиционират навън. Дясната бедрена кост на плъховете се сканира съгласно инструкциите на производителя и се записват стойностите на BMD [27].

Морфологичен анализ на костите
В края на експеримента плъховете се евтаназират чрез интраперитонеално инжектиране на излишък от хлоралхидрат и бедрените кости се фиксират в 70% етанол. Впоследствие бяха извършени сканирания на система VivaCT 40μCT, както е описано в предишно проучване, и костен обем/общ обем (BV/TV), костен трабекуларен брой (Tb.N), костна трабекуларна дебелина (Tb.Tn) и костно трабекуларно отделяне (Tb.Sp) са оценени [28]. За евтаназия, SD плъхове бяха анестезирани след анализа на костната морфология чрез интраперитонеално инжектиране на 10% хлоралхидрат (350 mg/kg).

Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA)
Използвани са търговски комплекти ELISA за откриване на нивата на остеокалцин (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) и С-терминален телопептид (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) в серума на плъхове. Накратко, реагентите бяха отстранени при 18-25 градуса за уравновесяване и подготовка на разтвора за промиване и стандартна работа. Ензимни плаки Плаките бяха поставени със стандартни, празни и пробни ямки. Към ямките се добавят около 100 μL разтвор на разредител на пробата, инкубират се за 90 минути при 37 градуса и се заменят с биотинилирано антитяло за 60 минути при 37 градуса. След промиване се добавя ензим-свързващият работен разтвор и се инкубира в продължение на 30 минути. Добавя се субстратният разтвор (90 μL) и се инкубира в продължение на 15 минути със защита от светлина. Когато синият градиент се появи в стандартните ямки, бяха добавени 50 μL от терминиращия разтвор и беше анализирана промяната в OD450.

Обратна транскрипция-количествен PCR в реално време (RT-qPCR)
TRlzol LS реагент се добавя към серума на плъхове и MC3T3-E1 клетки, третирани с ACT, и общата РНК се екстрахира чрез инкубиране при стайна температура, последвано от добавяне на хлороформ. Концентрацията и чистотата на РНК се потвърждават чрез измерване на абсорбцията на A260/280 в спектрофотометър Nanodrop ND-1000. Комплектът за обратна транскриптаза SuperScript II беше използван за обратна транскрипция на РНК към сДНК. Впоследствие cDNA беше приложена като матрица, беше добавен праймер и SYBR-Green PCR master mix kit беше смесен и допълнен с ddH2O до 20 μL и реакцията на PCR амплификация беше извършена с помощта на Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR система (ABI, Калифорния, САЩ). GAPDH беше използван като вътрешна референция за нормализиране и относителните нива на експресия бяха изчислени с помощта на 2-ΔΔCt метод и извършени в три екземпляра. Праймерната последователност за свързан с Runt транскрипционен фактор 2 (Runx2), колаген тип I 1 (CoL1A1), рецепторен активатор на ядрен фактор-кВ лиганд (RANKL), остерикс и остеопротегерин (OPG) са представени в таблица 1.

Western-blot анализ
RIPA лизат, съдържащ 1 процент протеазен инхибитор, се добавя към клетките и общият протеин от всяка група се събира след лизиране на клетките чрез разклащане в продължение на 5 минути при 4 градуса. За количествено определяне на концентрацията на протеини във всяка група беше използван комплект за анализ на BCA. След това протеиновите проби се смесват с 10 процента буфер на натриев додецил сулфат (SDS) в равен обем и се варят във водна баня при 95 градуса в продължение на 5 минути за денатуриране на протеина. Беше приготвен 12 процента SDS-полиакриламиден вертикален гел и след като гелът се втвърди, бяха взети проби от 30 ug протеин за 120 mA 90 минути разделяне чрез гел електрофореза. След това протеинът се прехвърля върху PVDF мембраната при 90 V за 120 минути. След запечатване с 5 процента говежди серумен албумин, PVDF мембраната се нарязва на базата на молекулното тегло на маркера и целевата протеинова лента и се инкубира със съответното първично антитяло за една нощ при 4 градуса. Заешки поликлонални антитела срещу p-AKT, p-mTOR и p-PI3K се разреждат до съотношение 1:1000 (Proteintech, Wuhan, China). TBST се промива в продължение на 30 минути и се инкубира със съответното вторично антитяло, белязано с пероксидаза от хрян, при стайна температура в продължение на 1 час. Петното се визуализира с помощта на подобрени хемилуминесцентни реагенти. Плътността на протеиновите ленти се определя количествено с помощта на Image J. GAPDH се използва като контрола за изчисляване на относителните протеинови нива.

Клетъчна култура и групиране
Миши пре-остеобласти MC3T3-E1 бяха закупени от китайските колекции на тъканни култури (CTCC, Китай) и култивирани в -MEM, съдържащ 10 процента фетален говежди серум и 100 U/mL пеницилин и 100 mg/mL стрептомицин в овлажнен инкубатор при 37 градуса и 5 процента CO2. За култура на костна диференциация се прави среда за остеогенна индукция чрез смесване на 10 mM- -глицерофосфат и 50 mg/mL аскорбинова киселина (Sigma-Aldrich) с -MEM и се добавя към клетките MC3T3-E1 за индуциране тяхното обособяване. Средата се смени след 3 дни. Култури за 14 дни бяха използвани за жизнеспособност на алкална фосфатаза (ALP). Освен това, клетките бяха предварително третирани с PI3K инхибитора LY294002 (10 μM) в продължение на 30 минути, последвано от третиране с Dex и ACT.

Анализ на клетъчната жизнеспособност
Анализът с комплекта за броене на клетки-8 (CCK-8) беше извършен за оценка на жизнеспособността на остеобластите, третирани с ACT. Клетките MC3T3-E1 се инокулират в 96-ямкови плаки при 5 × 103 клетки/ямка. Количество от 1 μM от Dex беше взето предвид въз основа на предишни проучвания [29] и съвместно инкубирано с градиентни концентрации на ACT (10-8, 10-7, 10-6 и 10-5 М). Културалната среда в 96-ямковите плаки беше заменена след добавяне на смесителна среда и CCK-8 реагент в съотношение 10:1. След продължителна инкубация в продължение на 1 час при 37 градуса беше оценена промяната в OD450.

Откриване на номер на остеобластна апоптоза
Клетките MC3T3-E1, които са били подложени на различни обработки, са усвоени с помощта на трипсин без EDTA и са събрани чрез центрофугиране. След промиване с 1 × свързващ буфер се добавят 5 μL Annexin V-FITC и се инкубират при стайна температура в продължение на 5 минути, допълнени с 5 μL PI и прекарани през 200-мрежеста найлонова мрежа. Пробите бяха анализирани с помощта на система за поточна цитометрия FACScan.

Анализ на активността на ALP
Клетките MC3T3-E1 бяха инокулирани в 24-плаки с ямки и ACT и Dex бяха добавени след гипсиране. Средата за клетъчна култура беше заменена със среда за остеогенна диференциация за култура. След използване на лизис на клетки чрез разтвор за клетъчен лизис (P0012J, Beyotime Biotechnology), супернатантата се събира чрез центрофугиране и стандартната крива се начертава. Използван е комплект ALP (P0132S, Beyotime Biotechnology) за оценка на активността на ALP и е изчислена OD450.

Статистически анализ
След извършване на три независими експеримента в три екземпляра, данните бяха анализирани с помощта на софтуер GraphPad Prism 6.0 и изразени като средно ± стандартно отклонение. ANOVA беше използван за сравняване на статистически разлики между множество групи. P-стойността < 0.05 се счита за статистически различна.