Свързаният с болестта на Алцхаймер SNP Rs708727 в SLC41A1 може да повиши риска от болестта на Паркинсон: Доклад от разширено словашко проучване, част 2

2.2. Генетични анализи

Генетичните анализи бяха извършени на A1 SNPs rs11240569, rs708727 и rs823156 в кохортата от 508 пациенти с PD (срещу 150 пациенти в пилотното проучване) и групата от 472 контроли (срещу 120 контроли в пилотното проучване) [37]. По този начин броят на пациентите с PD и контролните пробанди се увеличава в това проучване съответно 3{10}}пъти и 3,9 пъти в сравнение с пилотното проучване.

Много хора изпитват загуба на памет с напредване на възрастта, но при хората с болестта на Паркинсон промените в паметта може да са по-изразени. Въпреки това, не трябва да мислим, че хората с болестта на Паркинсон са задължени да страдат от влошена памет, защото има неща, които можем да направим, за да им помогнем да запазят паметта си.

Първо, последователното извършване на някои дейности за трениране на мозъка може да помогне на хората с болестта на Паркинсон да подобрят паметта си. Тези дейности могат да включват: правене на судоку, игра на настолни игри, решаване на пъзели и др. Чрез тези дейности те могат да упражняват паметта си, да подобрят мозъчната си функция и да им помогнат да поддържат психическото си състояние.

Второ, диетата също има много важно влияние върху паметта на пациентите с болестта на Паркинсон. В диетата можем да добавим някои храни, богати на протеини и хранителни вещества, като риба, боб, ядки и др. Тези храни могат да ни помогнат да останем здрави и да подобрят паметта си.

И накрая, редовните упражнения също могат да помогнат на хората с болестта на Паркинсон да подобрят паметта си. Упражненията не само ни помагат да останем здрави физически, но по-важното, подобряват мозъчната ни функция. Чрез редовни упражнения те могат да увеличат сърдечно-белодробната си функция, да подобрят еластичността на мускулите и костите си и да подобрят паметта си.

Като цяло, дали хората с болестта на Паркинсон изпитват влошаване на паметта зависи от техния начин на живот и хранителни навици, както и от това дали обръщат внимание на неща като тренировка на мозъка и упражнения. Докато обръщаме внимание на тези аспекти, вярвам, че паметта на пациентите с болестта на Паркинсон може да бъде ефективно подобрена. Вижда се, че трябва да подобрим паметта си. Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola е традиционен китайски лекарствен материал с много уникални ефекти, един от които е да подобрява паметта. Ефикасността на мляното месо идва от различни активни съставки, които съдържа, включително карбоксилна киселина, полизахариди, флавоноиди и др. Тези съставки могат да насърчат здравето на мозъка по различни канали.

Щракнете върху познайте начините за подобряване на мозъчната функция

In the sub-cohort of 96 PD patients and 100 controls, we also examined A1 SNPs rs9438393, rs56152218, and rs61822602 (first identified in the PD sub-cohort by the Sanger sequencing and afterward by RFLP analysis of the sub-cohort of controls). They were not analyzed in the pilot study (37]. The allele and genotype count and frequencies (fq) for each particular A1 SNP in the PD and the control cohorts are summarized in Table 3. The minor allele fa was, for rs11240569 (C>A) в нашата обща кохорта (случаи на PD + контролни пробанди), приблизително сравнимо с диапазона fq на общата популация на второстепенния алел (MATPFR), отчетен от базите данни gnomAD и ExAC, както следва: fqo (наблюдавано) спрямо (отчетено) {{1 }}% ​​спрямо 29-30%.

Малкият алел fq за rs708727 (G > A) в нашата обща кохорта беше по-висок от MATPFR в базите данни gnomAD и ExAC (fq, спрямо за=40% спрямо 29-30%), но беше сравним с второстепенният алел rs708727 fq, докладван за европейското население в базата данни ALFA (41%). Малкият алел fq на rs823156 (A > G) в нашата обща кохорта беше 17% и следователно беше по-нисък от MATPFR в базите данни gnomAD и ExAC (23–30%), но беше сравним с второстепенния алел fq на rs823156, докладван за европейското население в базата данни ALFA (18%).

Честотата на второстепенния алел на rs9438393 (A > G) в общата кохорта е 40% и следователно е значително по-висока от MATPFR от 26–29%, докладван в базите данни gnomAD и TOPMED, но е сравнима с второстепенния rs9438393 честотата на алелите, докладвана в базата данни ALFA за европейското население (41%). Малкият алел на rs56152218 (T > C) в общата кохорта присъства с fq от 38%, което е в рамките на MATPFR от 32–46%, докладвано от базите данни ALSPAC, TOPMED и ALFA (Европейско население).

Интересното е, че във виетнамското, корейското и катарското население второстепенният алел е Т, а не С, както се наблюдава при европейското население [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term{{0} }rs56152218, достъпен на 2 август 2021 г.)]. Установено е, че fq на второстепенния алел в rs61822602 (G > T) е 12%. Това е сравнимо с честотите на алелите T, докладвани от базите данни ALSPAC и TWINSUK (съответно 12% и 13%), но е много по-високо от fq на алела T, отчетен в европейската популация в базата данни ALFA (6%).

Всички тествани A1 SNP в нашите PD и контролни кохорти бяха в равновесие на Харди-Вайнберг (HWE; Таблица 4).

След това изчислихме съотношенията на шансовете (OR) на второстепенния алел и генотипове, съдържащи второстепенния алел за всеки тестван SNP. Тези резултати са обобщени в таблица 5. Генотипът на GA в rs708727 е свързан с PD (OR=1.42 (1.08–1.87), p=0.01) в нашата популация. Освен това тествахме асоциацията на конкретни генотипни комбинации за всеки тестван SNP с PD в рецесивни, доминантни и напълно свръхдоминиращи генетични модели (Таблица 6). В съответствие с предишни данни, ние идентифицирахме връзка на rs708727 второстепенния алел (A) с PD в доминантни (GG срещу GA + AA) и напълно свръхдоминиращи (GG + AA срещу GA) генетични модели (ORD {{16} }.36 (1,05–1,77), p=0.02 и ORCOD=1.34 (1,04–1,72), p=0.02, съответно). Останалите SNPs не показват връзка с PD в тестваните генетични модели (Таблица 6).

Ние също така тествахме равенството на пропорциите на популацията на всяка генотипна комбинация, съставена от двойници, тризнаци, четворки, петорки или шестици на тестваните SNP в кохортата на PD (N {{0}}) и кохортата от контроли ( N=100), за да изследваме размера на ефекта от взаимодействията между тестваните A1 SNPs към податливостта за развитие на PD в нашата популация. Общо общо 12 генотипни комбинации (две дуплета, седем триплета и три четворки, таблица 7) със значително (p <0.05, 10 генотипа; p <0,06, два генотипа ) бяха идентифицирани различни преброявания в PD и контролните кохорти (Таблица 7). Следвайки критериите на Коен [39], които описват разликите в пропорциите, само триплетът GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) от 12-те генотипа показва „средна“ разлика в размера, определена от h(2arcsin√ prp1) на Коен –2arcsin√ prp2) По-голямо или равно на 0,5.

Стойността h за останалите 11 генотипа варира между 0.32 и 0.46 и по този начин е в рамките на h интервала от 0.2 до 0.5, което определя малки разлики в пропорциите (Таблица 7) [39]. Следователно, триплетът GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) може да има клинично значение и трябва да се проведат бъдещи изследвания на този генотип за чувствителност към PD. За rs11240569, rs708727 и rs823156 извършихме същия тип анализ с изходни данни от кохортата от 508 пациенти с PD и групата от 472 контроли. Четири генотипа, две двойки (GG(rs11240569) + AG(rs708727), GG(rs708727) + AG(rs823156)) и две триплети (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + AA(rs823156), (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + AG(rs823156)), със значително (p <0,05) различен брой в PD и контролните кохорти, бяха идентифицирани h на Коен, изчислен за всеки от четирите генотипа, беше под прага от 0,2 [39], и по този начин разликата между пропорциите на населението между тестваните групи беше незначителна и в четирите случая.

Стареенето, последвано от мъжкия пол, се счита за най-важният рисков фактор за появата на идиопатична PD [37]. В нашето пилотно проучване възрастта на поява на идиопатична PD в кохорта от 150 пациенти с PD не е корелирана с наличието на каквато и да е генотипна комбинация за SNPs rs11240569, rs708727 и rs823156 [37]. Тук ние корелирахме възрастта на начало на PD с (1) наличието на всяка генотипна комбинация за SNPs rs11240569, rs708727 и rs823156 в групата от 508 пациенти с PD (Фигура 2) и (2) с присъствието на всеки генотипна комбинация за SNPs rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218 и rs61822602, в подгрупата от пациенти с PD, произволно избрани от кохортата на PD за секвениране на A1 промотор (Фигура 3). Относно възрастта на начало, еднопосочен ANOVA анализ разкри, че няма значителна (p <0,05) разлика между генотипните субпопулации за всеки от тестваните SNP както в голямата кохорта на PD, така и в суб-кохортата на PD пациенти. По този начин всеки конкретен генотип в тестваните SNP не влияе върху възрастта на поява на идиопатичната форма на PD. Това е в пълно съответствие със заключението, направено в нашето пилотно проучване [37].

Извършихме също един и същ тип анализ за всеки от тестваните SNPs в подпопулации от жени и мъже, които са получени от голямата кохорта (N=508) и подкохортата (N=96 ) на пациенти с ПД. Както е показано в допълнителни фигури S1–S3, няма значима (p < 0.05) връзка между възрастта на поява и наличието на някаква конкретна комбинация от генотип в тестваните SNPs rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218, и rs61822602 в подгрупите с разделени по пол е получен или от голямата PD кохорта (NM=306, NF=202) или от PD подкохорта, избрана за A1 промоторно секвениране (NM {{20} }, NF=42).

2.3. Машинно обучение на RandomForest (RF-ML)

Всички A1 SNP бяха тествани за тяхната способност да разграничават пациенти с PD и контроли с RF-ML. Алгоритъмът RF-ML беше обучен с помощта на нашите данни и беше оценено разграничителното значение на отделните SNP чрез техническа конструкция, известна като дълбочина на графиката [37,40]. Както в нашето пилотно проучване [37], предсказващата способност на тестваните SNPs беше визуализирана и количествено определена чрез ROC (работна характеристика на приемника) криви и съответно чрез AUC (площ под ROC крива). Дискриминационната способност на предикторите е дадена в рамките на интервала на AUC от 100% (максимална дискриминационна способност) до 50% (минимална дискриминационна способност); AUC < 50% съответства на липса на разграничителна способност.

RF алгоритъмът беше обучен в следните режими: (1) с три или шест (Таблица 8) конкретни A1 SNPs (всеки SNP, три генотипа (AMAM/AMAm/AmAm, където AM означава основен алел и Am за второстепенен алел), като предиктор (три или шест RF модела, по един за всеки SNP), (2) с генотипни дублети на сдвоените SNP като предиктори (три RF модела (три SNP) или 15 RF модела (шест SNP), по един за всяка двойка от SNP; Таблица 8), (3) с генотипни триплети от трите SNP като предиктори (един RF модел (три SNP) или 20 RF модела (шест SNP), по един за всеки триплет от SNP; Таблица 8), (4) с генотипни четворки на шестте SNPs като предиктори (15 RF модела, по един за всяка четворка; Таблица 8), (5) с генотипни петорки на шестте SNPs като предиктори (шест RF модела, по един за всеки квинтуплет; Таблица 8) и ( 6) с генотипна шесторка (един RF модел, таблица 8).

По този начин, когато единични, двойни, тризнаци, четворки, петорки и шестици на A1 SNP бяха използвани като предиктори, те нямаха способност да разграничават пациентите с PD и контролите (Таблица 8). Следователно, според RF-ML анализа и в съгласие с пилотното проучване [37], A1 SNPs нямат потенциал да служат като дискриминатори между контролите и пациентите с PD и, относно PD, нямат предсказуема или диагностична стойност в словашкото население .

3. Дискусия

Локусът PARK16 привлече вниманието в научната общност поради връзката си с PD и обсъжданата му роля при определянето на чувствителността към това сложно заболяване. През 2019 г. докладвахме за пилотно проучване, в което анализирахме връзката на трите A1 SNPs, а именно rs11240569, rs708727 и rs823156, с идиопатичната форма на PD в словашкото (западно славянско) население. Докладваната асоциация на rs11240569 и rs823156 с чувствителност към PD главно в азиатски/ориенталски популации не беше открита в нашето проучване [37]. Никаква връзка не може да бъде потвърдена с помощта на честотни статистики (консервативни генетични анализи) или чрез RF-ML анализ [37].

Основното ограничение на нашето пилотно проучване обаче беше относително ниският брой пациенти/пробанди в PD и контролните кохорти (съответно 150 и 120). Подчертахме, че от статистическа гледна точка данните трябва да се тълкуват предпазливо поради малкия размер на извадката в двете кохорти и поради ниската статистическа мощност на извършените анализи [37]. Независимо от това, чрез използване на ML подхода, който изисква значително по-малки размери на извадката от конвенционалната честотна статистика или приблизителното байесово изчисление, ние успяхме да проучим с увереност способността на конкретни A1 SNPs да разграничават пациентите с PD и контролите. Във всички случаи подходът на ML разкри по същество нулева диагностична и предсказваща значимост на SNPs rs11240569, rs708727 и rs823156 в словашкото население [37].

В това проучване ние изследвахме не само трите гореспоменати SNP, но и трите SNP (rs9438393, rs56152218 и rs61822602), локализирани в промоторната област на A1. Тези SNP са идентифицирани чрез секвениране на 96 PD проби, последвано от RFLP анализ на контролните проби и RFLP проверка на секвенираните PD проби. Нашите генетични анализи не разкриха по същество никаква връзка на нито един от трите новоизследвани SNPs с PD. Същото важи и за rs11240569 и rs823156, които са анализирани в PD и контролни подкохорти (96/100), а също и в кохортите от 508 пациенти с PD и 472 контроли. Тези резултати са в пълно съгласие с резултатите от пилотното проучване [37]. Въпреки това, в големите кохорти, rs708727 е свързан с повишен риск от PD в словашкото население.

Доколкото ни е известно, нито едно проучване все още не е свързвало директно A1 SNP rs708727 с променен риск за развитие на PD [19,37]. В нашето разширено проучване (в сравнение с пилотното проучване [37]), второстепенният алел А в rs708727 е свързан с повишен риск от поява на PD, когато се тества в доминантен [40] (ORD=1.36 (1,05– 1.77), p=0.02) или напълно свръхдоминиращи [41] (ORCOD=1.34 (1.04–1.72), p=0.02) модели (Таблица 5). По този начин наличието на второстепенния алел (A) в rs708727 може да бъде свързано с повишен риск от развитие на PD. Докато Sanchez-Mut et al. [27] и Wang et al. [42] ясно показаха, че присъствието на второстепенния алел А в rs708727 променя метилирането на промотора PM20D1 (и, следователно, неговата експресия) по дозозависим (количествен) начин, най-подходящите генетични модели в нашето изследване показват, че наличието на един алел rs708727 A е достатъчно, за да промени чувствителността към появата на PD. PD-чувствителността (фенотип), относно това дали едно или две копия на второстепенния алел присъстват в rs708727 (генотип), остава да бъде допълнително изяснена в подробности.
Санчес-Мут и др. са идентифицирали PM20D1 (локализиран в PARK16 локуса и кодиращ за пептидаза M20-домейн, съдържащ протеин един ензим с хидролазна и пептидазна активност; N-мастна ацил аминокиселина синтаза/хидролаза) като количествена характеристика на метилиране и експресия локус (mQTL), свързан с хаплотип, свързан с AD-риск, който показва подобни на усилвател характеристики и контактува с PM20D1 промотора чрез зависима от хаплотип, CTCF (CCCTC-свързващ-) транскрипционен фактор медиирана хроматинова верига [27]. Чрез сравняване на проби от здрави контроли и пациенти с AD в напреднал стадий, те са открили, че PM20D1 постоянно показва хиперметилиране на промотора при пациенти с AD [27]. A1 SNP rs708727 корелира с нивата на PM20D1 ДНК метилиране в човешкия фронтален кортекс и хипокампус [27], както и SNP rs960603 [27]. Уанг и колеги, в работата си върху периферната кръв, са придобили данни, потвърждаващи, че PM20D1 е mQTL, медииран предимно от свързания с риска от AD A1 SNP rs708727 [42].

Освен това, техните надлъжни данни показват, че хипометилирането се случва преди симптоматичното начало на AD, вероятно за да се улесни нарастващата експресия на PM20D1 за активиране на неговата защитна функция [42]. Напредъкът на AD се характеризира с нарастващо ниво на метилиране в CpG островите в DMR (диференциално метилирана област) на промотора PM20D1 при пациенти с AD, което в крайна сметка води до инхибиране на генната транскрипция и експресия [27,42,43]. PM20D1 също е свързан с диабет [44], затлъстяване [45] и множествена склероза [46], и тъй като е локализиран в локуса PARK16, се предполага неговото възможно участие/асоцииране с PD [47].

Въпреки липсата на молекулярни механистични анализи, ние спекулираме, в светлината на настоящите ни данни, че AD и PD (и други по-редки невродегенеративни заболявания) споделят не само „добре познати“ патофизиологични механизми (напр. нарушена митофагия, ретромер и протеазома функции), но също и епигенетични механизми, като A1 rs708727-зависима регулация на експресията на PM20D1 [27,42]. Нашата работа индиректно добавя към необходимостта от подробно изясняване на ролята на ендогенните N-ацил аминокиселини (NAAs), които се метаболизират от PM20D1 в патобиологията на PD и други невродегенеративни разстройства. Сега е известно, че NAAs и N-ацилните конюгати на невротрансмитерите (NAANs) играят важна роля в невромодулацията [48,49]. Доказателство, свързващо експресията на PM20D1 с N-ацил допамин (NADA), е предоставено от скорошната работа на Song et al. Тези автори са показали, че делецията на kir6.2 (порообразуваща субединица на ATP-чувствителните К+ канали) води до намален брой митохондрии и понижено производство на АТФ чрез повишаване на нивата на PM20D1 и на агенти, разединяващи митохондриалното дишане , включително NADA, в миши среден мозък [49].

NADA е мощен инхибитор на 5-липоксигеназата (5-LOX) и има разпространение, ограничено до мозъка, като нивата са най-високи в стриатума и много ниски другаде [48,50,51]. 5-LOX катализира синтеза на левкотриен или 5-HpETE (5-хидроперокси ейкозатетраенова киселина) от арахидонова киселина и се свързва с невродегенерация (AD и PD) чрез участието си в невровъзпаление [51, 52]. Следователно предполагаме, че намалената експресия на PM20D1, последващото по-ниско изобилие на NADA и повишената активност на 5-LOX значително допринасят за патологията на PD (и други невродегенеративни заболявания).

Sanchez-Mut и колегите са показали, че свръхекспресията на PM20D1 в хипокампуса на миши AD води до подобряване на обучението, докато нейното събаряне увеличава натоварването на амилоидната плака [27]. Както типът Lewy, така и патологията тип Alzheimer са важни при деменция, свързана с PD [53]. Значителна група пациенти с PD страдат от влошаваща се деменция по време на заболяването [54]. Като вземаме предвид тези наблюдения, ние спекулираме дали свързаната с rs708727-активност, която заглушава PM20D1, допринася за появата на PD-деменция и дали мониторингът на активността на PM20D1 може да служи като прогностичен параметър за появата на PD-деменция.

По-рано публикувана работа предполага участието на Mg2+ транспортери в патобиологията на PD [18–22,55]. A1, като ключов играч в Mg хомеостазата на соматичните клетки, е свързан директно с PD [20–22]. Точковите мутации в A1, водещи до замествания p.A350V, p.R244H и p.R285Q, предполагаемо се свързват с PD и се предполага, че както липсата на функция, така и загубата на функционални мутации в A1 имат вредни последици в невроните, като по този начин допринасящи за фенотипа на PD [20–22]. Тази работа косвено сочи към възможността, че не само смущенията на основната функция на A1 (обмен на Na+/Mg2+), но също и A1-свързаната (rs708727) епигенетична регулация на експресията (и активността) на PM20D1, допринасят за патобиологията на PD.

В това проучване ние идентифицирахме генотипния триплет GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) като потенциално клинично значим (h По-голямо или равно на 0,5). Интересното е, че rs708727 с генотип GG е част от триплета. Въпреки това, в светлината на предишни изследвания, се очаква генотипът, съдържащ второстепенния алел А в rs708727, да бъде свързан с потенциален риск от PD, свързан с този триплет. Понастоящем не сме в състояние да коментираме каквито и да било молекулярни/генетични/епигенетични взаимодействия, включващи SNPs в триплета GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602), и по този начин, относно всеки предполагаем принос на този триплет към сумата на риска от поява на ПД.

В нашето пилотно проучване използвахме RF-ML, за да оценим и интерпретираме нашите данни [37]. Основното предимство на RF-ML анализа на данни е двойно, както следва: (1) той позволява разграничителната способност на SNPs между пациенти с PD и контроли да бъде количествено определена [37], и (2) изисква по-малки размери на извадката за оценка на дискриминационното значение на отделните SNP или техните комбинации [37]. Освен това RF-ML заобикаля проблема с p-стойността, често свързан с по-големи проби, дори когато те са налични [56]. Както в предишния ни доклад, нито един от тестваните A1 SNPs не е показал, че има силата да прави разлика между пациенти с PD и пробанди без PD в нашата кохорта (Таблица 8). По този начин можем да предположим, че нито един от тестваните A1 SNPs не е подходящ да служи като PD/non-PD дискриминатор в словашкото население.

По отношение на връзката на A1 rs708727 с променен риск за PD, резултатът от нашия RF-ML анализ изглежда на пръв поглед противоречив (Таблици 5 и 6 срещу Таблица 8). Jakobsdottir и др. в техните анализи на логистична регресия и ROC крива показаха, че дори силните генетични асоциации не гарантират автоматично ефективна дискриминация между случаите и контролите [57]. Въпреки че са лоши класификатори, SNP със значителни OR могат да бъдат много ценни за установяване на етиологични хипотези [57]. В нашия случай A1 SNP rs708727 няма класификационна сила по отношение на PD, следователно няма клинично значение. Въпреки това, неговата слаба, но значителна връзка с променения риск за PD ни позволи да спекулираме за участието на rs708727 в патобиологията на PD по подобен или същия начин, както е включено в AD [27].

4. Материали и методи

4.1. Участници в проучването (основни характеристики)

Общо 980 пробанди бяха включени в проучването (508 пациенти с PD и 472 контроли, отговарящи на критерии за приобщаване). Идиопатичната форма на PD е диагностицирана от невролози в пет диагностични центъра за PD (в Мартин, Братислава, Тренчин, Зволен и Кошице) съгласно критериите за диагностика на PD на MDS (Обществото за двигателни разстройства). Всички пациенти са лекувани със стандартна анти-PD терапия. Средната възраст на пациентите с ПД е 68,4 ± 9,6 години. Средната възраст на начало на заболяването е 61,7 ± 10,7 години. Най-младият случай е диагностициран на 34 години, а най-старият случай на 89 години. Групата с PD се състои от 202 жени (F) и 306 мъже (M) пациенти и по този начин съотношението F:M е 1:1,5.

Контролната група от пробанди се състоеше от външни и вътрешни пациенти от Клиниката по трудова медицина и токсикология (Университетска болница Мартин (UHM)) и Неврологичната клиника (UHM). Само онези пациенти, които преди това не са били диагностицирани с някакво невродегенеративно и невропсихиатрично заболяване, като захарен диабет или остеопороза (всички заболявания, предполагаемо свързани с променена експресия на А1 и дерегулация на функцията на А1), бяха включени в контролната проучвателна група. Средната възраст на контролните пробанди е 68,3 ± 11,6 години. Контролната група се състои от 208 женски и 264 мъжки индивида и по този начин съотношението F: M е 1: 1,3 в контролната група.

Подгрупата от пациенти с PD, в които A1 промоторната област е секвенирана, се състои от 96 произволно избрани субекта. Съотношението F:M е 1:1,3 (42 жени и 54 мъже). Средната възраст на пациентите в подгрупата на PD е 67.{{10}} ± 9,5 години. Контролната подгрупа се състои от 41 жени и 59 мъже, като по този начин съотношението F:M е 1:1,4. Средната възраст на пробандите в контролната подгрупа е 59,8 ± 5,0 години.

Това проучване е одобрено от Комитета по етика към Факултета по медицина Jessenius, Университет Коменски (JFM CU). Одобрението е записано под ID: EK 66/2019. Всички участници в проучването са подписали формуляри за информирано съгласие.

4.2. Обработка на проби

Кръвните проби бяха събрани в третирани с EDTA BD Vacutainer® епруветки (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ USA). Геномна ДНК се изолира от пресни (UHM) или замразени кръвни проби (други центрове за PD) чрез използване на Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation, Maddison, WI, USA) съгласно протокола на производителя. Изолираните ДНК проби се съхраняват при -80 ◦C.

4.3. Генотипизиране

Генотипирането е извършено на 358 PD проби и 352 контролни проби. Резултатите от тези експерименти бяха анализирани заедно с резултатите, докладвани по-рано от Cibulka et al. [37]. SNPs rs11240569, rs708727 и rs823156 бяха анализирани с помощта на сонди за генотипизиране на TaqMan® C_34251_20/rs11240569, C_375742_10/rs823156 и C_9238453_10/rs708727 (всички Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA) по същия начин, както беше съобщено по-рано [37].

4.4. Секвениране на Sanger

Промоторният регион беше разделен на четири припокриващи се фрагмента/ампликони, тъй като беше твърде дълъг за едно секвениране. Преди да бъдат секвенирани, целевите региони бяха амплифицирани. Праймерите са проектирани с помощта на онлайн инструмента Primer3Plus [https:// primer3plus.com/cgi--bin/dev/primer3plus.cgi (достъпен на 3 май 2018 г.)]. Всяка двойка праймери беше проверена за наличие на множество продукти на амплификация от PCR онлайн инструмента UCSC [http://www.genome.ucsc.edu/cgi--bin/hgPcr (достъп на 3 май 2018 г.)].

Праймерите и PCR програмите, използвани за амплификация на четирите фрагмента, са обобщени в допълнителни таблици S1 и S2. Съставите на главните смеси за всеки фрагмент са обобщени в SA3. Фрагменти 3 и 4 имат високо съдържание на G и C нуклеотиди (съответно 67,4% и 71,9%). Реакционният добив се увеличава чрез добавяне на 10 × GC Rich Enhancer (Solis Biodyne, Тарту, Естония). PCR продуктът се пречиства чрез използване на NucleoSpinTM Gel и PCR Clean-up комплект (Macherey-Nagel GmbH&Co. KG, Düren, Германия). В следващия етап пречистеният PCR продукт се разрежда до подходяща концентрация за предварително секвениране на PCR (SA4, SA5). Само предни (fw) праймери бяха използвани в PCR за предварително секвениране. Реакционната смес включва също BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) и дидезоксинуклеотиди.

В резултат на това получихме смес от продукти с различни размери, завършени с маркирани с флуоресценция дидезоксинуклеотиди. Впоследствие продуктите бяха пречистени чрез използване на комплекта SigmaSpin Sequencing Reaction Clean-Up kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) съгласно протокола на производителя. Обем от 3 µL пречистен продукт се прехвърля в 96-плочка с ямки заедно с 12 µL висококачествен дейонизиран формамид (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Сместа се денатурира в продължение на 5 минути при 95 ◦C в термоциклер. Фрагментите бяха разделени на 8-микрокапилярно устройство ABI 3500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Последователностите бяха експортирани и визуализирани от софтуер Chromas (Technelysium Pty Ltd., Южен Бризбейн, Австралия). Файловете FASTA бяха качени в BLAST (Инструмент за търсене на основно локално подравняване) и подравнени към референтния човешки геном (версия GRCh38.p12).

Прогнозирането на местата за свързване на транскрипционния фактор и техните промени беше извършено от онлайн инструмента ConSite [достъпен на: http://consite.genereg.net/ (достъпен на 3 септември 2020 г.)] [38]. Бяха качени последователности с главния алел и второстепенния алел и бяха генерирани спектри на транскрипционните фактори (TF). Анализът беше проведен без предварително задаване на минимална специфичност. Промените в TF-свързващите профили въз основа на наличието на варианти са обобщени в таблица 2.

4.5. RFLP (полиморфизъм на дължината на рестрикционния фрагмент) анализ

Компонентите на реакционната смес и PCR условията на амплифицираната PCR са обобщени в SA6 и SA7. Онлайн in silico инструментът NEBCutter 2.0 [http://nc2.neb.com/NEBcutter2 / (достъп на 14 февруари 2020 г.)] беше използван за проектиране на ограничения на ампликоните. Следните рестрикционни ензими бяха избрани за RFLP анализ: Hpy166II (откриване на rs9438393), NIaIII (откриване на rs56152218) и BmrI (откриване на rs61822602). Всички ензими са закупени от New England Biolabs. За вариант rs144056491 не успяхме да проектираме RFLP експеримент, тъй като не беше наличен подходящ ензим. След ограничение очаквахме фрагментите, обобщени в SA8, да формират добива. След рестрикция, продуктите се разделят чрез електрофореза в агарозен гел (NIaIII и Hpy166II 1% гел; BmrI 2% гел) и след това се визуализират на PharosFX инструмент (Bio-Rad Laboratories). Бяха определени генотипове за всеки SNV.

4.6. Анализ на данни

Данните бяха изследвани и анализирани с помощта на R [R Core Team (2021); R: език и среда за статистически изчисления. R Foundation for Statistical Computing, Виена, Австрия. URL https://www.R-project.org/, вер. 4.0.5 (2021-03-31)]. Изследване на генетична асоциация (GAS) и анализ на мощността бяха извършени с помощта на R библиотеки HardyWeinberg [Jan Graffelman (2015); Изследване на диалелни генетични маркери: Пакетът HardyWeinberg. Journal of Statistical Software, 64(3), 1-23. URL https://www.jstatsoft.org/v64/i03/], DescTools [Andri Signorelli et al. (2021); DescTools: Инструменти за описателна статистика. Версия на R пакет 0.99.41.], epitools [Tomas J. Aragon (2020); epitools: Епидемиологични инструменти. R пакет версия 0.5-10.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=epitools], pwr [Stephane Champely (2020); pwr: Основни функции за анализ на мощността. R пакет версия 1.3-0. URL https://CRAN.R-project.org/package=pwr] и вътрешно разработен код. Прогнозното моделиране на RandomForest беше извършено с R библиотека randomForestSRC [Ishwaran H. и Kogalur UB (2021); Бързи унифицирани случайни гори за оцеляване, регресия и класификация (RF-SRC), R пакет версия 2.11.0.]. Данните бяха визуализирани от R библиотека beeswarm [Aron Eklund (2021); beeswarm: The Bee Swarm Plot, алтернатива на Stripchart. R пакет версия 0.3.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=beeswarm]. Еднопосочната ANOVA беше използвана за тестване на нулевата хипотеза за равенство на средната възраст на популацията за трите генотипови субпопулации за всеки SNP. Констатации с p-стойност под 0,05 се считат за статистически значими.

5. Изводи

В обобщение, нашите данни предполагат слаба, но значителна връзка на A1 SNP rs708727 с PD в доминиращи и свръхдоминиращи генетични модели в словашко население. Нито един от другите тествани A1 SNP (rs11240569, rs823156, rs9438393, rs56152218 и rs61822602) не е свързан с болестта в нито един от тестваните генетични модели. RF-ML анализите идентифицираха всички тествани A1 SNPs като лоши класификатори/предсказатели на PD, като по този начин тяхното използване в клиничната практика като диагностични или прогностични маркери остава незначително. Въпреки това, асоциирането на rs708727 с PD ни позволи да спекулираме, че свързаният с риска от PD минорен алел (G > A) в rs708727 допринася за началото и прогресията на заболяването чрез нарушение на епигенетичната регулация на експресията на PM20D1, механизмът, за който е известно, че играе роля в патобиологията на AD. Тази хипотеза трябва да бъде допълнително проучена, за да се направи убедително изявление. Освен това трябва да се изясни възможна връзка между деменция, свързана с PD, и rs708727.

Авторски принос:

Концептуализация, МК; методология, MK, MC, MG (Мариан Грендар) и MB; софтуер, MG (Мариан Грендар); валидиране, MC, MB и MK; формален анализ, MK, MG (Мариан Грендар), MC, AS, ZL, ZP, TS, SS и MG (Milan Grofik); разследване, MC и MB; обработка на данни, MC, MB, MG (Мариан Грендар), MG (Милан Грофик), JN, VN и EK; писане—изготвяне на оригинална чернова, МК; писане—преглед и редакция, MC, MG (Мариан Грендар) и ZP; визуализация, МК, МС и MG (Мариан Грендар); надзор, МК; администриране на проекти, MC, MK, MG (Milan Grofik), JN, JB, VH, VN, EK, MS и BV; придобиване на финансиране, MK Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране:

Тази работа беше подкрепена от Словашката агенция за изследвания и развитие, грант номер APVV-19-0222 и Агенцията за научни грантове към Министерството на образованието, науката, изследванията и спорта на Словашката република и Словашката академия на науките, грант номер VEGA 1/0554/19 г., двете към М.К

Изявление на институционалния съвет за преглед:

Проучването е одобрено от Комитета по етика към Факултета по медицина Jessenius, Университет Коменски (JFM CU). Одобрението е записано под ID: EK 66/2019.

Декларация за информирано съгласие:

Беше получено информирано съгласие от всички участници в проучването.

Декларация за наличност на данни:

Пълният набор от данни се съдържа в статията. Естеството и обхватът на включените данни позволяват допълнителен мета-анализ. Всякаква информация относно изследването е достъпна при поискване от съответния автор.

Благодарности:

Благодарим на всички участници в проучването и членовете на техните семейства. Благодарим и на Мартин Марак (JFM CU) за неговата компетентна техническа поддръжка на проекта, на Ян Радвански и Растислав Хекел (и двамата GENETON sro) за полезни съвети относно анализите на промоторите на A1 и на Тереза ​​Джоунс за езиковото редактиране на ръкопис.

Конфликти на интереси:

Авторите декларират липса на конфликт на интереси.

Препратки

1. Татаркова, З.; de Baaij, JHF; Грендар, М.; Aschenbach, JR; Racay, P.; Bos, C.; Спондер, Г.; Hoenderop, JGJ; Рьонтген, М.; Турцанова Копрусакова, М.; et al. Диетичният прием на Mg2+ и Na+/Mg2+ обменникът SLC41A1 влияят върху компонентите на митохондриалната енергетика в миши кардиомиоцити. Вътр. J. Mol. Sci. 2020, 21, 8221. [CrossRef] [PubMed]

2. Яманака, Р.; Табата, С.; Shindo, Y.; Хота, К.; Сузуки, К.; Сога, Т.; Oka, K. Митохондриалната Mg2+ хомеостаза решава клетъчния енергиен метаболизъм и уязвимостта към стрес. Sci. Rep. 2016, 6, 30027. [CrossRef] [PubMed]

3. Дудев, Т.; Grauffel, C.; Lim, C. Как местните и чужди метални катиони свързват ATP: Последици за лития като терапевтичен агент. Sci. Rep. 2017, 7, 42377. [CrossRef] [PubMed]

4. Колисек, М.; Журка, Г.; Samaj, J.; Weghuber, J.; Schweyen, RJ; Schweigel, M. Mrs2p е основен компонент на основната електрофоретична система за приток на Mg2+ в митохондриите. EMBO J. 2003, 22, 1235–1244. [CrossRef] [PubMed]

5. Шиндл, Р.; Weghuber, J.; Romanin, C.; Schweyen, RJ Mrs2p образува Mg2+ селективен канал с висока проводимост в митохондриите. Biophys. J. 2007, 93, 3872–3883. [CrossRef] [PubMed]

6. Колисек, М.; Спондер, Г.; Пилчова, И.; Цибулка, М.; Татаркова, З.; Вернер, Т.; Racay, P. Magnesium Extravaganza: Критичен компендиум от текущи изследвания на клетъчни Mg2+ транспортери, различни от TRPM6/7. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2019, 176, 65–105. [CrossRef]

7. Кубота, Т.; Shindo, Y.; Токуно, К.; Komatsu, H.; Ogawa, H.; Кудо, С.; Китамура, Й.; Сузуки, К.; Oka, K. Митохондриите са вътреклетъчни магнезиеви магазини: Изследване чрез едновременно флуоресцентно изобразяване в PC12 клетки. Biochim. Biophys. Acta 2005, 1744, 19–28. [CrossRef]

8. Спондер, Г.; Абдулханан, Н.; Fröhlich, N.; Мастрототаро, Л.; Aschenbach, JR; Рьонтген, М.; Пилчова, И.; Цибулка, М.; Racay, P.; Kolisek, M. Свръхекспресията на Na+/Mg2+ обменника SLC41A1 отслабва сигнализирането за оцеляване. Oncotarget 2017, 9, 5084–5104. [CrossRef] [PubMed]

9. Ямагучи, Х.; Wang, HG Протеин киназата PKB/Akt регулира клетъчното оцеляване и апоптозата чрез инхибиране на конформационната промяна на Bax. Oncogene 2001, 20, 7779–7786. [CrossRef]

10. Vauzour, D.; Vafeiadou, K.; Rice-Evans, C.; Уилямс, RJ; Spencer, JP Активирането на про-оцеляване Akt и ERK1/2 сигнални пътища са в основата на антиапоптозните ефекти на флаваноните в кортикалните неврони. J. Neurochem. 2007, 103, 1355–1367. [CrossRef]

11. Muddapu, VR; Дхаршини, SAP; Чакраварти, VS; Громиха, М. М. Невродегенеративни заболявания — Метаболитният дефицит ли е основната причина? Преден. Neurosci. 2020, 14, 213. [CrossRef] [PubMed]

12. Патак, Д.; Berthet, A.; Накамура, К. Енергийна недостатъчност: допринася ли за невродегенерация? Ан. неврол. 2013, 74, 506–516. [CrossRef] [PubMed]

13. Дхаршини, SAP; Тагучи, YH; Gromiha, MM Изследване на енергийната криза при болестта на Алцхаймер чрез изследване на транскриптоми. Sci. Rep. 2019, 9, 18509. [CrossRef] [PubMed]

14. Клонка, Г.; Shirihai, OS Взаимодействието между митохондриалната динамика и митофагията. Антиоксид. Редокс сигнал. 2011, 14, 1939–1951. [CrossRef] [PubMed]

15. Джао, В.; Джан, В.; Ма, Х.; Yang, M. NIPA2 регулира функцията на остеобластите чрез модулиране на митофагията при остеопороза при диабет тип 2. Sci. Rep. 2020, 10, 3078. [CrossRef]
16. Надлер, MJ; Hermosura, MC; Инабе, К.; Perraud, AL; Zhu, Q.; Стоукс, AJ; Куросаки, Т.; Kinet, JP; Penner, R.; Scharenberg, AM; et al. LTRPC7 е Mg. ATP-регулиран двувалентен катионен канал, необходим за жизнеспособността на клетките. Nature 2001, 411, 590–595. [CrossRef]

17. Колисек, М.; Nestler, A.; Vormann, J.; Schweigel-Röntgen, M. Човешки ген SLC41A1 кодира Na+/Mg2+ обменника. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2012, 302, C318–C326. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com