Стратегия за отчитане на вродени патогени, включваща убиквитиниране на бактериални повърхностни протеини, част 1

ВЪВЕДЕНИЕ

Патогенната инвазия задейства набор от имунни отговори, стимулирани от механизмите за наблюдение на гостоприемника. Това обикновено се инициира чрез разпознаване на запазени микробни молекулярни структури, известни като свързани с патогени молекулярни модели (PAMP). Ефективното усещане на тези PAMP от рецептори за разпознаване на образи (PRRs) бързо индуцира различни имунни отговори на гостоприемника чрез активиране на сложни сигнални пътища, предизвикващи изчистване на патогена.

През последните години, с развитието на биотехнологиите и непрекъснатото усъвършенстване на изследователската технология, хората имат по-задълбочено разбиране за връзката между микробните молекули и имунитета. Консервираните микробни молекули са клас микробни молекули, които могат да бъдат разпознати от организмите и да предизвикат имунен отговор. Те включват главно молекулярни компоненти на микроорганизми като бактерии, вируси и гъбички и са силно запазени и специфични. Проучванията показват, че консервираните микробни молекули могат да устоят на различни патогени и да повишат имунитета чрез активиране на имунната система на тялото.

Консервираните микробни молекули предизвикват възпалителни и имунни реакции чрез активиране на важни молекули в имунната система, като Т клетки, В клетки и макрофаги. След като разпознаят запазени микробни молекули, тези клетки ще освободят различни имунни медиатори, включително цитокини и хемокини, като по този начин привличат други имунни клетки да се присъединят към имунния отговор. В същото време консервираните микробни молекули могат също да служат като антигени за активиране на реакциите на антитела в тялото, като по този начин образуват защита от антитела. Взаимодействието на тези клетки и имунните фактори може по-добре да защити тялото от патогени.

Много проучвания показват, че консервираните микробни молекули могат да подобрят имунитета на организма, като по този начин предотвратяват и лекуват различни заболявания, като инфекциозни заболявания, алергични заболявания, рак и др. Например, често използваната рекомбинантна ваксина срещу хепатит B е направена на базата на запазена микробна молекула върху повърхностния антиген на вируса на хепатит B. Имунният отговор на тялото може да бъде индуциран чрез инокулиране на ваксината, за генериране на повърхностно антитяло на вируса на хепатит B, за да се постигне целта за предотвратяване на инфекцията с вируса на хепатит B.

В заключение, има силна връзка между запазените микробни молекули и имунитета. Чрез пълното използване на имуномодулиращата функция на запазените микробни молекули имунитетът на тялото може да бъде подобрен и различни заболявания могат да бъдат по-добре предотвратени и лекувани. Следователно трябва активно да обръщаме внимание на приложните изследвания на консервирани микробни молекули и да насърчаваме приложението им в превенцията и лечението на заболявания. От тази гледна точка трябва да подобрим имунитета. Cistanche може значително да подобри имунитета, тъй като пепелта от месо съдържа различни биологично активни съставки, като полизахариди, две гъби и Huangli и др. Тези съставки могат да стимулират имунната система. Различни видове клетки, повишават имунната си активност.

Кликнете върху ползите за здравето от цистанче

Към днешна дата са открити и характеризирани няколко класа PRR, като Toll-подобни рецептори, подобни на ген I (RIG-I) рецептори, индуцируеми от ретиноева киселина, NOD-подобни рецептори и ДНК рецептори (цитозолни сензори за ДНК) (1 ). Тези PRR са в челните редици както на извънклетъчното, така и на вътреклетъчното разпознаване на патогени и усещат различни класове молекули в микробите, включително протеини, липиди, въглехидрати и нуклеинови киселини (2). Това е от основно значение за спиране на прогресията на заболяването и насърчаване на оцеляването на гостоприемника.

Наблюдението на вътреклетъчната среда за ограничаване на пролиферацията на патогени е от решаващо значение за запазване на цитозолната стерилност. Нарушаването на такива защитни механизми осигурява на патогена убежище от извънклетъчния вроден имунитет и предлага възможност за бързо размножаване и разпространение в гостоприемника (3). Следователно мощните механизми за отчитане на патогени и клетъчно-автономните защитни системи са критични за ограничаване на инвазивните патогени. Убиквитинирането е една стратегия, която играе ключова роля в разпознаването и елиминирането на патогена (4).

Пътят на разграждане, продиктуван от убиквитинирането, действа като последна граница срещу бактериите, обитаващи цитозола, които често избягват класическото ендоцитно убиване чрез разкъсване на вакуоли, съдържащи патоген, за да нахлуят в цитозола на гостоприемника. Идентифицирани са няколко гостоприемни Е3 убиквитин лигази за декориране на товари, включително вътреклетъчни патогени с поли-убиквитин (Ub) вериги (5), и въпреки че са открити малко бактериални мишени, като протеини на външната мембрана (6), остават обширни познания относно стратегията за идентификация на субстрата ограничено.

Скорошно проучване показа, че секретираните ефекторни протеини съдържат убиквитин-асоцииран домен (UBA) в Mycobacterium tuberculosis (Mtb), които пасивно набират убиквитинови части, като в крайна сметка доставят патоген до асоциирани с микротубули протеин 1A/1B-лека верига 3 (LC3) -асоциирани автофагозоми (7). Наред с това, необичайни убиквитинови субстрати като липополизахарид (LPS) и гликан са елегантно илюстрирани в няколко бактериални патогена, демонстрирайки гъвкавостта на убиквитиниращите субстрати (8, 9).

Освен това беше установено, че Rickettsia parkeri активно модифицира повърхностните протеини, предпазвайки ги от убиквитиниране и последващо убиване (10). Заедно тези независими проучвания подчертават значението на повърхностната локализация на субстрата на убиквитин. Въпреки това, идентичността на протеиновия субстрат в патогена и как те могат да бъдат точно идентифицирани от гостоприемната Е3 лигаза остават неуловими.
Доста гостоприемни убиквитин лигази, като богат на левцин повторение и стерилен -мотив, съдържащ 1 (LRSAM1), Parkin, протеин на безименния пръст 166 (RNF166), RNF213, Ariadne RING-BetweenRING-RING (RBR) E3- съобщава се, че убиквитин протеин лигаза 1 (ARIH1), SMAD-специфична E3-убиквитин протеин лигаза 1 (Smurf1) и Skip-Cullin-F-box съдържащ протеин 2 комплекс (SCFFBXO2) украсяват патогенни или съдържащи патогени вакуоли с разнообразие от топологии на убиквитиновата верига (8, 9, 11–18). По-специално, по-специално, LRSAM1 чрез авто-убиквитиниране вероятно генерира силен убиквитинов сигнал около бактериите за набиране на автофагични машини (19, 20). Убиквитиновите лигази, отговорни за маркирането на патогени, също участват в поддържането на клетъчната хомеостаза, създавайки изключително пестелива система за ефективно и оптимално използване на ресурсите.

Сред различните убиквитинови верижни топологии, образувани върху патогена, M1-Ub украсата предизвиква предимно индукция на възпаление (21), докато и двете K48- и K63-Ub верижни топологии ефективно насочват микробите към съответно автофагия или протеазомна система (22). Наскоро демонстрирахме, че K48-Ub веригата има по-доминиращ антибактериален ефект в сравнение с K63-Ub (23). Като цяло, клетъчните протеини, предназначени за протеазомно разграждане, са маркирани от K48- Ub верига-специфични лигази. Критичният сигнал за разпознаване на субстрат от такива лигази е основно насочен от дегронов мотив (24).

В това изследване ние идентифицираме съществуването на дегронови мотиви в повърхностните протеини на филогенетично разнообразни бактерии от грам-положителен и грам-отрицателен произход. Насочването на такива субстрати чрез машина за убиквитиниране задвижва ефективно елиминиране на патогена от клетката гостоприемник. Използвайки това, ние демонстрираме превръщането на неубиквитиниращ повърхностен протеин в убиквитинов субстрат чрез инженерно вмъкване на дегрон за насърчаване на бактериалния клирънс. Този прост, но общ принцип за идентифициране на бактериални субстрати потенциално служи като запазен механизъм за цитозолно разпознаване на патогени, обещаващ да бъде ефективен и многоцелеви при отблъскване на бактериални инфекции.

РЕЗУЛТАТИ

K48-Ub веригата насърчава усещането на цитозолни бактериални патогени

При усещане на цитозолна инвазия от патогени, гостоприемникът ги маркира с поли-Ub вериги, за да задейства изчистването им (22). Тъй като такива polyUb вериги се състоят основно от K48- и K63-Ub, първо проучихме преобладаването и пространственото разположение на тези типове вериги върху два филогенетично различни патогена, Streptococcus pneumoniae (SPN) и Salmonella enterica serovar Typhimurium (STM), които причиняват съответно пневмония и гастроентерит при хората. За тези патогени е документирано оцеляването и пролиферацията в цитозола на клетката гостоприемник (13, 25). Използвайки специфични за убиквитинова връзка антитела, ние наблюдавахме, че значително по-голям дял от вътреклетъчните бактерии са маркирани с K48- тип верига Ub (~26 процента за SPN и 37 процента за STm) за разлика от K63- Уб (фиг. 1А).

Анализът на пространственото местоположение чрез структурирана осветителна микроскопия (SIM) показва, че цитозолните (без вакуоларни остатъци) или експонираните на цитозол бактерии (в увредената ендозома) са свързани предимно с K48-Ub, докато K63-Ub сигналът е локализиран върху увредени ендозоми, маркирани с Galectin-8 (Gal8; сензорен маркер за увреждане на ендозома) (Фиг. 1, B до E) (26). Около 99 и ~76 процента от K48-ubiquitinated SPN и STm, съответно, бяха лишени от Gal8 (фиг. 1F). Бактериалното присъствие в цитозола беше допълнително валидирано чрез трансмисионна електронна микроскопия (TEM) и имунооцветяване с мембранен маркер FM 4-64 (фиг. S1, A до F). Открихме съответно 78,4 и 80,4 процента K48-Ub-позитивни SPN и STm, лишени от каквато и да е мембранна връзка, докато съответно 77,7 и 74,4 процента K63-Ub-позитивни SPN и STm бяха ограничени в вакуолата (фиг. 1G). Взети заедно, тези открития предполагат, че покриването на бактериалната повърхност с K48-Ub вериги е основен механизъм за отчитане на патогени, използван от гостоприемника за разпознаване на микроби, живеещи в цитозола.

Degron е генеричен код за бактериално убиквитиниране

След това се опитахме да идентифицираме субстрата за убиквитиниране на K48 върху бактериалната повърхност. Критично е, че убиквитин лигазите на гостоприемника E3, за които се съобщава, че участват в бактериалното убиквитиниране, също са замесени в решаващи клетъчни функции (12, 14), където K48-Ub веригите действат като основен сигнал за клетъчна протеостаза. Ние предположихме, че подобни принципи могат да бъдат възприети от гостоприемника за идентифициране на K48-Ub субстрат на бактериалната повърхност. За протеините на гостоприемника се съобщава, че наличието на тристранен мотив (първична дегронова последователност, последвана от проксимален лизинов остатък и неподредена област между тях) е предпоставка за убиквитиниране на K48 (24).

Ние скринирахме повърхностните протеини на SPN за наличието на подобни характеристики (Фиг. 1H), идентифицирайки BgaA и PspA като предполагаеми мишени за убиквитиниране (Фиг. 1H и Фиг. S2, A и B). BgaA е -галактозидаза, за която се съобщава, че функционира като адхезин за SPN, докато PspA е холин-свързващ протеин, който свързва лактоферин и е необходим за избягване на комплемента (27, 28). Наблюдавахме ~50 до 53 процента намаление в асоциирането на типа K48-Ub верига както за ΔbgaA, така и за ΔpspA мутанти, без никаква промяна в нивата на K63-Ub (фиг. 1I). Това намаление беше ясно изразено (~75 процента) в щам с двоен нокаут (ΔbgaAΔpspA), което предполага неизлишния характер на тези убиквитинови субстрати (фиг. 1I).

Освен това, експресията на BgaA-T (скъсена версия на протеина, състоящ се от аминокиселини от 1 до 1049) и PspA в клетките гостоприемници води до тяхното убиквитиниране с K48-Ub топология (фиг. 1J). Валидността на прогнозираните цели беше потвърдена чрез комплементация и моделът беше подсилен чрез използване на ΔhysA (SPN повърхностен протеин, който не отговаря на тристранни критерии за дегрон) мутант като контрола за оценка на нивата на асоцииране на K48-Ub (Фиг. 1I ).

След това проучихме ефекта на K48-Ub декорацията върху бактериалното изчистване.

Липсата на K48-Ub субстрати възпрепятства бактериалния клирънс, което води до значително подобрена вътреклетъчна устойчивост и за двата мутантни SPN щама (~1.8-кратно за ΔbgaA и ~2-кратно за ΔpspA) ( Фиг. 1K). Универсалността на нашия подход за прогнозиране на субстрата беше потвърдена чрез идентифицирането на няколко повърхностно изложени протеини в различни други патогени като предполагаеми субстрати за убиквитиниране (таблица S1). Един такъв предполагаем кандидат, протеин на външната мембрана RlpA на STm беше потвърден като мишена за машината за убиквитиниране на гостоприемника, тъй като мутантът ΔrlpA показва ~1.5- пъти намалена връзка с K48-Ub в сравнение с дивия -тип (WT) STm (фиг. 1L). Това откритие установи широката приложимост на нашата стратегия за избор на субстрат. Доколкото ни е известно, това са първите бактериални повърхностни протеини, за които се съобщава, че са разпознати от машината за убиквитиниране на гостоприемника за отчитане и изчистване на патогени.

Тристранен мотив е предпоставка за прецизно убиквитиново маркиране на бактериални повърхностни протеини

След идентифицирането на субстрата, ние имахме за цел да тестваме критичните характеристики на тристранния мотив, който формира гръбнака на нашия екран (фиг. 2A и фиг. S2A). Делецията на дегроновата последователност (102VTPKEE107) в BgaA-T доведе до ~50 процента спад в асоциацията на K48-Ub верижен тип, в сравнение с WT SPN, независимо от подобна кинетика на растеж и способност за клетъчно прилепване (Фиг. 2C и фиг. S3, A и B). Това намаление е сравнимо с ΔbgaA нокаут щама, потвърждавайки дегрон-специфичния фенотип. Освен последователността на дегрона, остатъкът от лизин в непосредствена близост е от решаващо значение за прикрепването на убиквитиновата част към субстрата. В BgaA, последователността на degron е придружена от две проксимални значително намалени убиквитинации на K48 в сравнение с BgaA-T (фиг. 2D). Трябва да се отбележи, че възможността за тежка конформационна промяна в протеина BgaA-TΔDegron, която да повлияе на убиквитинирането, беше анулирана чрез прогнозиране in silico и спектроскопия с кръгов дихроизъм (CD) на пречистен протеин BgaA-TΔDegron, който показа сходни структурни сигнатури с BgaA-T (фиг. S3, C и D). Подобно на BgaA, делеция на дегронова последователност (327PETPAPE333) и мутация на лизин (K315R) в PspA също доведоха до значително намалена K48-Ub асоциация, съчетана с удължена способност за оцеляване (фиг. S4, A до D).

След това конструирахме SPN повърхностния протеин HysA, първоначално лишен от първична дегронова последователност, чрез добавяне на дегронова последователност в структурно неподреден регион на протеина, който съдържа лизинов остатък (фиг. 2, F и G и фиг. S2, C пръст на крак). Тази модификация предоставя разпознаване и K48 убиквитиниране на преди това неубиквитиниращия HysA протеин. Нивата на асоцииране на K48-Ub на SPN щамове, носещи конструирания протеин HysA (ΔbgaA:pHysADegron-BgaA и ΔpspA:pHysADegron-PspA) са 2.2- и 3.2-пъти по-високи в сравнение с или ΔbgaA и ΔbgaA: pHysA или ΔpspA щамове, съответно (фиг. 2Н).

Подобрената декорация на щамове ΔbgaA: pHysADegron-BgaA и ΔpspA: pHysADegron-PspA с K48-Ub лиши SPN от печалбата за оцеляване, осигурена от отсъствието на дегрон в ΔbgaA и ΔbgaA: pHysA или ΔpspA (фиг. 2I). Всички конструирани SPN щамове произвеждат сходни нива на образуващия порите токсин пневмолизин (Ply) (фиг. 2, B и G), което е предпоставка за увреждане на ендомембраната и последващо убиквитиниране (25). Това анулира възможния принос на ниско или обширно увреждане на мембраната, насърчавайки изразена промяна на нивата на убиквитиниране в мутантни SPN щамове. Взети заедно, те предполагат, че изкуственото добавяне на последователността на degron насърчава убиквитин-медиирано откриване и елиминиране на патогени. Трябва да се отбележи, че дегроновата последователност в BgaA е силно запазена в различни пневмококови серотипове (фиг. S5A).

Въпреки това, при серотип 19F, който често се свързва с повишен риск от смърт от бактериемична пневмония и сепсис (29–31), беше установено, че първичният дегрон е мутирал (P104Q). Ние наблюдавахме, че имитирането на тази мутация в BgaA (фиг. S5B) придава лошо убиквитиниране и подобрява способността за оцеляване на ΔbgaA: pBgaA-TP104Q в сравнение с ΔbgaA: pBgaA-T (фиг. S5, C и D). Това подчертава разпознаването на degron като стратегия, използвана от гостоприемника, за да се защити срещу тежки бактериални инфекции.

SCFFBW7 е антимикробна Е3 убиквитин лигаза

Каноничната дегронова последователност, присъстваща в избраните убиквитинови субстрати, се предвижда да бъде идентифицирана от SCFFBW7 E3 убиквитин лигазен комплекс (24), който участва в регулирането на клетъчния цикъл и растежа (32). Състои се от два запазени протеина, свързан с S-фаза киназа протеин 1 (SKP1) и член на семейството протеини Cullin, заедно с променлив F-box протеин, който осигурява субстратна специфичност (33). За да проверим участието на SCFFBW7 в убиквитинирането на SPN, първо оценихме връзката на FBXW7 със SPN. Установихме, че ~ 31 процента от вътреклетъчния SPN е свързан с FBXW7 при имунофлуоресцентен анализ (Фигура 3A и Фигура S6A). Очаквано, FBXW7-положителният SPN също е колокализиран с K48 убиквитин (фиг. S6B). За да се докаже участието на SCFFBW7, маркирането на бактериите с K48-Ub вериги беше изследвано чрез имунофлуоресценция, след регулиране надолу на експресията на Cullin1, SKP1 и FBXW7 гени, използвайки насочени малки интерфериращи РНК (siRNAs; фиг. S7, A до C).

По-специално, заглушаването на FBXW7 беше потвърдено от нивото на натрупване на циклин Е1 в третирани с siFBXW7- клетки (фиг. S7F). Наблюдавахме ~45 до 60 процента намаление на SPN асоциацията с K48-Ub в Cullin1, SKP1 и FBXW7 нокдаун клетки (фиг. 3B), което от своя страна доведе до ~1.6- до 1.75-кратно увеличение на устойчивостта на SPN в клетките гостоприемници (фиг. 3E). Специфичното насочване на дегроновия мотив от SCFFBW7 беше доказано чрез непроменени разлики в K48-Ub колокализация и способност за оцеляване на ΔpspAΔbgaA и ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron щамове в siFBXW7-третирани клетки (фиг. S8, A до Д). Тези констатации бяха обосновани от забележими намаления на убиквитинирането на K48 на BgaA-T в клетките гостоприемници след нокдаун на FBXW7 (фиг. 3C).

Освен това, in vitro, убиквитинирането с пречистен BgaA-T (фиг. S9, A до D) и компонентите на SCF комплекса недвусмислено демонстрира SCFFBW7 като добросъвестна Е3 лигаза, отговорна за убиквитинирането на BgaA. Рекомбинантният SCFFBW7 беше в състояние да убиквитинира пречистен BgaA-T, но не успя да убиквитинира дегрон-изтрития вариант BgaA-TΔDegron или варианта на заместване на лизин към аргинин BgaA-TK97R (фиг. 3D). Освен това, клетки гостоприемници, експресиращи FBXW7R505C вариант, който проявява нарушена способност за разпознаване на циклин Е1 (субстрат на FBXW7) (фиг. S7E), показват намалено (~50 процента) K48 убиквитиниране на SPN, както и ~2-кратно по-висока преживяемост на SPN в сравнение с WT клетки (фиг. 3, F и G). Тези експерименти доказват ключовата роля на SCFFBW7 E3 лигазата в откриването на обитаващи цитозола патогени и насочването им към пътищата на убиване.

GSK3 -медиирано фосфорилиране на дегронов мотив потенцира антимикробната активност на SCFFBW7

Като цяло, F-box протеините разпознават фосфорилирани субстрати, за да насърчат тяхното убиквитиниране (34). Следователно ние изследвахме вероятността и въздействието на фосфорилиране на бактериални субстрати върху K48-Ub покритието на патогена. Биоинформационният анализ разкрива наличието на предполагаем фосфорилиран треонинов остатък (102VT*PKEE107) в дегроновата последователност в BgaA. Ние наблюдавахме, че SPN щамът, съдържащ BgaA-TT103A мутация (ΔbgaA:pBgaA-TT103A) (Фиг. 4A), проявява 71 процента намалена колокализация с K48-Ub в сравнение с WT (Фиг. 4B), разкривайки значението на фосфорилиране при разпознаване на субстрат от SCF комплекса.

Критично, намалената склонност на BgaA фосфорилиране в ΔbgaA: pBgaA-TT103A отмени способността на гостоприемника да елиминира вътреклетъчните бактериални натоварвания (~1.8-кратно) (Фиг. 4C). Паралелно с BgaA, PspA degron вариант (ΔpspA:pPspAT329A) също показа 51% спад в K48-Ub колокализация, което беше свързано с продължителна вътреклетъчна персистенция (фиг. S10, A до C). Като цяло, прицелните субстрати на SCFFBW7 имат треонин/серин (T/S*) до пролинов остатък, който е фосфорилиран от пролин-насочена протеин киназа, GSK3 (35-37). Затова се опитахме да разгадаем участието на GSK3 в увеличаването на разпознаването на субстрата.

Първо демонстрирахме, че GSK3 е тясно свързан с убиквитиниран SPN, маркиран с FBXW7 (фиг. 4, D и E). Впоследствие, чрез извършване на in vitro киназен анализ, ние наблюдавахме, че GSK3 може да фосфорилира рекомбинантен BgaA-T. В същото време вариантът BgaA-TT103A остава нефосфорилиран (фиг. 4F). Това потвърждава идентичността на треониновия остатък в дегроновата последователност на BgaA-T като мишена за GSK3 -медиирано фосфорилиране. Целевият нокдаун на GSK3 от siRNA (фиг. S7D) доведе до ~58% намаление на K48 убиквитиниране на SPN (фиг. 4G). Това намалено убиквитиниране, след регулиране надолу на експресията на GSK3, доведе до намалена способност на гостоприемника да изчисти нахлулите в клетката патогени (~1.5- пъти) (Фиг. 4H), но не показа никакъв ефект върху ΔbgaA : pBgaA-TT103A (фиг. S8, E и F). Взети заедно, това предоставя първото доказателство за киназа на гостоприемник, по-специално GSK3, регулираща убиквитинирането на бактериални повърхностни протеини за ефективно изчистване на патогени (фиг. 4I).

Убиквитинирането на цитозолни патогени придава различни съдби за тяхното елиминиране. По-специално, убиквитинирането на K48 насърчава насочването на субстрати към протеазомите (22). По подобен начин, нашите резултати предполагат връзка на убиквитиниран SPN с протеазомна субединица, 7 (фиг. S11, A и C). Освен това, протеазомното инхибиране чрез лечение с MG132 подобрява устойчивостта на WT SPN, но не променя способността за оцеляване на ΔpspAΔbgaA. Подобни фенотипове се наблюдават в случая на STm и ΔrlpA мутант (фиг. S11, B и D).

Наблюдението на патогените, ръководено от degron, предпазва гостоприемника от сепсис

След това се опитахме да определим въздействието на разпознаването на SPN чрез машината за клетъчно убиквитиниране върху резултатите от инфекцията. Използвайки установен модел на SPN сепсис (38), ние сравнихме вирулентността на ΔbgaA мутанта с тази на WT SPN, както и щамове, допълнени с BgaA-T (ΔbgaA:pBgaA-T) или версия без дегронова последователност ( ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron). В съответствие с предишни доклади (39), щамът с делеция на bgaA показа отслабена вирулентност, докато мишките, заразени с WT, ΔbgaA:pBgaA-T или ΔbgaA: BgaA-TΔDegron, се поддадоха на инфекция (фиг. 5A и фиг. S12, A до D) . Въпреки това, групата от мишки, заразени с SPN щам без последователност на degron, показва по-висок дял на смъртни случаи, но със забавена смъртност в сравнение с ΔbgaA:pBgaA-T–инфектираната група (P=0.0492, log-rank тест) (Фиг. 5А). Сравнението на бактериалното натоварване в кръвта (Фиг. 5B) и далака (Фиг. 5C) и времевия ход на видимите признаци на заболяване при заразени мишки (Фиг. 5D) потвърдиха тенденцията към повишена вирулентност в щама ΔbgaA: pBgaATΔDegron.

Предишни проучвания показват, че SPN сепсисът се установява от резервоар от бактерии в далака (38). Докато първата вълна от нахлуващи бактерии в кръвообращението се изчиства бързо от вродените имунни механизми на гостоприемника, част от SPN оцеляват и се размножават в макрофагите на далака, преди да се засеят отново в кръвта. Ние предположихме, че забавеното начало на тежко заболяване при мишки, заразени с ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron, може да е резултат от продължително оцеляване на SPN в макрофагите на далака, поради намалено вътреклетъчно разпознаване на бактерии от машината за убиквитиниране на гостоприемника. В подкрепа на това, ние наблюдавахме забавено начало на втората вълна на бактериемия при мишки, заразени с ΔbgaA: pBgaA TΔDegron щам в сравнение с ΔbgaA: pBgaA-T (24 часа срещу 12 часа), след ранната фаза на изчистване (Фиг. 5E).

Въпреки това, във фазата на затъмнение, по време на която бактериите се изчистват от кръвта, броят на бактериите в далака е постоянно по-висок в ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron-инфектирани мишки (фиг. 5F). Тези констатации предполагат, че фазата на разпространение на SPN в макрофагите на далака се удължава при липса на вътреклетъчно разпознаване на инфекция чрез машината за убиквитиниране. В резултат на това повишената бактериална плътност може да се натрупа в далака (фиг. 5F), като впоследствие се засява в кръвта в по-големи количества, което може да обясни забавената, но повишена смъртност на ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron-инфектирани мишки. Заедно тези данни показват, че разпознаването и убиквитинирането на вътреклетъчния SPN допринасят за контрола на гостоприемника на патогени по време на сепсис.

For more information:1950477648nn@gmail.com