Напредък в дерматологията с помощта на ДНК аптамер "Аптамин С" Иновация: Превенция на оксидативния стрес и максимизиране на ефекта на витамин С чрез антиоксиданти

joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Sooho Choi PhD1|Jeongmin Han Ph.D. Кандидат2|Ji Hyun Kim MS Candidate1|A-Ru Kim Ph.D. Кандидат3|Sang-Heon Kim Ph.D. Кандидат3|Weontae Lee Ph.D., професор2|Moon-Young Yoon Ph.D., професор3|Gyuyoup Kim PhD1|Юн-Сеонг Ким д-р, професор1

Резюме

Заден план:Витамин Ц(известен също като L-аскорбинова киселина) играе критична роля в намаляването на реактивните кислородни видове (ROS) и регенерацията на клетките чрез защита на клетките от оксидативен стрес. Въпреки че витамин С се използва широко в козметичните и терапевтични пазари, има значителни доказателства, че витамин С лесно се подлага наокислениечрез въздух, pH, температура и UV светлина при съхранение. Този дефицит на витамин С намалява неговата активност като антиоксидант и намалява срока на годност на продуктите, съдържащи витамин С като негова съставка. За да преодолеем дефицита на витамин С, ние разработихме Aptamin C, иновативен ДНК аптамер, който максимизира антиоксидантната ефикасност на витамин C чрез свързване с редуцираната форма на витамин C и забавянеокисление.

Методи:Свързването на аптамин С с витамин С се определя чрез ITC анализ. ITC експериментът беше проведен с 0.2 mmol/Lвитамин Цкойто се инжектира 25 пъти в аликвотни части от 2 µL в клетката за проба от 1,8 ml, съдържаща аптамин С в концентрация 0.02 mmol/L. Данните бяха монтирани към изотерма на свързване на едно място, като се използва програма за произход за ITC v.5.0.

Резултати:За изследване на ефекта на аптамин С ивитамин Цкомплекс в човешки кожи, бяха проведени както in vitro, така и клинични тестове. Забелязахме, че комплексът от аптамин С и витамин С е значително ефективен за подобряване на бръчките, избелващ ефект и повишаване на хидратацията. В клиничния тест субектите, третирани с комплекса, показват драматично подобрение на кожното раздразнение и сърбеж. В теста не е представена нежелана реакция от Aptamin C complex.

Заключение:Взети заедно, тези резултати показват, че аптамин С, иновативно ново съединение, потенциално трябва да се използва като ключова козмецевтична съставка за редица кожни заболявания.

КЛЮЧОВИ ДУМИантиоксидант, аптамин С (аптамер, свързващ витамин С),окисление, оксидативен стрес,витамин Ц(L-аскорбинова киселина)

цистанчепритежават силна антиоксидантна способност

1|ВЪВЕДЕНИЕ

Реактивните кислородни видове (ROS) са химически реактивни химически видове, съдържащи кислород, който играе важна роля в клетъчното сигнализиране и хомеостазата.1-3 Те включват не само положителни ефекти като индукция на защитни гени на гостоприемника и мобилизиране на системи за транспорт на йони, но също роля в апоптозата (програмирана клетъчна смърт).4,5 Нивата на ROS могат да бъдат повишени от стреса на околната среда, което води до увреждане на клетъчните структури.3 Това явление се нарича „оксидативен стрес“. Оксидативният стрес е една от водещите причини за различни заболявания, включително невродегенеративни заболявания, болестта на Лу Гериг, аутизъм, множествена склероза и кожни заболявания.6-15 Освен това оксидативният стрес има пряко влияние върху процеса на стареене на кожата16; протеините, липидите и ДНК реагират чувствително на оксидативния стрес, който се причинява от ROS.17 Антиоксидантите са много ефективни в защитата на кожата, тъй като реагират директно на ROS, като им пречат да достигнат до биологичните целеви молекули.18,19 Антиоксиданти като напр.витамин Ц, витамин Е, коензим Q10 и полифенолни съединения защитават кожата от увреждане, причинено от ROS. По този начин антиоксидантите помагат за предотвратяване и лечение на различни кожни заболявания и забавят процеса на стареене на кожата.20 Използването на витамин С в промишлеността се дължи главно на неговите антиоксидантни свойства, които са резултат отвитамин Цспособността на да неутрализира свободните кислородни радикали, чрез процес, наречен радикално поглъщане.21,22 Въпреки това, поради същите тези антиоксидантни свойства, самата молекула е присъщо податлива на разграждане чрезокисление. За да разрешим този проблем, ние разработихме Aptamin C, ДНК аптамер, който се свързва специфично с витамин C и инхибира окисляването на витамин C. Aptamers са едноверижни ДНК- или РНК-базирани олигонуклеотиди, способни селективно да свързват широк диапазон от молекули. Аптамерите обикновено се идентифицират чрез in vitro метод на селекция, наричан систематична еволюция на лиганди чрез експоненциално обогатяване или "SELEX". Установихме, че аптамин С инхибираокислениена витамин С от няколко окислителя и поддържа антиоксидантната активност при дългосрочно съхранение. За да се потвърди оценката за безопасност на Aptamin C, бяха проведени експерименти на клетъчно ниво и приложени директно върху хора и не беше наблюдавана токсичност. Кожни заболявания като атопичен дерматит, псориазис и акне са свързани с имунния отговор и ROS.23Витамин Цима способността да премахва ROS и има противовъзпалителен ефект.24 Аптамин C предотвратяваокислениена витамин c и увеличава максимално неговата ефикасност чрез бавно освобождаване. Следователно очакваме, че комплексът Aptamin C-vitamin C ще покаже синергичен ефект.

2|МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

2.1|Скрининг на аптамер срещу витамин С с намален графен-оксид

Този метод е проведен чрез модифициране на метода от предишното изследване.25 Кандидатите за ssDNA, които могат да се свързват специфично свитамин Цса разработени от произволна ssDNA библиотека, състояща се от около 1X1018 различни последователности. За ssDNA библиотеката използвахме направена по поръчка последователност, чийто размер е 60 mer и съдържа 30 произволно генерирани нуклеотидни последователности и праймерно място за амплификация (5′-ATGCGGATCCCGCGC-(N)30-GCGCGAAGCTTGCGC-3′). Извършихме общо пет кръга, докато променихме експерименталното състояние, за да изберем по-специфична последователност. Общият обем за реакцията беше 200 μL. Около 20 μL от 10 × буфер за свързване (10 × PBS добавен 10 mmol/L MgCl2), 80 μL от rGO (5 mg/mL, разреден във вода) и 200 пикомола ssDNA библиотека (20 μL от 100 μmol/L изходен материал ) се добавят и се подават dH2O до 200 μL. Реакцията продължи 30 минути, за да се свърже ssDNA библиотеката към rGO, и след това сместа беше центрофугирана при 20 000 g за 20 минути, за да се елиминира супернатантата. Пелетата rGO се промива 1 път с 200 μL свързващ буфер, който е със същата концентрация като целевото състояние на свързване на всеки кръг. За елуиране на кандидатите, 200 наномола отвитамин Цразредени в 200 μL свързващ буфер се добавят към rGO пелетата и етапът на елуиране се извършва за 1 час. Елуираната ssDNA се разделя чрез центрофугиране, което се извършва при 20 000 g за 20 минути и се амплифицира. Направихме утаяване с EtOH, за да елиминираме примесите с изключение на ssDNA преди амплификация. Направихме асиметрична PCR, за да получим амплифицирана ssDNA. Съотношението на изпращащия праймер към обратния праймер на асиметрична PCR беше 10:1. Направихме електрофореза на 2,5 процента агарозен гел, за да потвърдим PCR продукта с няколко микролитра от него. Асиметричният PCR не може да произведе само ssDNA. И така, направихме метода на смачкване и накисване, за да изолираме ssDNA кандидатите. За метода направихме електрофореза върху 12 процента полиакриламиден естествен гел и оцветихме гела с етидиев бромид (EtBr). За разделяне на двойно-верижна ДНК (dsDNA) и ssDNA, частта от гела, оцветена от ssDNA, беше изрязана, пулверизирана и екстрахирана ssDNA с буфер за смачкване и накисване (500 mmol/L NH4OAc, 0,1 процента SDS, 0,1 mmol/L EDTA) през нощта. Стритият на прах гел се отделя чрез центрофугиране. Супернатантата, която съдържа ssDNA, се концентрира и пречиства чрез утаяване с EtOH. Изсушената ssDNA беше събрана със стерилизиран dH2O и това беше използвано за следващия кръг като библиотека.

естествени съставкицистанче амазонка

2.2|Експеримент с калориметрия с изотермично титруване (ITC).

Калориметричният експеримент с изотермично титруване се провежда с помощта на VP-ITC система (MicroCal Inc Northampton) при 25 градуса във фосфатен буферен физиологичен разтвор, съставен от 1 mmol/L магнезиев хлорид (рН 7,4). Преди всеки експеримент с титруване, Aptamin C 2 mL ивитамин Ц600 µL проби бяха дегазирани за 30 минути под вакуум, без разбъркване, при температура няколко градуса под тази на експеримента. Приготвихме 0,2 mmol/L витамин С, който беше инжектиран 25 пъти в аликвотни части от 2 µL в 1,8 mL клетка за проба, съдържаща аптамин С в концентрация от 0,02 mmol/L. Данните бяха напаснати към изотерма на свързване на едно място, като се използва програма за произход за ITC v.5.0 (MicroCal Inc).

2.3|Базирани на флуоресценция анализи на микроплаки за окисляване на витамин С

Окисляваненавитамин Цсе измерва чрез откриване на окисления продукт дехидроаскорбат (DHA), като се използва модифицирана версия на метода, описан от Vislisel et al.7 При този метод DHA се открива чрез реакция с о-фенилендиамин (OPDA), за да се образува флуоресцентен кондензационен продукт 3-( дихидроксиетил)фуро[3,4-b]хиноксалин-1-он. Анализът се извършва, както следва, в черни 384-ямкови плаки (Greiner Bio-One). Аптамерите първо се разтварят във фосфатно буфериран физиологичен разтвор, pH 7,2, съдържащ 1 mM MgCl2, при концентрация от 200 µmol/L, след което се сгъват чрез нагряване до 95 градуса и се оставят да се охладят бавно до стайна температура за 15 минути. Сгънатите аптамери след това се разреждат 1:1 (v:v) в прясно приготвен разтвор от 5 mmol/Lвитамин Цв буфер за анализ [50 mmol/L натриев ацетат, 1 процент (w/v) BSA, 0,05 процента (v/v) Tween 20, 1 mM MgCl2 (Sigma, всички компоненти) коригиран до pH 5,5] и сместа се инкубира в продължение на 30 минути при стайна температура, за да се позволи на аптамерите да се свържат преди добавянето на окислител. След това се добавят окислители към разтворите на витамин С/аптамер при концентрации на (EM) H2O2 (Sigma). Окислителите бяха предварително разредени до техните работни концентрации в буфер за анализ. След това пробите се инкубират при стайна температура за 10 минути преди добавянето на OPDA (Sigma) при концентрация от 5,5 mmol/L в буфер за анализ. Непосредствено след добавянето на OPDA, флуоресценцията на пробите при 425 nm беше определена с помощта на четец на плаки SpectraMax® i3X (Molecular Devices) с възбуждане при 345 nm, в продължение на 45 минути с измервания, направени на всеки 60 секунди. Всички проби и съдове, съдържащи реагент, бяха увити във фолио, за да се предпазят от светлина по време на всички инкубации, извършени за флуоресцентните анализи.

2.4|Измерване на намаляването на витамин С с помощта на DCPIP (2,6-дихлорофенолиндофенол)

За да се определи намаляването навитамин Ц, ние проведохме експериментите, използвайки DCPIP реакцията. Витамин С реагира с DCPIP, променяйки цвета си от син на безцветен. Приготвеният витамин С се третира с 5% Aptamin CTM, а необработеният витамин С се инкубира при стайна температура в продължение на 8 седмици. Пробата беше измерена след 2, 4 и 8 седмици. Около 2 mL DCPIP се добавят към коничната колба с помощта на пипета и се добавя първият нетретиран витамин С, докато разтворът стане безцветен. Размерът навитамин Цдобавената е измерена и повторена с други проби. Степента на редукция на всяка проба се изчислява според тези данни.

2,5|In vitro изследване на ефекта против бръчки в човешки дермални фибробласти

За да се оцени клетъчната жизнеспособност в човешки дермални фибробласти, клетките бяха третирани с различни крайни концентрации на аптамин С свитамин Ц(Аптамин C ug плюс витамин C ug/mL) {{0}}.01 плюс 0.5 ug/mL, 0,1 плюс 5 ug/mL, 0,5 плюс 25 ug /mL, 1 плюс 50 ug/mL и 2 плюс 100 ug/mL. След това клетките бяха третирани при концентрации на аптамин С с витамин С за откриване на вътреклетъчен колаген, вътреклетъчна колагеназа (ММР-1) и еластазна активност.

Човешки дермални фибробласти (HDFs) бяха избрани въз основа на "Насоки за оценка на ефикасността на функционална козметика (ΙI)" на MFDS. HDFs бяха култивирани в DMEM/F12 3:1 смес с високо съдържание на глюкоза, допълнена с 10 процента FBS и 1 процент антибиотик-антимикотик в овлажнена атмосфера с 5 процента CO2 при 37˚C.

HDF (5 × 104 клетки/ямка) се посяват в 24-ямкови плаки и се инкубират в продължение на 24 часа и се третират с различни концентрации на аптамин С свитамин Ци се инкубира за 24 часа. След 24 часа супернатантата беше събрана и количеството проколаген, освободен в средата, беше измерено при 450 nm с помощта на Procollagen Type IC-Peptide (PIP) ELISA Kit. Степента на производство на колаген се калибрира по общото протеиново съдържание и се сравнява с TGF-1 като положителна контрола. Като контролен разтворител се използва среда без тестови материали.

HDF (5 × 104 клетки/ямка) се посяват в 24-ямкови плаки и се инкубират в продължение на 24 часа и се третират с различни концентрации на аптамин С свитамин Ци се инкубира в продължение на 48 часа. След 48 часа активността на колагеназата беше измерена при 450 nm с помощта на ММР-1 човешки ELISA комплект. Активността на ММР-1 беше оценена чрез общо протеиново съдържание и сравнена с TGF-1 като положителна контрола. Като контролен разтворител се използва среда без тестови материали.

Всички данни бяха изразени като средно ± стандартно отклонение и идват от 3 независими експеримента. Статистическият анализ беше извършен чрез t-тест на независими проби, използвайки софтуерната програма SPSS® (IBM) при ниво на значимост P <>

2.6|Измерване на бръчките на кожата чрез система за анализ на 3D изображения

Двадесет и две жени (средна възраст: 50,05 ± 2,94 години) участваха в това проучване. Кожните бръчки на пачия крак бяха оценени чрез система за анализ на 3D изображения в началото, 4 и 8 седмици. Хидратацията на кожата беше оценена чрез метод на капацитет, а TEWL чрез метод на водна дифузия на повърхността на кожата и еластичността на кожата чрез метод на засмукване бяха оценени в началото, 2, 4 и 8 седмици след лечението. Също така, самовъпросници относно ефикасността бяха попълнени от субекти на 2, 4 и 8 седмици, а въпросниците за използваемост бяха попълнени от субекти на 8 седмици след лечението. Всички получени данни бяха статистически анализирани със софтуер SPSS®. Параметрите на бръчките на пачия крак бяха оценени с помощта на PRIMOS® Premium (GFMesstechnik GmbH). Тази система позволява количествен анализ на грапавостта, дълбочината, площта и обема на изпъкналите върху кожата бръчки. Изображението беше анализирано в същата област по отношение на параметрите на бръчките на кожата (1, Средна дълбочина на бръчките; 2, Средна дълбочина на най-голямата бръчка; 3, Максимална дълбочина на най-голямата бръчка; 4, Обща площ на бръчките; 5, Общ обем на бръчките; 6 , Обща форма на бръчките; 7, Обща дължина на бръчките; 8, Ra; 9, Ry; и 10, Rz) в началото, 4 и 8 седмици след третиране с Primos 5.8 E ver. Софтуер.

3|РЕЗУЛТАТИ

3.1|Необходим е строг подход към подготовката на буфера, за да се извърши успешно rGO-SELEX с нестабилна цел

Библиотеката на ssDNA, която беше свързана с rGO чрез π-π взаимодействия на наслагване между ароматните пръстени на повърхността на графена и ДНК базите 26, 27 и несвързаната ssDNA на rGO, беше отделена и отстранена чрез центрофугиране. ssDNA, която беше адсорбирана върху повърхността на rGO, се елуира чрез третиране с целевото съединение. Според литературни доклади, конформацията на аптамера се променя след свързване с мишената и чрез отслабване на π-πстекинг взаимодействията с rGO.28-31 Този процес се повтаря в продължение на пет кръга. Всеки следващ цикъл протича с по-тежки буферни условия и по-кратки времена на елуиране. Това представяне ни позволи да поддържаме ssDNA с по-добра специфичност към целевите съединения.

Данните от NGS на обогатената библиотека, получена от процеса rGO-SELEX, дават 404071 последователности. Избрахме 119 последователности от тези данни, сортирахме ги в 11 групи въз основа на структурно сходство и избрахме представителни последователности за кандидати за аптамер (Фигура 1А).

3.2|Избор на аптамин С

Вторичните структури на кандидатите за Aptamin C бяха предсказани с помощта на безплатен софтуер M-Fold.32,33 Кандидатите бяха групирани по тяхната позиция, дължина, форма и брой стебло и бримка на най-високата потенциална структура (Фигура 1B). DHA, оксид навитамин Ц, се открива чрез реакцията му с о-фенилендиамин (OPDA), който играе ролята на индикатор.34 Ако аптамерът се свързва и предотвратява неговатаокисление, към витамин С и предотвратява окисляването му, флуоресцентният сигнал от 3-(дихидроксиетил)-фуро-[3,4-b] хиноксалин-1-он, кондензационният продукт на витамин С и OPDA, ще бъде по-нисък от този на контрол без аптамер. График на всеки кандидат аптамер, смесен с витамин С и окислител, с положителните контроли,витамин Цплюс окислител и последователности на разбъркване, смесени с витамин С и окислител (Фигура 1C). Доказано е, че пет аптамера, аптамин Cb, Cc, Cf, Cg и Ck имат антиоксидантни ефекти.

3.3|Инхибиране на окислението на витамин С от аптамин С

Аптамин С има висок афинитет на свързване къмвитамин Ц. Свързването на аптамин С с витамин С се определя чрез ITC анализ. От изотермата на свързване могат да се получат енталпията (ΔH), ентропията (ΔS) и стехиометрията (n) на реакцията на свързване. Екзотермичното свързване на аптамин Cb се открива от ITC измерване и енталпията (ΔH) се изчислява като 302,5 ± 3,788, ентропията (ΔS) се изчислява като 18,9, стехиометрията (n) се изчислява като 56,7 ± {{21 }}.426, а константите на дисоциация (Kd) бяха изчислени като 2,13uM за витамин С. Екзотермичното свързване на аптамин Cf беше открито от ITC измерване и енталпията (ΔH) беше изчислена като 279,2 ± 2,992, ентропията (ΔS) беше изчислена като 18,4, стехиометрията (n) се изчислява като 167 ± 1,15, а константите на дисоциация (Kd) се изчисляват като 0.89uM за витамин С. Екзотермичното свързване на аптамин Ck се открива от ITC измерване и енталпията (ΔH ) се изчислява като 250.4 ± 3,742, ентропията (ΔS) се изчислява като 19,8, стехиометрията (n) се изчислява като 82,2 ± 0,732, а константите на дисоциация (Kd) се изчисляват като 0,90 µmol/L за витамин С (Фигура 2А). Измерванията на ITC разкриват, че промяната в ентропията при свързване с аптамин С е основна движеща сила завитамин Ц. За предотвратяванеокислениена витамин С в течно състояние, всички разтвори бяха приготвени с дейонизирана вода, обработена с азот. Флуоресценцията се изразява и анализира количествено, когато OPDA (о-фенилендиамин) се свързва с DHA, генериран отокислениена витамин С. Степента на окисление на витамин С според концентрацията на аптамин С (125, 250, 500 и 1000 nmol/L) беше сравнена и потвърдена чрез OPDA анализ. Резултатите показаха, чевитамин Цпревръщането в дехидроаскорбинова киселина е по-бавно, когато концентрацията на аптамин С е по-висока. (Фигура 2B). Тези данни доказват, че аптамин С е дозозависим инхибитор на окисляването на витамин С.

Проведохме експерименти, за да определим дали Aptamin C може да предотвратиокислениевитамин С за дълъг период от време. Съвместно лечение с аптамин Свитамин Ц, и необработен витамин С бяха изложени на светлина и оставени да престоят на стайна температура в продължение на 8 седмици. В резултат на това, когато нетретираният витамин С беше оставен сам, степента на редукция беше намалена до по-малко от половината за 2 седмици и почти всички от тях бяха окислени след 4 седмици. В присъствието на Aptamin C, витамин C е намален до около половината от 8 седмици (Фигура 2C). Това предполага, че Aptamin C предотвратява окисляването на витамин C за дълъг период от време.

цистанче бодибилдинг

3.4|Анализ на активността на вътреклетъчната колагеназа (MMP-1) и колаген

При анализ на активността на колагеназата, производството на матрична металопротеиназа-1 (ММР-1) е значително намалено в зависимост от дозата, със 7.06 процента, 9,29 процента и 31,81 процента при концентрации от {{1{ {12}}}.01 плюс 0.5 ug/mL, 0.1 плюс 5 ug/mL и 0.5 плюс 25 ug/ mL, съответно (Фигура 3A). При анализ на синтеза на колаген, проколаген тип Ι карбокси-терминален пептид (PIP) е значително повишен в зависимост от дозата, с 25.{{20}} процента увеличение при 0,01 плюс 0,5 ug/mL , 41,99 процента при 0,1 плюс 5 ug/mL и 71,18 процента при 0,5 плюс 25 ug/mL (Фигура 3B).

3.5|Клинично проучване на ефектите за подобряване на бръчките върху човешката кожа

Статистическият анализ на параметрите на бръчките беше извършен от система за анализ на 3D изображения, за да се оценят ефектите за подобряване на бръчките на кожата на тестовия продукт върху човешката кожа. В сравнение с контролната група, параметърът "Средна дълбочина на бръчките" е намалял с 4,77 процента на 4 седмици и 4,25 процента на 8 седмици, параметърът "Средна дълбочина на най-голямата бръчка" е намалял с 3,37 процента на 4 седмици и 4,53 процента на 8 седмици, " Параметърът "Макс. дълбочина на най-голямата бръчка" е намален с 4,36 процента на 4 седмици и 7,19 процента на 8 седмици, параметърът "Обща дължина на бръчките" е намален с 1,61 процента на 4 седмици и 2,67 процента на 8 седмици, параметърът "Ra" е намален с 4,22 процента на 4 седмици и 3,90 процента на 8 седмици, параметърът "Ry" беше намален с 2,66 процента на 4 седмици и 7,11 процента на 8 седмици, параметърът "Rz" беше намален с 3,69 процента на 4 седмици и 6,22 процента на 8 седмици, намалението беше 3,69 процент -7,11 процента (Фигура 4).

4|ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Витамин Це комерсиално важна, но нестабилна молекула, така че подобряването на нейната стабилност е от интерес за различни пазарни сектори. Нашата работа демонстрира, че аптамин С, ДНК аптамери, потенциално удължава срока на годност и повишава ефикасността на такива продукти чрез забавяневитамин Ц окислениев разтвор. Показахме клиничната ефикасност на комплекса Aptamin C за подобряване на бръчките и хидратиране на кожата. Комплексът аптамин С също може да помогне за облекчаване на кожата при тежки.

подобряване на избелването на кожата