bgезик
Начало / знание / Съдържание

знание

Промени в транслацията на протеини и катаболните процеси на карбоксилната киселина при диабетно бъбречно заболяване

Jul 05, 2024

Резюме: Диабетно бъбречно заболяване (DKD)остава водещата причина закраен стадий на бъбречно заболяваневъпреки десетилетия на изучаване. Промени вгломерул и бъбречни тубулии двете допринасят запатогенеза на DKDвъпреки че по-голямата част от изследователските усилия са фокусирани върху гломерула. Ние се опитахме да изследваме сигнатурата на диференциалната експресия на човешката DKD в гломерула и проксималния тубул и да потвърдим нашите открития в db/db миши модел на диабет. Мрежов анализ на транскриптограма на RNAseq данни от лазерно микродисектиран (LMD) човешки гломерул и проксимален тубул на DKD иреферентна нефректомияпробите разкриват обогатени пътища, включително родопсиноподобни рецептори, обонятелна сигнализация и рибозома (протеинова транслация) в проксималния тубул на човешки проби от биопсия на DKD. Пътят на транслацията също беше обогатен в гломерула. Увеличен превод вдиабетен бъбрекs е валидиран с помощта на полирибозомно профилиране в db/db миши модел на диабет. Използвайки секвениране на единична ядрена РНК (RNA-Seq) на бъбреци от db/db мишки, ние приоритизирахме допълнителни пътища, идентифицирани в човешки DKD. Най-горният припокриващ се път, идентифициран в миши snRNAseq проксимални тубулни клъстери и човешки LMD проксимален тубулотделение е катаболизъм на карбоксилна киселина. Използвайки ултра-ефективна течна хроматография-масспектрометрия, беше установено, че пътят на катаболизъм на мастни киселини също е нерегулиран в db/db миши модел. Метаболитът Acetyl-CoA се регулира надолу в db/db мишки, привеждайки се в съответствие с човешката диференциална експресия на гените ACOX1 и ACACB. В обобщение, нашите открития показват, че проксималните тубулни промени в транслацията на протеини икатаболизъм на карбоксилната киселинаса ключови характеристики както на човека, така и намиши DKD. 



Ключови думи:подпис на генна експресия; секвениране на единична ядрена РНК;метаболомика; рибозомно профилиране

1

НОВИ БИЛКИ ЗАДИАБЕТЕН БЪБРЕК


1. Въведение

Захарният диабет (ЗД) засяга над 400 милиона души по света [1] и над 30 милиона в САЩ [2]. Диабетното бъбречно заболяване (DKD) е едно от най-сериозните усложнения на DM, засягащо 19 милиона души в Съединените щати [3], и е водещата причина закраен стадий на бъбречно заболяване(ESKD) [4]. DKD класически се разглежда като гломерулна болест; въпреки това, фокусирането единствено върху гломерулната патология като първично място на увреждане пренебрегва ключови биологични промени в тубулоинтерстициалния компартмент, които допринасят за патофизиологията на DKD [5]. Наистина, прогнозата и прогресията на DKD често са успоредни на тубулната атрофия и степента на интерстициалното заболяване [6,7]. Допълнително свързано с тази точка е доказателство, че насочването към проксималните тубули с SGLT2 инхибитори забавя прогресията на DKD [8].

Клетъчните механизми, водещи до развитието и прогресията на DKD, са сложни. Диабетната среда се характеризира с метаболитни аномалии, възпаление, оксидативен стрес и промени в протеиновата хомеостаза. Всички тези нарушения допринасят за клетъчния стрес и развитието на DKD. Има все повече доказателства, че променената транслация, основната стъпка в генната експресия, която създава функционални протеини, е важна както за реагиране, така и за допринасяне за клетъчния стрес [9,10]. Промените в транслацията допринасят за дисбаланси в протеиновата хомеостаза и оказват влияние върху човешкото здраве и болест [11–14].

Разпитването на биопсични проби от човешки бъбрек рутинно използва светлинна микроскопия, трансмисионна електронна микроскопия и имунореакции, за да позволи на патолога да постави диагноза и прогноза. Въпреки това, тези диагностични инструменти имат ограничения при разкриването на молекулярните механизми, които са в основата на бъбречното заболяване, включително DKD. Следователно, животински модели на DM исторически са били използвани за изследване на патофизиологичните механизми на DKD; въпреки това нито един от тези модели не симулира по подходящ начин човешки DKD [15]. Въпреки че неотдавнашните усилия за прилагане на по-напреднали техники за молекулярно разпитване на проби от човешки бъбречни биопсии са окуражаващи [16], ние вярваме, че използването на животински модели успоредно с човешка бъбречна тъкан остава важен експериментален подход за предоставяне на уникална представа за молекулярните основи на DKD.

Ние се опитахме да изследваме сигнатурата на диференциалната експресия на човешката DKD в гломерула и проксималния тубул. Ние предположихме, че проксималната тубуларна транскриптомна сигнатура, в допълнение към тази на гломерула, също определя резултатите от DKD. Ние разгледахме тази хипотеза, като разпитахме проби от биопсия на човешки бъбрек с лазерна микродисекция на гломерулни и проксимални тубулни региони, за да идентифицираме пътищата, свързани с DKD и неговата прогресия. След това ключовите пътища бяха потвърдени в модел на диабетна мишка, използвайки мултимодален подход на секвениране на единична ядрена РНК (RNA-Seq), полирибозомно профилиране и метаболомика. В допълнение към нарушенията в превода на протеини, нашите открития подкрепят потенциалната роля на метаболизма на карбоксилната киселина като ключов фактор в прогресията на диабетното бъбречно заболяване.

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY

2. Материали и методи

2.1. Човешки субекти

Това проучване е одобрено от Институционалния съвет за преглед на Медицинския факултет на университета в Индиана (IRB № 190657223). Двадесет и седем проби от бъбреци бяха получени от Консорциума на проекта за прецизна медицина на бъбреците и кохортата Biopsy Biobank на Индиана [17]. Бъбречните биопсии са индикация за протеинурия или намаляване на бъбречната функция при пациенти със захарен диабет. Осемнадесет проби са получени от възрастни с диабетно бъбречно заболяване и без втора гломерулна лезия. Девет референтни проби без хистологични доказателства за DKD са получени от неопластичен паренхим на проби от нефректомия или починали донори. Клиничните и хистопатологичните променливи бяха извлечени от електронното здравно досие. Базовата изчислена скорост на гломерулна филтрация (eGFR) се определя като стойността, най-близка до датата на биопсията, освен ако не се наблюдава спад от 20% или по-голям в eGFR, преципитирана биопсия. При този сценарий eGFR в рамките на 1 година преди биопсия и преди спада от 20% беше зададен като базова линия за изчисления на прогресията.


2.2. Лазерна микродисекция на човешка бъбречна тъкан и РНК-секвениране

Криосекции с дебелина 12 µm бяха изрязани от замразени тъканни блокове, запазени в среда с оптимална температура на рязане, залепени към предметни стъкла с мембрана от полифенилен сулфид (PPS) и обработени с помощта на протокол за бързо оцветяване, както е описано по-горе [18,19]. Минимална площ от 500,000 µm2 беше дисектирана за гломерулни и проксимални тубулни отделения с помощта на импулсен UV лазер на Leica LMD6500 и 20× обектив. Разчленената тъкан се събира в стерилна епруветка без РНКаза, съдържаща буфер за екстракция на РНК и РНК се изолира съгласно инструкциите на производителя (Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit, ThermoFisher, Waltham, MA, USA). Качеството на РНК се определя с помощта на Agilent 2100 Bioanalyzer.

Секвенирането е извършено в Центъра за медицинска геномика на университета в Индиана. Рибозомната РНК се изчерпва с помощта на протокола RiboGone-Mammalian Kit (Cat #634847, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA). Протоколът SMARTer Universal Low Input RNA Kit v2 (Cat #634938, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA) беше използван за cDNA синтез и конструиране на библиотека. Секвенирането беше извършено с конфигурация от 2 × 75 bp сдвоен край на Illumina HiSeq 4000, използвайки HiSeq 3000/4000 PE SBS Kit, и секвенираните данни бяха картографирани към hg38 генома, използвайки STAR. Уникално картографираните четения на секвенцията бяха присвоени на гените на референтния геном hg38 с помощта на Rsubread featureCounts [20,21].

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY



2.3. Одобрения за изследвания върху животни

Всички протоколи за животни са одобрени от Комитета за институционална грижа за животните на университета в Индиана и са в съответствие с Ръководството на Националните здравни институти за грижа и използване на лабораторни животни. За масово РНК-секвениране, полирибозомно профилиране и метаболомика, мъжки мишки щам C57BL/6J (#000664, фонова контрола/C57 мишки) и B6.BKS–Leprdb/J (#000697, db мишки) бяха получени от лабораторията Jackson ( Бар Харбър, ME, САЩ). Мишките са на възраст 9–12 седмици и тежат ~30 g (C57 мишки) или 40–50 g (db мишки). Мишките бяха умъртвени и бъбреците бяха събрани (n=4 или 5 на група).


2.4. Изолиране на бъбречна тъкан на мишка и масово РНК-секвениране

Бъбреците се замразяват бързо и РНК се екстрахира с помощта на QIAGEN RNeasy Plus Midi Kit с колона за отстраняване на геномна ДНК. Качеството на РНК се определя с помощта на Agilent 2100 Bioanalyzer. Комплектът Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit беше използван за изграждане на библиотека. Секвенирането беше извършено с конфигурация от 2 × 75 bp сдвоен край на Illumina HiSeq 4000, използвайки HiSeq 3000/4000 PE SBS Kit, и секвенираните данни бяха картографирани към mm10 генома, използвайки STAR. Уникално картографираните четения на секвенцията бяха присвоени на mm10 референтните геномни гени, използвайки функцията Rsubread Counts.



2.5. Изолиране на бъбречна тъкан на мишка и секвениране на едноядрена РНК

Бяха оценени мишки на възраст 5, 8, 11, 16 и 20 седмици (n=5 общо, BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J #000642). Хетерозиготи от същия щам бяха използвани като фонови контроли (n=3). Албуминът в урината се измерва с комплект ELISA за албумин на мишка (Bethyl Laboratories, E99-134, Montgomery, TX, USA), а креатининът в урината се измерва с комплект за анализ на креатинин QuantiChrom (Bioassay System, DICT-500, Hayward , Калифорния, САЩ). Върху леда, част от всеки бъбрек се добавя към 1 mL Nuclei EZ лизисен буфер, допълнен с 2% протеазен инхибитор (Thermofisher) и 1% Superase (Thermofisher). След смилане се добавя 1 mL буфер и тъканта се хомогенизира с помощта на KONTES Dounce Tissue Grinder (Kimble Chase, Rockwood, TN, USA). Хомогенатът се смесва внимателно с 2 mL буфер и се инкубира върху лед за 5 минути. Хомогенатът се филтрува през 40 µm филтър и се третира с лизисен буфер, допълнен с 1% Superbase, след което се филтрува отново през30 µm цедка и впоследствие ресуспендирани в PBS, допълнен с 2% BSA и 1%Супераза. След това тази суспензия се филтрува през 5µm филтър и концентрациятабеше коригирано до 1–3 милиона ядра/mL преди предаване за секвениране.
Единично ядрено 30 РНК секвениране беше извършено в Центъра за медицинска геномика на университета в Индиана с помощта на Chromium едноклетъчна система версия 3 (10× Genomics, Сан Франциско, Калифорния, САЩ) и NovaSeq6000 секвенсер (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Cell Ranger 4.0 беше използван за генериране на специфични за проби FASTQ файлове и показанията бяха подравнени към референтния геном mm10 с помощта на STAR. Seurat v 3.0.1 беше използван за интегриране на проби, като се използват следните показатели за контрол на качеството: включен брой гени между 200–3000 и процент на митохондриален ген под 50%. Общо 58 405 клетки бяха запазени за анализ надолу по веригата. Стандартна предварителна обработка, избор на характеристики, намаляване на размерите (20 основни компонента), идентифициране на котви между пробите и интегриране бяхаизвършено съгласно Seurat v3 методи за закрепване.Клъстерите бяха анотирани въз основа наобщи генни експресионни маркери [22] и използване на Kidney Cell Explorer [23]. 

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY


2.6. Изолиране на бъбречни тъкани на мишки и полирибозомно профилиране

Фоновите контролни и db мишки бяха умъртвени на възраст 9 и 12 седмици. Сърдечна перфузия през лявата камера се извършва с 6 mL циклохексимид (100 ug/mL в PBS). Събраните бъбреци веднага се поставят в лизисен буфер, състоящ се от 1% Triton X-100, 0,1% дезоксихолат, 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, коктейлна таблетка с протеазен инхибитор без EDTA (Roche, Penzberg) , Германия), 50 µg/mL циклохексимид и RNAsin (1:500 разреждане). Тъканите се хомогенизират при 4 ◦C с помощта на тъканен хомогенизатор Precellys (Precellys, Montigny-le-Bretonneux, Франция). Тъканните хомогенати се инкубират върху лед за 10 минути, след това се центрофугират при 9600 × g за 10 минути. Супернатантата беше добавена към върха на градиент на захароза, генериран от BioComp Gradient Master (10% захарозавърху 50% захароза в 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2и 50 mg/mLциклохексимид) и се центрофугира при 284,000× g за 2 часа в 4◦C. Градиентите бяха събраниотгоре в комбайн Biocomp (Biocomp Instruments, Fredericton, NB, Канада),и съдържанието на РНК в елуираните рибозомни фракции се наблюдава непрекъснато с UVабсорбция при 254 nm.



2.7. Метаболомика

За да се оценят метаболомните сигнатури, проби от фонови контролни и db мишки (n=5 на група) бяха приготвени с помощта на автоматизираната система MicroLab STAR® (Hamilton Company, Reno, NV, USA). Метаболомният анализ беше извършен в Metabolon Inc. Накратко, бързо замразени бъбречни тъкани бяха обработени следвайки стандартния метод за екстракция на Metabolon съгласно протокола на компанията. Екстрактите бяха анализирани с ултра-ефективна течна хроматография на Waters ACQUITY (UPLC) с колона C18 (Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm, 1,7 µm) и Thermo Scientific Q-Exactive висока разделителна способност/точен масспектрометър, свързан с източник на нагрята електроспрей йонизация (HESI-II) и масов анализатор Orbitrap, работещ при 35,000 масова разделителна способност.

Суровите данни бяха извлечени, идентифицирани с пикове и QC обработени с помощта на хардуера и софтуера на Metabolon (Durham, NC, USA). Пиковете се определят количествено, като се използва площта под кривата. Стандартните статистически анализи с t-теста на Welch с две проби бяха извършени в ArrayStudio върху логаритмично трансформирани данни.




2.8. Диференциална генна експресия, анализ на пътя и статистика

Данните за експресия на човешка LMD и бъбречна тъкан на мишка от РНК-секвениране бяха нормализирани квантилно и диференциалната експресия беше определена с помощта на точен тест в edgeR с p стойности < 0.05, считани за статистически значими след Benjamini-Hochberg false честота на откриване (FDR) многократна корекция при тестване. За проби от бъбрек на мишка, които са били подложени на snRNA-секвениране, диференциалната експресия е определена с помощта на Wilcoxon Rank Sum тест с коригирани Bonferroni p стойности < 0.05, считани за статистически значими. В ръкописа обаче са предоставени некоригирани p-стойности. Данните за генна експресия бяха изследвани за обогатени пътища в Gene Ontology, Kegg и Reactome, използвайки мрежов анализ на транскриптограма, както е описано по-горе [19, 24–26]. Накратко, всички гени, кодиращи протеини, независимо от p-стойността, са подредени от мрежи за взаимодействие протеин-протеин. Използван е алгоритъм на Монте Карло за групиране на гени по споделени биологични функции. Значимостта се определя с помощта на двустранен t-тест на Welch след 500 произволни пермутации за оценка на степента на фалшиви открития с p стойности < 0,05, считани за статистически значими. Тъй като само подгрупа от гени се експресира във всяка дадена клетка за snRNA-seq данни, методът на транскриптограмата не е осъществим за този тип данни. Анализът на пътя за snRNA-seq включва обогатяване на диференциално експресирани гени в Gene Ontology, Kegg и Reactome съгласно точния тест на Fisher, без да се отчитат взаимодействията на протеин-протеинова мрежа. Всички проксимални тубулни клетъчни клъстери през всички времеви точки бяха обединени, за да се идентифицират обогатени гени между контролни и db мишки. Единичният подоцитен клъстер също беше обединен във времеви точки. Този метод беше приложен и към данни за човешка RNA-seq, когато се оценяваше припокриването с набора от данни snRNA-seq. FDR-коригирани p стойности за пътища бяха използвани за идентифициране на припокриване между съвпадащи подсегменти. PAM (разделяне наоколоmedoids) се използва за групиране на човешки диабетни проби според гените, включени във всеки припокриващ се път. Различните клинични характеристики бяха определени с помощта на теста за рангова сума на Wilcoxon между групираните групи.














Може да харесаш също