Ефективен метод за лечение на бъбречна фиброза
Mar 17, 2022
за повече информация:ali.ma@wecistanche.com
Част Ⅰ: Протеинът на ендоплазмения ретикулум TXNDC5 насърчава бъбречната фиброза чрез налагане на TGF-сигнализиране в бъбречните фибробласти
Yen-Ting Chen, Pei-Yu Jhao и др.
Въведение
Бъбречна фиброза, характеризиращ се с тубулоинтерстициаленфиброзаи гломерулна склероза, е често срещана патологична проява на повечето, ако не и на всички видовехрониченбъбрекзаболявания(CKD) (1). Прогресията набъбречнафиброзапри пациенти с ХБН води до постепенна загуба набъбрекфункция, което в крайна сметка може да доведе до краен стадий на бъбречно заболяване (ESRD), което изисква диализа илибъбректрансплантация (2). Въпреки че е доказано, че множество молекулярни детерминанти и пътища допринасят за процеса нафиброза на бъбреците, трансформиращият растежен фактор-бета (TGF-) обикновено се счита за главен регулатор на бъбречната фиброгенеза (3). След нараняване набъбрек, увредените тубулни епителни клетки (TECs) се спират във фазата G2/M и секретират големи количества TGF-, задействайки активирането и трансформирането на съседни бъбречни фибробласти в миофибробласти (4-6). Активираните миофибробласти, характеризиращи се с експресията на а-гладкомускулен актин (SMA), са силно пролиферативни и произвеждат извънклетъчни матрици (ECM) протеини като фибриларен колаген, еластин, фибронектин и CCN2 (известен като фактор на растежа на съединителната тъкан, CTGF)(7,8). По време на ранните етапи на бъбречно увреждане,фиброзае иницииран като адаптивна и самоограничена физиологична реакция, която помага за възстановяването на тъканите и поддържането на структурната цялост (9). Въпреки това, след хронично, повтарящо се бъбречно увреждане, активирането и пролиферацията на миофибробластите продължават, което води до прекомерно производство и натрупване на ECM, което води до загуба на функционален бъбречен паренхим и в крайна сметка до бъбречна недостатъчност (1O,11).
Щракнете върху Cistanche para que sirve за бъбречно заболяване
Въпреки напредъка на съвременната медицина, малко клинични терапии са доказано ефективни срещуфиброза на бъбреците. Доказано е например, че инхибиторите на ангиотензин-конвертиращия ензим (ACEI) и блокерите на ангиотензин рецепторите (ARB) намаляват протеинурията, подобряватбъбречнафиброза, и забавят прогресията на ХБН (12,13). Пентоксифилинът, неспецифичен инхибитор на фосфодиестераза, от друга страна, е доказано, че инхибира индуцираната от TGF- 1- ECM и CCN2 експресия, което води до атенюирана тубулоинтерстициалнафиброза(14). Употребата на ACEI и ARB обаче е ограничена от техните хипотензивни ефекти и потенциални неблагоприятни ефекти като хиперкалиемия. В допълнение, нито ACEl/ARB, нито лечението с пентоксифилин може да спре прогресията набъбречнафиброзаи ХБН (15,16). Следователно е наложително да се идентифицират нови медиатори или пътища, които са критични за патогенезата набъбречнафиброзаза разработване на ефективни терапевтични средства срещу ХБН (хронични бъбречни заболявания).
Наскоро идентифицирахме тиоредоксинов домейн, съдържащ 5 (TXNDC5), ER-резидентен, обогатен с фибробласти протеин с ензимната активност на протеинова дисулфидна изомераза (PDI), като критичен медиатор на сърдечнияфиброза(17). Ние показахме, че прекомерният TXNDC5 насърчава развитието на сърдечнифиброзачрез редокс-зависимо активиране на сърдечни фибробласти и производство на ECM. Генетичната делеция на Txndc5 подобрява сърцетофиброзаи контрактилна дисфункция, индуцирана от агонист при мишки (17). Въз основа на наблюдаваната съществена роля на TXNDC5 в миокардната фиброгенеза, ние предположихме, че TXNDC5 може също да допринесе критично за развитието на тъканфиброзаособено в несърдечните органифиброза на бъбреците.
В настоящото проучване ние показахме, че TXNDC5 е силно регулиран нагоре във фиброзни бъбреци на хора и мишки, по-специално в бъбречните фибробласти, секретиращи колаген. Глобалното изтриване на Txndc5 значително намалява степента набъбречнафиброзапри множество миши модели на бъбречно увреждане. Механично, ние демонстрирахме, че прекомерният TXNDC5, индуциран от TGF- 1 чрез ATF6-зависим ER път на стрес, увеличавабъбречнафиброзачрез насърчаване на активиране/пролиферация на бъбречни фибробласти и производство на ЕСМ чрез посттранслационна стабилизация и регулиране нагоре на TGF-рецептор тип I (TGFBR1). Важно е, че ние показахме, че индуцирането на фибробласт-специфична делеция на Txndc5 ефективно подобрява развитието и прогресията нафиброза на бъбрецитепредизвикани от различни видове наранявания при мишки, което предполага, че насочването към TXNDC5 може да бъде нов и мощен подход за лечениебъбречнафиброзаи запазетебъбрекфункция.
Фигура 1. TXNDC5 е значително повишен във фиброзни бъбреци на мишки и бъбречни проби от пациенти с ХБН( хронични бъбречни заболявания).
(A) IHC оцветяване (n=3) и (B) имуноблоти (n=6) показват, че протеиновата експресия на TXNDC5 е повишена в миши фиброзни бъбреци, индуцирани от UUO или uIRI, в сравнение с контралатералните бъбреци (CL) . Скала: 50 μm.
(C) Количествената RT-PCR показа, че транскриптът на Txndc5 е регулиран нагоре във фиброзни бъбреци на мишки, индуцирани от UUO и uIRI (n=4–7).
(D) Повторни анализи на данни от микрочипове върху проби от човешки бъбрек от пациенти с ХБН (GSE66494) показват, че TXNDC5, COL3A1 и FN1 са значително повишени в бъбречните тъкани от пациенти с ХБН (здрава контрола n=8, ХБН n {{ 6}}). За A–C данните са представителни за 3 или повече независими експериментални повторения.
За всички панели данните са представени като средно ± SEM. *P < {{0}}.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" чрез="" 2-страничен="" t-тест="" (a–c)="" или="" mann-="" тест="" на="" уитни="">
Резултати
TXNDC5 беше значително повишен в човешки и миши фиброзни бъбреци. За да се изследва потенциалното участие на TXNDC5 в патогенезата нафиброза на бъбреците, ние първо определихме неговите нива на протеинова експресия във фиброзните миши бъбречни тъкани, индуцирани от едностранна уретерална обструкция (UUO), едностранно исхемично-реперфузионно увреждане (uIRI) или чрез прилагане на фолиева киселина (FA). Имунохистохимичните изследвания разкриват значително повишаване на интензитета на оцветяване с TXNDC5 в бъбречните срезове от всичките 3 миши модела набъбречнафиброза(Фигура 1A и допълнителна фигура 1A; допълнителен материал, достъпен онлайн с тази статия; https://doi.org/10.1172/JCI143645DS1). Имуноблотингът и количествената PCR с обратна транскрипция (RT-PCR) също показват значително повишаване на нивата на експресия на протеина (Фигура 1B) и транскрипта (Фигура 1C и допълнителна фигура 1B) на TXNDC5 във фиброзни миши бъбреци. В съответствие с тези резултати, повторният анализ на данни от микрочипове, получени от проби от бъбречна биопсия на пациенти с ХБН (GSE66494) (18), показа, че нивата на експресия на TXNDC5 (с 2,24 пъти, P<0.001), as="" well="" as="" of="" markers="" for="">фиброза на бъбрецитекато COL3A1 и FN, също са значително повишени в бъбречните проби от пациенти с ХБН в сравнение с тези от здрави контроли (Фигура 1D и допълнителна фигура 1C). Взети заедно, наблюдаваното повишено регулиране на експресията на TXNDC5/Txndc5 във фиброзни човешки/миши бъбреци и неговата положителна корелация с фиброгенни ECM протеинови гени предполагат потенциална роля на TXNDC5 в патогенезата нафиброза на бъбреците.
Фигура 2. TXNDC5 е силно регулиран нагоре в бъбречните фибробласти, но не и в TECs, ендотелни клетки или подоцити на фиброзните бъбреци.
(A и C) IF оцветяване на TXNDC5 (червено) върху участъци от фиброзни бъбреци, индуцирани от UUO в Col1a1-GFPTg мишки, показва, че TXNDC5 се експресира главно в секретиращи колаген бъбречни фибробласти (зелено), както в бъбречната кора, така и в медулата (n=6). Клетъчните ядра бяха оцветени с DAPI (синьо). Скала: 100 μm.
(B) IF оцветяване на TXNDC5 (зелено) върху секция от фиброзни бъбреци, индуцирани от UUO в Cdh16-Cre, NPHS2-Cre и Tie2-Cre/ERT2 tdTomato мишки. Клетъчните ядра бяха оцветени с DAPI (синьо). Скала: 100 μm.
(D) Кръгова диаграма за илюстриране на съотношението на TXNDC5 плюс клетки в различни видове бъбречни клетки в UUO-индуцирани фиброзни бъбреци.
Данните са представителни за 3 или повече независими експериментални повторения. Данните в С са представени като средно ± SEM.
TXNDC5 е силно обогатен в бъбречни фибробласти, секретиращи колаген във фиброзните бъбреци. Множество видове бъбречни клетки са замесени в процеса на бъбречна фиброгенеза. След увреждания на бъбреците е показано, че резидентните (19) и периваскуларните (20) бъбречни фибробласти се диференцират в активни миофибробласти и водят до натрупване на ECM. Съобщава се също, че ТЕС и ендотелните клетки допринасят за развитието нафиброза на бъбрецитечрез епителен и ендотелен към мезенхимален преход, съответно (10,21). За определяне на типовете клетки, където TXNDC5 се експресира по време на процеса на бъбречнафиброза, множество репортерни миши линии, които позволяват флуоресцентно маркиране на бъбречни фибробласти (Colla1-GFP', GFP управляван от Collal енхансер/промотор, реф.22), TECs(Cdh16-Cre ROSA26- tdTomato), ендотелни клетки (Tie2-Cre/ERT2 ROSA26-tdTomato) и подоцити (NPHS2-Cre ROSA26-tdTomato) бяха подложени на UUO, uIRI или FA лечение за предизвикванефиброза на бъбреците. Имунофлуоресцентно (IF) оцветяване на бъбречните участъци от тези животни разкрива, че TXNDC5 е значително повишен и силно колокализиран с GFP-положителни, секретиращи колаген бъбречни фибробласти във фиброзни миши бъбреци, индуцирани от UUO (81 процента) (Фигура 2, A и C) , uIRI (76,8 процента) и лечение с FA (73,4 процента) (допълнителна фигура 2, A и B). При UUO-индуцирани фиброзни бъбреци TXNDC5 се експресира само спорадично в TEC (5,94 процента), подоцити (0).63 процент ) и ендотелни клетки (2,05 процента ) (Фигура 2, B и D). Флоуцитометричният анализ на фибробласти, изолирани от миши бъбреци, подложени на UUO, разкри изразена експанзия в TXNDC5* бъбречните фибробласти, както и значително повишаване на регулацията на TXNDC5 в тези клетки, в сравнение с тези от контралатерални контролни бъбреци (допълнителна фигура 2C). Наблюдаваното силно обогатяване на TXNDC5 в бъбречните фибробласти във фиброзни предполага, че TXNDC5 може да допринесе зафиброза на бъбрецитечрез регулиране на активността/поведението на тези фиброгенни клетки, секретиращи колаген.
TXNDC5 е както есенциален, така и достатъчен, за да индуцира активирането, пролиферацията и производството на ECM на бъбречни фибробласти. След това определихме функционалната роля на TXNDC5 в бъбречните фибробласти. Първичните човешки бъбречни фибробласти (HKFs), стимулирани с TGF- 1(10 ng/mL), показват силна регулация на нивата на експресия на протеин (Фигура 3A) и транскрипт (Фигура 3B) на TXNDC5, както и на маркера за активиране на фибробластите периостин и ECM протеини (COL1Al, фибронектин и CCN2). Нокдаунът на TXNDC5 с shRNA значително отслабва индуцираната от TGF- 1- протеин/mRNA регулация нагоре на периостин и множество ECM протеини в HKFs (Фигура 3, A и B). В допълнение, лечението с TGF1 засили пролиферативната активност на HKFs, която беше напълно отменена от нокдаун TXNDC5 (Фигура 3D). Тези резултати предполагат, че TXNDC5 е от съществено значение за индуцираното от TGF- 1-HKF активиране, пролиферация и производство на ECM. Свръхекспресията на TXNDC5, от друга страна, води до изразена регулация нагоре на периостин, COL1A1 и фибронектин (Фигура 3C), както и повишена пролиферативна активност (Фигура 3E) в HKFs. Взети заедно, тези резултати показват, че TXNDC5, надолу по веригата на TGF- 1, е едновременно важен и достатъчен за насърчаване на активирането, пролиферацията и производството на ECM на бъбречни фибробласти.
Фигура 3. Нокдаун на TXNDC5 атенюирано TGF- 1-индуцирано HKF активиране и производство на ECM; свръхекспресията на TXNDC5 е достатъчна, за да предизвика активиране на HKF и производство на ECM.
(A) Нивата на експресия на протеин и (B) транскрипт на маркер за активиране на фибробласти (периостин) и ECM протеини (COL1A1, фибронектин и CCN2) бяха повишени в контролните (Scramble) HKF след TGF- 1 (10 ng/mL) лечение. Нокдаунът на TXNDC5 отслабва регулирането нагоре на тези фиброгенни маркери, индуцирани от TGF- 1 в HKF (n=5–10).
(C) Свръхекспресията на TXNDC5 беше достатъчна, за да индуцира регулиране нагоре на маркера за активиране на фибробласти (Периостин) и ECM протеини (COL1A1, фибронектин) в HKF (n=3–10).
(D) Лечението с TGF- 1 (10 ng/mL) повишава активността на клетъчната пролиферация на HKFs, което е отменено от нокдаун на TXNDC5.
(E) Свръхекспресията на TXNDC5 повишава активността на клетъчната пролиферация на HKFs. В D и E, n=10. Данните са представителни за 3 или повече независими експериментални повторения.
За всички панели данните са представени като средно ± SEM. Статистическата значимост на разликите за 2 групи беше определена чрез 2-страничен t-тест и сред 3 или повече групи беше определена с помощта на 1-way ANOVA, последвано от post hoc тестовете на Sidak. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>
Глобална делеция на Txndc5, защитена срещу бъбреците b. За да се определи изискването на TXNDC5 при разработването нафиброза на бъбрецитеin vivo, WT и Tndc5-/мишки бяха подложени на UUO, uIRI и FA лечение. Пикросириус червено и трихромно оцветяване на Масон върху бъбречните срезове показват обширнибъбречнафиброзапри WT мишки след UUO (Фигура 4А), uIRI (Фигура 5А) и прилагане на FA (допълнителна фигура 3А). Глобалното изтриване на Txndc5 значително намали степента набъбречнафиброзавъв всички 3 модела на увреждане на бъбреците (Фигура 4А, Фигура 5А и допълнителна фигура 3А).
Фигура 4. Делеция на Txndc5 атенюирана бъбречна фиброза, индуцирана от UUO.
(A) Оцветяване с червено Picrosirius (горните 2 панела) и трихромното оцветяване на Masson (долните 2 панела) на бъбречни срезове от WT и Txndc5-7мишки 10 дни след UUO. Вдясно са показани лентови графики на количествените резултати от областите на оцветяване с червено Picrosirius и трихромно оцветяване на Masson (n=5-10). Мащабна лента∶ 100 μm.
(B) SHG изображения на бъбречни участъци от WT и Txndc5-/мишки 10 дни след UUO. Количествените резултати на SHG-позитивните зони показват повишено натрупване на фибриларен колаген (зелен) в WT, но не и в бъбреците на Txndc5 мишки след нараняване.
За всеки от бъбречните участъци, изобразени за SHG, беше получено TPEF изображение, за да покаже профила на сканираната тъкан (червен цвят в долните панели) (n=3). Мащабна лента: 50 um. (C) Имуноблотите показват нива на протеинова експресия на маркер за активиране на фибробласти (Периостин) и ECM (COL1A1) в екстракт от цял бъбрек от WT и Txndc5-/мишки 10 дни след UUO (n= 3-6). Данните са представителни за 3 или повече независими експериментални повторения.
За всички панели данните са представени като средно ± SEM. Статистическата значимост на разликите между 3 или повече групи беше определена чрез 1-way ANOVA, последвано от post hoc тестовете на Sidak.**P<><>
За количествено определяне на патогенния фибриларен колаген (тип I и II) конкретно и за избягване на надценяването на фиброзните зони с традиционните методи на оцветяване, микроскопия с генериране на втори хармоник (SHG), нова оптична система за изобразяване на тъкани, която позволява визуализация на фибрилари, но не и нефибрилари, колаген във фиброзни органи (23, 24), беше използван за оценка на степента нафиброзав WT и Tndc5 плюс миши бъбреци след нараняване. В съответствие с гореспоменатите резултати, микроскопията на SHG показа значително увеличение на фибриларното отлагане на колаген в бъбреците WT след UUO (Фигура 4B), uIRI (Фигура 5B) и лечение с FA (допълнителна фигура 3B), чиято степен беше значително намалена при Txndc{{ 4}}/ мишки (Фигура 4B, Фигура 5B и допълнителна фигура 3B).
В съответствие с атенюирания фиброзен отговор след нараняване в бъбреците на мишка Txndc5, наблюдаван чрез образни изследвания, делецията на Tendc5 също смекчава регулирането на ECM протеинови гени, включително Collar, Eln, Fnl и Ccn2 в бъбреците на мишка след нараняване (допълнителна фигура 3, CE). Имуноблоти на лизати от цяла бъбречна тъкан също показват намалено протеиново ниво на ECM(COLIA1) и маркер за активиране на фибробласти (периостин) в Txndc5-/мишки в сравнение с WT мишки след UUO и uIRI (Фигура 4C и Фигура 5C).
Фигура 5. Делецията на Txndc5 подобрява бъбречната фиброза, индуцирана от ulRI.
(A) Оцветяване с червено Picrosirius (горните 2 панела) и оцветяване с трихром на Masson (2 панела отдолу) на бъбречни срезове от WT и Txndc5-7мишки 28 дни след ulRI. Стълбовидни графики на количествените резултати от червеното Picrosirius и трихрома на Masson зоните на оцветяване са показани вдясно (n=6). Скала ∶ 100 μm.
(B) SHG изображения на бъбречни участъци от WT и Txndc5-мишки 28 дни след ulRI. Количествените резултати на SHG-позитивните зони показват повишено натрупване на фибриларен колаген (зелен) в WT, но не и в бъбреците на Txndc5 мишки след нараняване. За всеки от бъбречните участъци, изобразени за SHG, беше получено TPEF изобразяване, за да покаже профила на сканираната тъкан（червен цвят в долните панели）（n=3）.Мащабна лента∶50 μm.
(C) Имуноблотите показват нива на протеинова експресия на маркер за активиране на фибробласти (Периостин) и ECM (COL1A1) в екстракт от цял бъбрек от WT и Txndc5/мишки 28 дни след ulRI (n=5-9). Данните са представителни за 3 или повече независими експериментални повторения.
За всички панели данните са представени като средно ± SEM. Статистическата значимост на разликите между 3 или повече групи беше определена с помощта на 1-way ANOVA, последвано от post hoc тестовете на Sidak.*P<><><>
За да се изключи възможността TXNDC5, експресиран в други типове бъбречни клетки, като TEC, подоцити и ендотелни клетки, все още да допринася за развитието набъбречнафиброза, ние генерирахме Txndc5 мишки с условен нокаут, специфични за TEC (Cdh16-cre*Txcndc5i или Txndc5Epeko), подоцити (NPHS2-cre*Txndc5/n или Tendc5Podxko) и ендотелни клетки (Tie{{ 7}}cre/ERT2*Tendc5/, или Txndc5Endo.eko). В експерименти с използване на мишки Txndc5Pieko и Txndc5 Poio-cko, мишките Txndc5W бяха използвани като контроли; в експерименти с Txndc5EMio-eko мишки, делецията на Txndc5 беше индуцирана с помощта на тамоксифен, както е описано на Фигура 9А, където третирани с тамоксифен Tie2-Cre/ERT2 мишки бяха използвани като контроли. Целевата делеция на Txndc5 в TECs, подоцити или ендотелни клетки обаче не повлиява степента нафиброза на бъбрецитепредизвикани от UUO или FA (допълнителна фигура 6, BE). Тези резултати предполагат, че TXNDC5, експресиран в TECs, подоцити и ендотелни клетки, допринася малко, ако има такъв, за патогенезата набъбрекфиброза.
Делецията на Txndc5 в бъбречните фибробласти предпазва от TEC апоптоза в отговор на бъбречно увреждане. В процес набъбречнафиброза, увредените TECs губят митохондриална функция и апикобазална полярност, последвани от апоптоза и клетъчна смърт (30). За да проучим дали делецията на Txndc5 влияе върху апоптозата на TECs в отговор на нараняване, ние проведохме TUNEL оцветяване върху WT и Txndc5-бъбрек на мишка раздели 10 дни след UUO. Броят на апоптотичните TECs се увеличава значително в UUO-индуцираните фиброзни бъбреци на WT мишки, докато делецията на Txndc5 отслабва степента на TECapoptosis. Съобщава се, че активираните бъбречни фибробласти могат да индуцират TEC апоптоза чрез паракринни ефекти (31). Тъй като Tendc5 едва се експресира в TECs, е вероятно намалената TEC апоптоза, наблюдавана при Txndc5-7мишки след UUO, да не е клетъчно-автономен ефект, а по-скоро вторичен на намалената интерстициалнафиброзаи следователно малко проапоптотични сигнали от околните бъбречни фибробласти. В съответствие с тази хипотеза, фибробластно-специфичната делеция на Txndc5 (Tendc5kO) отслабва TEC апоптозата до степен, подобна на тази, наблюдавана при Txndc5-/мишки 10 дни след UUO (допълнително). За разлика от наблюдаваното намаляване на TECapoptosis, броят на F4/80-позитивните макрофаги и CD31-позитивните ендотелни клетки е сравним в WT и Txndc5-бъбреци на мишки, със или без UUO, което предполага, че делецията на Txndc5 не влияе върху инфилтрацията на макрофаги или перитубулна капилярна плътност в бъбреците на мишката. Взети заедно, тези данни предполагат, че рено-защитните ефекти на делецията на Txndc5 са резултат от намален тубуларен интерстициаленфиброзаи TEC апоптоза, без да се засяга плътността на бъбречните капиляри или макрофагите.
Индуцираната делеция на Tendc5 в бъбречните фибробласти намалява прогресията на установенитефиброза на бъбреците. За да се определи дали насочването към Txndc5 в бъбреците може да бъде от полза при установенобъбречнафиброза, делецията на Txndc5 в бъбречните фибробласти се индуцира в мишки Txndc5eko 10 дни след UUO, времева точка, когато екстензивнобъбречнафиброзаможе да се наблюдава. В тези експерименти мишки Colla2-Cre, третирани с тамоксифен, са използвани като контроли. Както е показано, Colla2-Cre и Tcndc5eko мишки имат подобна степен набъбречнафиброза10 дни след UUO преди лечението с тамоксифен. Единадесет дни след инжектирането на тамоксифен, обаче, степента на бъбречната фиброза продължи да прогресира при контролните мишки (фиброзната област се увеличи от 5,1 процента на 10,6 процента), докато прогресията набъбрекфиброзабеше почти спряно (фиброзната площ се промени от 5,3 процента на 6,9 процента) при Txndc5eko мишки. Имуноблотингът също показва значително отслабена регулация на CCN2, периостин и TGFBR1 в Txndc5eko мишки в сравнение с контролни мишки между D10 и D21 след UUO. Тези резултати показват, че интервенционната делеция на Txndc5 в бъбречните фибробласти значително намалява прогресията нафиброза на бъбреците, което предполага, че in vivo насочването на TXNDC5 може да бъде нов и мощен терапевтичен подход за подобряване набъбрекфиброзаи за забавяне на прогресията на ХБН.
