Етанолов екстракт от семена на Cucurbita Pepo L. променя невроендокринните смущения при хронично стресирани плъхове и надбъбречната експресия на възпалителни маркери и HSP70

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Hailah M. Almohaimeed1, Shereen Hamed2, Hanan S. Seleem3,4, Ashwaq H. Batawi 5, Zuhair M. Mohammedsaleh6, Maha Jameal Balgoon7, Soad S. Ali 8,9, Soad Al Jaouni 9,10 и Nasra Ayuob11*

Заден план: тикви(Cucurbita pepo L.) е описано, че иматантиоксидант,противовъзпалителни, против умора и антидепресантни ефекти. Надбъбречната жлеза е важен реагиращ на стрес орган, който поддържа хомеостазата по време на стрес.

Цели:Това проучване имаше за цел да оцени ефикасността на прилагането на екстракт от Cucurbitapepo L. (CP) за облекчаване на поведенческите, биохимичните и структурните промени в надбъбречната жлеза, предизвикани от излагане на хроничен непредсказуем лек стрес (CUMS) и да проучи механизма зад това въздействие.

Материали и методи:Четиридесет мъжки плъха албиноси бяха разделени на 4 групи (n=10): контролни, CUMS, третирани с флуоксетин и третирани с CP групи. Промени в поведението, ниво на кортикостерон, провъзпалителни цитокини TNF- и IL-6 и оксидант/антиоксидантпрофила бяха оценени в серума в края на експеримента. Надбъбречните жлези бяха обработени за хистопатологична и имунохистохимична оценка. Генна експресия на каспаза-3 и Ki67 и протеин на топлинен шок 70 (HSP70) бяха оценени в надбъбречните жлези с помощта на RT-PCR.

Резултати:Екстрактът от CP значително намалява нивото на кортикостерона (p < {{0}}.001),="" времето="" на="" неподвижност="" (p="">< 0.001)="" и="" възпалителните="" и="" окислителни="" промени,="" свързани="" с="" депресия,="" предизвикана="" от="" cums,="" в="" сравнение="" с="" нелекуваната="" група.="" екстрактът="" от="" ср="" облекчава="" индуцираните="" от="" cums="" надбъбречни="" хистопатологични="" промени="" и="" значително="">апоптоза(p < 0.001) и значително повишенаантиоксидантнива в серума.

Заключение:Cucurbita pepo L. ефективно подобрява предизвиканите от хроничен стрес поведенчески, биохимични и надбъбречни структурни промени най-вече чрез своитеантиоксиданти противовъзпалителни ефекти.

Ключови думи: тиква, стрес, депресия, каспаза-3, ki67, Hsp70,апоптоза

Cistanche, китайска билка, има антиоксидантна функция.

ВЪВЕДЕНИЕ

Повече от 264 милиона души от всички възрасти страдат от депресия по целия свят (СЗО, 2020 г.). Представянето на депресирания човек обикновено е лошо в училище, на работа и в семейството. Депресията може да доведе до самоубийство; затова се счита за втората водеща причина за смърт при деца на 15- до 29- години (СЗО, 2020 г.). Бозайниците могат да преживеят стресови събития чрез активиране на подходящи физиологични реакции към тези събития. Надбъбречната жлеза е част от хипоталамо-хипофизно-адренокортикалната (HPA) ос и симпатико-адреномедуларната ос, която поддържа хомеостазата по време на стрес (Ulrich-Lai et al., 2006). Съобщава се, че излагането на термичен стрес води до бърза експресия на HSP70 в надбъбречната кора (Huang et al., 2001). Тези протеини споделят вътреклетъчен трафик, представяне на антиген,апоптозаи много други действия (Khar et al., 2001). Описано е, че екзогенни хормони или интерференция с ендогенни хормони, по време на критичните периоди на развитие, могат да имат трайни ефекти върху физиологичните и поведенческите пътища, регулирани от хипоталамусните невроендокринни вериги (Gore and Patisaul, 2010). Невроендокринното разстройство също е описано, за да се разшири концепцията за ендокринно разстройство до включват пълната широчина на интегративната физиология; следователно, това е повече от хормонално разстройство (Waye and Trudeau, 2011).

Промените в невроендокринната регулация, метаболизма и диетата/микробиотата се считат за отключващи фактори за възпаление и предразположение към развитие на депресия (Huang et al., 2019). Постулира се, че депресията — едно от невропсихичните разстройства — и възпалението имат двупосочна връзка. Докато депресията насърчава възпалителни реакции, възпалението насърчава невропсихиатрични разстройства, включително депресия (Bauer and Teixeira, 2019).

Флуоксетин, класически антидепресант, е сред наличните на пазара лекарства за лечение на депресия. Сега се смята за нововъзникващ невроендокринен разрушител. Този ефект на флуоксетин е страничен ефект, а не основната терапевтична цел при бозайниците (León-Olea et al., 2014). Следователно има нужда от по-безопасни антидепресанти без странични ефекти върху невроендокринния статус.

тикви(Cucurbita pepo L.) са икономически важни видове, култивирани по целия свят. Те имат хранителни и здравословни ползи, тъй като са богати на феноли, флавоноиди, аминокиселини, въглехидрати и витамини (Wang et al., 2002). Няколко научни изследвания разкриха, че тиквите имат обширни биоактивности, като антидиабетни, противоракови,антиоксидант, противовъзпалителни, против умора и подобни на антидепресанти ефекти (Wang et al., 2012; Zhanget al., 2012; Nawirska-Olszańska et al., 2013; Kim Nr et al., 2016). Традиционна медицина, главно аюрведа системите и китайската медицина са използвали различни части от тиквата, включително месестата част на плодовете и семената (Perez Gutierrez, 2016). Антидепресивната ефикасност на Sweetme Sweet Pumpkin (SSP) и Cucurbita moschata Duch е тествана преди това в in vivo проучване, използвайки животински модел на депресия, индуциран от тест за принудително плуване (FST) и е сравнена с флуоксетин (Kim Nr et al., 2016). В един от сравнително скорошните прегледи се обобщава, че антидепресантните храни, като тиквени семки, са описани като антидепресантни хранителни резултати от 47 процента, осигурявайки техния подобен на антидепресант ефект (Lachance and Ramsey, 2018). Наскоро Дото и Чача одобриха провеждането на повече изследвания върху животни и клинични изпитвания, за да се потвърди облекчаващият ефект на тиквените семки върху депресията (Дото и Чача, 2020 г.).

Тези доклади бяха окуражаващи за тестване на ефикасността натиквиза облекчаване на въздействието на хроничния стрес върху надбъбречните жлези. Ето защо, това проучване беше проведено, за да се оцени ефектът от пероралното приложение на екстракта от Cucurbita pepo L. (CP) върху облекчаване на индуцираната от хроничен непредсказуем лек стрес (CUMS) поведенческа, биохимична и надбъбречна структура и за изследване на механизма зад това въздействие.

екстракт от пустинна цистанче: Антиоксидация

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Екстракция и дозировка на тиква

Cucurbita pepo L. (ваучерен екземпляр: AQJ_95) е закупен от местния пазар в Джеда, Саудитска Арабия. Те са идентифицирани в хербариума на университета Крал Абдулазиз с помощта на образци от хербариум и флората на Саудитска Арабия (Chaudhary, 2001). Ваучерните образци бяха депозирани в хербариума. CP е идентифициран от авторите и е потвърден от ботаник от Факултета по природни науки на университета King Abdulaziz.

Екстракцията на CP е извършена съгласно предишни проучвания (Wang et al., 2012). Суровите плодове с кората бяха нарязани с помощта на нож и изсушени с помощта на лиофилизатор (FD5508; ilShinBioBase Co., Ltd., Корея) и след това натрошени с помощта на електрическа машина за смилане. Прахът се прекарва през 40-мрежесто сито, за да се получи фин прах и се съхранява в херметически затворен контейнер. Изсушеният прах (50 g) се смесва с 450 ml 80 процента етанол и се оставя за 1 ден при 37 градуса в шейкър (JSSI-100T; JS Research Inc., Compact ShakingIncubator., Корея) и след това се филтрира с памук и филтърна хартия на втория ден. Този процес на екстракция се повтаря два пъти при 37 градуса, за да се получи етанолов екстракт.

Идентифициране на съставките на CP

Химичният състав на PE се анализира с помощта на газов спектрометър GC-TSQ evo 8000 (ThermoScientific, Austin, TX, Съединени щати) с директна капилярна колона TG–5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm дебелина на филма). Температурата на пещта на колоната беше първоначално настроена на 50 градуса и след това повишена с 5 градуса /мин до 250 градуса и задържана за 2 минути и след това повишена до крайна температура от 300 градуса с 25 градуса /мин и задържана за 2 минути. Температурите на инжектора и MS трансферната линия се поддържат съответно на 270 и 260 градуса; хелий се използва като газ-носител при постоянен дебит от 1 ml/min. Забавянето на разтворителя беше 4 минути и разредени проби от 3 µl бяха инжектирани автоматично, като се използва Autosampler AS1300, свързан с GC в режим без разделяне в PTV инжектор. EI масспектрите бяха събрани при 70 eVionization напрежения в диапазона от m/z 50–650 в пълен режим на сканиране. Температурата на източника на йони беше зададена на 250 градуса. Компонентите бяха идентифицирани чрез сравнение на техните масспектри с тези на WILEY 09 и NIST 14 база данни за масов спектър, които се използват за идентифициране и изследване на химическия състав на неизвестни компоненти във всеки екстракт (Wiley, 2006; Mikaia et al., 2014). Анализът е направен от некачествен тип с помощта на софтуер Thermo Scientific™ Xcalibur™ 2.2 и всички стойности са докладвани в относителен процент (Abd El-Kareem et al., 2016).

Експериментален дизайн

Това проучване е одобрено от Комитета по етика на биомедицинските изследвания към Факултета по медицина, Университета Крал Абдулазиз, Джеда, Саудитска Арабия (референтен номер {{0}}). В това изследване четиридесет мъжки плъха албиноси с тегло 150–200 g и на възраст 2–3 месеца са получени от King Fahd Medical Research Center (KFMRC). Преди започване на експеримента, плъховете бяха оставени да се аклиматизират към лабораторните условия за 1 седмица. Десет плъха бяха определени като контролна група, която не беше изложена на CUMS. Останалите тридесет плъха бяха подложени на процедурата на CUMS в продължение на 4 седмици, която включваше различни видове стресови фактори по различно време през деня, за да се предотврати привикването към стреса. Процедурата CUMS беше напълно описана в предишни работи (Ayuob et al., 2016; Ali et al., 2017) и беше показана в таблица 1. Плъховете, изложени на CUMS, бяха разделени на 3 групи (n 10). Нетретираната група (CUMS) получи носителя 0,03 процента карбоксиметил целулоза (CMC-Na) чрез сонда за 2 седмици. Групата, лекувана с грип, получи FLU (Dar Al Dawa Pharmaceuticals Co., Ltd., Аман, Йордания), антидепресант, използван за фармакологично валидиране, разтворен в CMC-Na 0,03 процента при доза от 20 mg/kg чрез стомашна сонда (Li et al. , 2014). Групата, третирана с CP, получава екстракт от CP, разтворен в дестилирана вода в доза от 100 mg/kg чрез сонда за 2 седмици съгласно Wang et al. (2012).

Оценка на промените в поведението

FST се извършва след 4 седмици, за да се потвърди ефектът на CUMS върху плъховете (Ali et al., 2017). По време на този тест всеки плъх се поставя в стъклен цилиндричен контейнер (височина 20 cm, диаметър 14 cm) с 15 cm вода при 25 ± 2 градуса. Плъхът беше записан на видеозапис в продължение на 6 минути с помощта на софтуер за поведение (Noldus InformationTechnology, EthoVision XT®) и общото време, прекарано неподвижно през 6 минути, беше измерено от техник, сляп за експерименталните групи. Беше определено общото време, в секунди, прекарано от плъховете без движение на крайниците, с изключение на незначителното движение, необходимо за поддържане на мишката на повърхността, "време на неподвижност" през 6 минути.

Биохимични техники

Двадесет и четири часа след приключване на поведенческия тест бяха взети кръвни проби от интраорбиталния синус на плъхове, след като бяха анестезирани с 4% изофлуран (SEDICO PharmaceuticalsCompany, Кайро, Египет) в 100% кислород. След това плъховете бяха евтаназирани чрез цервикална дислокация. Кръвните проби се центрофугират при 3,000 rpm за 15 минути при 4 градуса за получаване на серума и се държат при -18 градуса за биохимична оценка.

Нивото на кортикостерон (ALPCO Diagnostics, Orangeburg, NY, Съединени щати) се оценява с помощта на комплекти за ензимно-свързан имуносорбентен анализ съгласно инструкциите на производителя. Съгласно инструкциите на производителя, TNF- и IL-6 (Quantakin R&D система, комплект САЩ) бяха оценени чрез използване на ензимно-свързан имуносорбентен анализ. Оптичната плътност на всяка проба се определя в два екземпляра с ELISA четец за микроплака, настроен на 450 nm.

Комплектът за анализ на реактивни вещества с тиобарбитурова киселина (TBARS) (Biodiagnostic; Египет) беше използван за измерване на нивото на малондиалдехид (MDA) спектрофотометрично при 535 nm (Gamal et al., 2018). Нивото на супероксид дисмутаза (SOD) се измерва с помощта на комплекта за анализ на SOD (Biodiagnostic; Египет) (Packer, 2002). Оценката на нивото на глутатион пероксидаза (GPX) беше извършена с помощта на комплекта GPX (Randox Labs, Crumlin, Обединеното кралство). За да се определи количествено активността на каталазата (CAT), се генерира калибровъчна крива за анализа и всички проби, като се използват комплекти за анализ (Biodiagnostic; Египет). Методът е описан по-рано (Gamal et al., 2018).

ползи от екстракта от пустинна цистанче: противовъзпалително

Количествен PCR в реално време

Екстракцията на РНК от тъканните проби се извършва с помощта на реагента TriFast™ (PeqLab, Германия, кат. номер: 30-2010), както е описано в протокола на производителя. Концентрацията на пречистената РНК се оценява с помощта на спектрофотометър NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, САЩ). Екстрахираната РНК от всяка проба беше обратно транскрибирана, като се използва SensiFAST™ cDNA синтезиращ комплект за RT-qPCR (Bioline USA Inc., Съединени щати, кат. номер: BIO-65053), следвайки инструкциите на производителя. Синтезираната ДНК се съхранява при -80 степен до използване за qRT-PCR.

Реакциите qRT-PCR бяха проведени с помощта на комплекта SensiFAST™ SYBR Lo-ROX (Bioline USA Inc., Съединени щати, кат. номер: BIO-94002) на Applied Biosystems 7500real система за откриване на PCR по време (Life technology, Съединени щати). Ген-специфични праймери за плъхове, използвани в това изследване, са проектирани от софтуер Primer3 (v.0.4.0) и тяхната специфичност е проверена с помощта на програмата NCBI/Primer-BLAST. След това праймерите бяха закупени от Willowfort™ (Обединеното кралство). Праймерите бяха GAPDH (5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′, 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′), каспаза-3 (напред 5- TGTATGCTTACTACCGCACCCG-3, обратно {{ 20}}GCGCAAAGTGACTGGATGAACC-3), HSP70 (5′-ACGAGGGTCTCAAGGGCAAG-3′, 5′-CTCTTTCTCAGCCAGCGTGTTAG-3′).

Ki67 (напред 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA-3, назад 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA 3). PCR сместа се приготвя както следва: 10 µl SensiFASTTM SYBRLo-ROX смес, 0.8 µl прав праймер, 0.8 µl обратен праймер, 2 µl шаблонна сДНК и 6.4 µl вода без нуклеаза. Реакционната смес се прехвърля в термичен цикъл, който предварително е програмиран да поддържа 95 градуса за 2 минути, последвано от 40 цикъла на 95 градуса за 15 секунди и след това 60 градуса за 30 секунди. Във всеки експеримент беше проведена отрицателна контролна реакция, несъдържаща шаблон.

Беше извършен анализ на кривата на топене, за да се докаже специфичността на PCR продуктите и стойността на Ct за всяка реакция беше получена от диаграмите на амплификация. Относителното количествено определяне за всяка генна експресия в тъканните проби беше изчислено с помощта на метода на сравнителния праг (ΔΔCt) с GAPDH като вътрешен контролен ген. За общата промяна на сгъването тя беше изчислена и линеаризирана чрез аритметичната формула 2−ΔΔCt.

Хистологични техники

В края на експеримента и след като плъховете бяха анестезирани, коремът беше отворен и дясната надбъбречна жлеза беше дисектирана. За да се получат парафинови блокове, беше извършено фиксиране на надбъбречната жлеза в 10 процента неутрален буфериран формалин и последващи процеси. Парафиновите срезове с 4-μm дебелина бяха приготвени и оцветени с хематоксилин и еозин (H&E). Освен това, други парафинови срезове бяха имунохистохимично оцветени с помощта на стрептавидин-биотин-пероксидазна техника. Слайдовете се инкубират една нощ при 4 градуса и след това се инкубират с моноклонално анти-Ki67 (Dako Cytomation, Съединени щати, при разреждане 1:1, 000) ​​за демонстрация на клетъчна пролиферация. В допълнение, поликлонално анти-каспаза{10}} антитяло (Santa Cruz Biotechnology, САЩ, при разреждане 1:1,000) беше използвано за откриване наапоптоза. Поликлонално антитяло срещу протеин на топлинен шок -70 (HSP70) (Dako, Carpinteria, CA, Съединени щати, при разреждане 1:1, 000) също беше използвано. Използва се съответното биотинилирано конюгирано вторично антитяло от системата за оцветяване Dako. Слайдовете, оцветени само с вторичното антитяло, се използват като отрицателни контроли.

Ядрата се оцветяват обратно с хематоксилин. Кафявото цитоплазмено оцветяване се счита за положителна реакция. Оцветените срезове бяха изследвани и фотографирани с помощта на микроскоп Olympus BX{{0}} (Olympus), свързан с цифрова камера и компютър. Полуколичественият анализ на имунореактивността на антитялото беше направен чрез софтуер за анализ на изображения Pro Plus. Процентната площ на имунопозитивната реакция беше оценена в 30 полета при ×400 увеличение. Положителните клетки се преброяват на 1,0 mm2 площ, както е описано от Zhou et al. (2016). Най-малко пет полета от всеки слайд бяха изследвани и средната стойност беше изчислена за всяко животно.

За морфометричен анализ бяха изследвани четири среза във всяко животно (увеличение × 100). Дебелината на различните зони на надбъбречната жлеза се измерва в микрометри. Дебелината на надбъбречната кора е получена чрез измерване на разстоянието между медулата и надбъбречната капсула по права линия, едно измерване се прави във всеки квадрант на надбъбречната кора.

Статистически анализ

Поведенческите, биохимичните и имунохистохимичните данни бяха анализирани от Статистическия пакет за социалните науки (SPSS) версия 16. Променливите на изследването бяха повлияни от два независими фактора: излагане на стрес и лечение. Следователно беше извършен анализ с помощта на смесен модел двупосочен ANOVA, базиран на Bonferroni post hoc. Статистическата значимост се разглежда при p <>

ползи от desert cistanche: против стареене

РЕЗУЛТАТИ

Поведенчески резултати

Времето на неподвижност по време на FST беше значително по-високо (p=0.03) в групата на CUMS в сравнение с контролата, докато беше значително по-ниско (p=0.01, p=0.001) в групите, лекувани с FLU и CP, отколкото в групата с CUMS (Фигура 1A).

Резултати от анализ на CP екстракт с помощта на GC-MS

Основните съединения, открити в CP, включват главно олеинова киселина (около 56 процента), палмитинова киселина (около 8,9 процента), линоленова киселина 3,5 процента и линолова киселина 2,8 процента, освен много други съединения (Таблица 2; Фигура 2). Сред съединенията на CP, за които се съобщава, че имат противовъзпалителен ефект, има олеинова киселина, палмитинова киселина, линоленова киселина, бетулин и линолова киселина, докато тези сантиоксидантефект са палмитинова киселина,10-октадеценова киселина и метилов естер.

Биохимична оценка

Ниво на кортикостерон в серума

Нивото на кортикостерон се повишава значително (p < {{0}}.001) при нелекувани плъхове, изложени на CUMS, в сравнение с това при контролните плъхове, докато тези, лекувани с FLU и CP, показват значително намаление (p < 0,001) в серумния кортикостерон ниво в сравнение с това при нетретирани плъхове, изложени на CUMS (Фигура 1B).

Нива на TNF- и IL-6 в серума

В края на експеримента оценката на серумните TNF- и IL-6 показа, че те са значително повишени (p < 0.001) в групата на CUMS, докато те показват значително намаление (p< 0.001)="" in="" flu-="" and="" cp-treated="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" rats="" exposed="" to="" cums="" (figures="" 1c,="">

Нива на MDA, SOD, GPX и CAT в серума

Беше забелязано, че нивото на серумния MDA е значително по-високо (p < {{0}}.001)="" в="" групата="" на="" cums,="" отколкото="" в="" контролните="" плъхове,="" докато="" това="" в="" групите,="" третирани="" с="" cp,="" е="" значително="" по-ниско="" (p="" 0,003)="" отколкото="" при="" нетретирани="" плъхове,="" изложени="" на="" cums.="" прилагането="" на="" flu="" не="" може="" значително="" да="" намали="" нивото="" на="" mda="" при="" плъхове,="" изложени="" на="" cums="" (фигура="">

Обратно, нивата на SOD, GPX и CAT в серума на групата CUMS са значително по-ниски (p < {{0}}.001,="" p="">< 0,001,="" p="0" .002)="" от="" тези="" в="" серума="" на="" контролната="" група,="" докато="" техните="" нива="" показват="" значително="" увеличение="" (p="0.01," p="0.003," p="" 0.03)="" в="" групата,="" лекувана="" с="" cp="" в="" сравнение="" с="" тези="" в="" групата,="" изложена="" на="" cums.="" приложението="" на="" flu="" не="" може="" значително="" да="" повиши="" sod,="" gpx="" и="" cat="" при="" плъхове,="" изложени="" на="" cums="" (фигури="">

Генна експресия на Ki67, каспаза-3 и HSP70

RT-PCR разкрива незначително висока експресия на Ki67 ген (p=0.14) в надбъбречните жлези на групата с CUMS в сравнение с контролната група, докато тази на групите, лекувани с FLU и CP, показва значително висока експресия (p {{6 }}.02, p 0.01) в сравнение с тази на групата, изложена на CUMS (Фигура 3E). По отношение на каспаза-3, нейната генна експресия беше значително повишена (p <0,001) в надбъбречните жлези на групата CUMS в сравнение с контролната група, докато тази на групите, лекувани с FLU и CP, показва значително намаление (p=0.03, p=0.04) в сравнение с тази на групата, изложена на CUMS (Фигура 3F). Що се отнася до генната експресия на HSP70, тя регистрира значително по-високи (p <0,001) нива в надбъбречните жлези на групата на CUMS, отколкото в контролната група, докато тази на FLU и Групите, третирани с CP, показват незначителен спад (p=0.07, p=0.08) в сравнение с групата, изложена на CUMS (Фигура 3G).

Хистопатологична оценка

Надбъбречните жлези на контролните плъхове имат непокътната структура със запазена архитектура на кората, включително zona glomerulosa, zona fasciculata и zona reticularis, както и медулата (Фигура 4). Надбъбречните жлези на плъхове, изложени на CUMS, показват много клетки в ZG, ZF и ZR с очевидна вакуолизация и дегенерирани ядра и понякога дълбоко оцветени ядра с умерено удебеляване в капсулата и трабекулите на съединителната тъкан. Много клетки от ZR изглеждаха тъмни с кафяви липофусцинови пигменти. От друга страна, надбъбречните жлези на третирани с CP плъхове показват по-малко очевидно вакуолизирани клетки и дълбоко оцветени ядра в ZG, а ZF и ZR разкриват малко тъмни клетки.

Морфометричните измервания показват, че дебелината на ZG и ZR показва незначително увеличение след излагане на CUMS, докато те са значително увеличени при FLU- (p 0.01,p 0.02) и CP-третирани групи (p=0.02, p=0.001), съответно. По отношение на дебелината на ZF, тя беше значително увеличена (p 0,02) в групата, изложена на CUMS, и беше допълнително увеличена, но незначително, в групите, лекувани с FLU и CP, в сравнение с тази в нелекуваната група с CUMS.

За да се определи дали клетъчната хиперплазия е ограничена до специфичен субрегион на надбъбречната жлеза, беше използвано имунохистохимично маркиране за Ki67 (маркера на делящата се клетка). Броят на Ki67-позитивно пролифериращите клетки беше значително увеличен (p < 0.001)="" в="" zf="" след="" излагане="" на="" cums,="" докато="" лечението="" с="" flu="" и="" cp="" незначително="" се="" увеличи="" в="" сравнение="" с="" нетретираната="" cums="" група.="" въпреки="" че="" броят="" на="" пролифериращите="" клетки="" беше="" незначително="" увеличен="" в="" zg="" и="" zr="" и="" незначително="" намален="" в="" медулата="" на="" групата="" с="" cums="" в="" сравнение="" с="" контролната="" група,="" лечението="" с="" flu="" и="" cp="" значително="" увеличи="" броя="" на="" пролифериращите="" клетки="" в="" zg="" (p="0.001" ,="" p="0.003)," zr="" (p=""><0.001) и="" медула="" (p="0.004," p="0.003)" в="" сравнение="" с="" нетретираната="" cums="" група="" (фигури="" 4,="">

За оценка беше извършено имунохистохимично оцветяване с използване на каспаза-3апоптоза(Фигура 6). Беше забелязано, че процентната площ на експресията на каспаза-3 значително се увеличава (p < 0.001)="" във="" всички="" зони="" на="" жлезата="" след="" излагане="" на="" cums="" за="" 4="" седмици="" в="" сравнение="" с="" това="" на="" контролната="" група.="" групата,="" лекувана="" с="" cp,="" показва="" значително="" намаляване="" на="" експресията="" на="" каспаза-3="" в="" zg="" (p=""><0,001), zf="" (p=""><0,001), zr="">< 0.001,="" p=""
="" 0.005),="" and="" medulla="" (p="0.004," p="0.001)," in="" comparison="" to="" that="" of="" the="" cums="" group="" (figures="">

Процентът на площта на експресията на HSP70 значително се повишава (р <0,001) във всички зони на кората, както и в медулата на надбъбречната жлеза на групата CUMS в сравнение с този на контролната група, докато той е незначително намален в всички зони и медула на групите, лекувани с FLU и CP, в сравнение с тази на групата CUMS (Фигури 5).

Изсушени филийки Cistanche tubulosa

ДИСКУСИЯ

Съвременното общество очевидно е пълно със стрес, който може да възникне от ежедневни проблеми, здравеопазване и проблеми, свързани с работата. Тези стресори могат да причинят така наречените разстройства, свързани със стреса (Clayton and Mccance, 2014). В това проучване етаноловият екстракт от месото и кората на Cucurbita pepo L. е използван за изследване на потенциала му за облекчаване на предизвиканото от CUMS депресивно поведение и въздействието му върху надбъбречната жлеза. Това беше доказано чрез значително повишаване на нивото на серумния кортикостерон и потвърдено чрез удължено време на неподвижност по време на FST. Тези констатации са в съответствие с докладваните по-рано (Tang et al., 2015).

Съобщава се, че както TNF-, така и IL-6 участват в патогенезата на депресията (Taraz et al., 2015; Pedraz-Petrozziet al., 2020). Беше съобщено, че мишки с дефицит на IL-6 или TNF-рецептори са резистентни към депресивно поведение (Viana et al., 2010). Следователно те бяха оценени в това проучване и беше наблюдавано, че както TNF-, така и IL{ {9}} са значително повишени в серума на плъхове, изложени на CUMS в продължение на 4 седмици, което показва, че те са били депресирани. Това откритие беше подкрепено от Numakawa et al. (2014) при мишки с поведенческо отчаяние и от Taraz et al. (2015) при пациенти с депресия.

В това проучване прилагането на екстракт от тиква е свързано с облекчаване на депресивното поведение, очевидно от значителното намаляване на времето на неподвижност на FST и потвърдено от значителното намаляване на кортикостерона и възпалителните цитокини TNF- и IL-6 в серума. Тези открития бяха подкрепени от Kim Nr et al. (2016), които съобщават, че SSP за 28 дни намалява нивото на възпалителни цитокини при депресираните плъхове. Противовъзпалителната активност натикваможе да се припише на активните съединения на тиквата като олеинова и палмитинова киселина и естрадиол.

Понижаването на олеиновата киселина, палмитинова киселина и линолова киселина е описано при депресия (Conklin et al., 2010; Martín et al., 2010). Съобщава се, че медиираната от олеинова киселина невропротекция е свързана с нейния противовъзпалителен ефект, медииран от активиране на гама-рецептор, активиран от пероксизомопролифератор (PPAR-) (Song et al., 2019). Като добавим към това, се съобщава, че палмитинова киселина инхибира фосфолипаза А(2) и следователно. считан за противовъзпалително съединение (Aparna et al., 2012). Естрадиолът е едно от съединенията на тиквата, открити в това проучване. Съобщава се, че естрадиолът предизвиква противовъзпалителен ефект и впоследствие облекчава депресивното поведение (Xu et al., 2015). Друг механизъм, чрез който естрадиолът може да предизвика антидепресивен ефект, е регулирането нагоре на експресия на мозъчен невротрофичен фактор (BDNF) и ERK фосфорилиране чрез активиране на ER- в мозъка (Yang et al., 2010).

В това проучване серумното ниво на MDA е повишено, докато нивата на SOD, GPX и CAT са намалени в експонираните на CUMS плъхове. Подобни промени са документирани след излагане на CUMS в предишни проучвания и те добавят, че тези биохимични промени са довели до оксидативен стрес и увреждане на HPA (Nabavi et al., 2015). Liu T. и др. (2015) също съобщават, че развитието на депресия може да се дължи на ниското съдържание на антиоксиданти в тялото. Антиоксидантните свойства натиквачесто се съобщава за плодов екстракт (Bahramsoltani et al., 2017). Освен това се съобщава, че месото и кората на Cucurbita pepo L. имат по-висока антиоксидантна активност от другите части, например семена (Oyeleke et al., 2019). Приложението на екстракт от тиква, в много предишни проучвания, значително повишава нивата на SOD и GPX и намалява MDA в серума на мишки (Guo-Huaet al., 2000; Dang, 2004) и този ефект също е документиран в това проучване. Следователно, наантиоксидантактивността на тиквите може да стои зад антидепресивния им ефект, очевиден в това проучване. Това е в съответствие с наблюденията на Kim Nr et al. (2016). Беше съобщено, че естествените продукти с противовъзпалителни,антиоксидант, а ефектите против умора също имат ефект, подобен на антидепресант (Jeong et al., 2015). Всички тези предишни дейности бяха доказани втикви.

Цистанче има ефект против стареене

Повишената цитоплазмена вакуолизация на надбъбречните кортикални клетки, наблюдавана в групата CUMS в това проучване, може да се отдаде на нарастващото търсене на липиди, които формират крайъгълния камък за синтеза на кортизол. Циганкова и др. (2005) наблюдават, че дълготрайната експериментална хипердинамика води до сливане на множество цитоплазмени липидни капчици на кортикални клетки. Тези липидни капчици съдържат холестерол, който е основният прекурсор в синтеза на стероидни хормони. Въпреки това, Колдишева и Лушникова (2008) съобщават, че стресът води до значително намаляване на липидните капчици в клетките на надбъбречната кора, особено ZF (Колдишева и Лушникова, 2008). Описано е, че при излагане на физически стрес болковите стимули се предават на хипоталамуса, което води до секреция на CRH в хипофизната портална система, което увеличава секрецията на ACTH и стимулира неговите рецептори в ZF и ZR да увеличат секрецията на кортизол (Patti et al., 2018). Удебелената надбъбречна капсула и трабекули, наблюдавани при плъхове, изложени на CUMS, бяха докладвани по-рано (El-Desouki et al., 2011; Altayeb и Salem, 2017) в резултат на повишен синтез на колаген от фибробласти при излагане на имобилизационен стрес.

Много клетки в надбъбречните жлези на плъхове, изложени на CUMS, показват дълбоко оцветени ядра, което показва, че са претърпели тапоптоза, която е потвърдена от имунохистохимично оцветяване с каспаза-3. Подобно наблюдение беше докладвано от Altayeb и Salem, (2017), докато те изучаваха ефекта от имобилизационния стрес върху надбъбречните жлези на плъхове. Liu Q. и др. (2015) съобщават, че прекомерният оксидативен стрес, очевиден след излагане на CUMS в това проучване, променя нивата на експресия на "апоптоза-свързани гени" и индуцира клетъчна апоптоза и дегенерация чрез сигнални пътища на Bcl-2, Bax и каспаза-3. Този механизъм е потвърден в това проучване чрез RT-PCR, което разкрива значително повишено регулиране на гена на каспаза-3 При преглед на литературата няма директен ефект на Cucurbita pepo върху каспаза-3-медиираната апоптоза в различни тъкани. Изглежда, че намаляването на каспаза-3-позитивните апоптотични клетки, открити в надбъбречните жлези, се дължи наантиоксидантефект на Cucurbita pepo, документиран в това проучване. Това се подкрепя от много предишни проучвания, проведени върху други растения и билки със значителна антиоксидантна активност (Banagozar Mohammadi et al., 2019; Ghazizadeh et al., 2020).

Това проучване показа, че излагането на CUMS увеличава Ki67-позитивните клетки в кората на надбъбречната жлеза, което е значително очевидно в ZF, което показва увеличен брой пролифериращи клетки, и в резултат на това дебелината на този слой е значително увеличена. от друга страна, броят на Ki67-позитивните пролифериращи клетки е намалял незначително в медулата в отговор на CUMS. Тези наблюдения са в съответствие с тези на Ulrich-Lai et al. (2006), които съобщават за увеличение на Ki{{ 4}}положителни клетъчни ядра само във външната ZF след излагане на хроничен променлив стрес, докато themedulla показва клетъчна хипертрофия, а не хиперплазия. Освен това Laborie et al., (2003) съобщават за генерализирано повишаване на медуларната функция след излагане на хроничен стрес, което предполага, че хроничният стрес може да доведе до медуларна хипертрофия. В това проучване, прилагането натикваекстракт значително повишена клетъчна пролиферация, очевидно от регулирането на гена Ki67 и имуно-експресията в почти всички зони и тема медула на надбъбречната жлеза в сравнение с CUMS. Това обяснява повишената дебелина на зоните на жлезите, регистрирана в това изследване. Също така може да компенсира апоптотичния ефект, предизвикан от излагане на CUMS. Тази констатация се подкрепя от Kim Hy et al. (2016), които съобщават за значително повишаване на експресията на иРНК на Ki67 и пролиферация на спленоцити, изолирани от далака на BALB/c мишки, третирани с SSP, streamed и Cucurbita moschataDuch и неговия основен компонент, -каротин.

В настоящото изследване излагането на CUMS значително повишава генната експресия и имуноекспресията на HSP70 във всички зони на надбъбречната жлеза. В съответствие с това Zheng et al. (2008) също доказаха, че увеличената експресия на HSP70 след излагане на стресови условия модулира възпалителните реакции чрез инхибиране на активирането на възпалителния транскрипционен фактор, ядрения фактор-kappa B(NF-kappaB). В допълнение, HSP70 може директно да повлияе на апоптозата и некрозата (Yenari et al., 2005). Съвсем наскоро Liet al. (2019) съобщават за повишаване на експресията на HSP70 в тъканта на надбъбречната жлеза на свинете след излагане на топлинен стрес, което показва ролята на HSP70 при увреждане на надбъбречната жлеза и подчертава значението му за възпалителните реакции. Бързата индукция на HSP70 в отговор на стрес се счита за съществена за процеса на клетъчна защита.

В нашето проучване, третирането на изложени на CUMS плъхове стиквибеше свързано с незначително намаляване на експресията на HSP70, което беше свързано с намалена апоптоза и възпалителни реакции. Това може да сочи към благоприятния ефект от относително високото ниво на HSP70, индуцирано както от FLU, така и от CP, тъй като е довело до намаляване на медиираното от каспаза-3апоптозаи освобождаване на възпалителни цитокини. Въпреки че ефектът на тиквите върху семейството на протеините на топлинния шок не е бил описан по-рано, олеиновата киселина, която представлява основните съставки натиквиизползван в това проучване, беше описано, че регулира надолу експресията на HSP60 в клетъчната линия на човешки Т лимфоцити (Martins De Lima et al., 2004), което е в подкрепа на откритието на нашето проучване. Предложеният механизъм на действие на Cucurbita pepo като субстанция, подобна на антидепресант, е обобщен на Фигура 7. Сред ограниченията на това проучване е невъзможността да се изследва по-задълбочено механизмът на антидепресантния ефект на CP и следователно се насърчават допълнителни проучвания за това .

В заключение, това проучване предоставя научно обосновани доказателства за ефикасността на екстракта от Cucurbita pepo L. за облекчаване на предизвиканите от CUMS поведенчески и биохимични промени, както и хистопатологичното въздействие върху надбъбречните жлези. Тези ефекти бяха очевидни чрез понижаване на регулацията наапоптозаи HSP70 експресия и изглежда се медиира чрезантиоксиданти противовъзпалителен ефект на Cucurbita pepoL. екстракт. Въпреки че това проучване и някои други скорошни проучвания са документирали подобен на антидепресант ефект на Cucurbita pepo и са изследвали неговия механизъм, необходими са допълнителни проучвания, включително клинични проучвания, за да се потвърди този ефект при хора.

Cistanche гранули