Ефекти против стареене и инхибиране на тирозиназата на бутанолния екстракт от цветя на касия фистула, част 1

Резюме

Заден план: Натуралните продукти, произведени от растителни източници, се използват в различни козметични приложения като източник на хранене и като избелващ агент. Цветовете на Cassia fistula L, семейство Fabaceae, се използват като традиционно лекарство за кожни заболявания и заздравяване на рани и се съобщава, че притежават антиоксидантни свойства. Изследван е ефектът против стареене на екстракта от цветя на C. fistula върху фибробласти на човешка кожа.

Гликозидът на цистанхе може също така да повиши активността на SOD в сърдечните и чернодробните тъкани и значително да намали съдържанието на липофусцин и MDA във всяка тъкан, като ефективно улавя различни реактивни кислородни радикали (OH-, H₂O₂ и др.) и предпазва от увреждане на ДНК, причинено от ОН-радикали. Cistanche phenylethanoid гликозидите имат силна способност за изчистване на свободните радикали, по-висока редуцираща способност от витамин С, подобряват активността на SOD в сперматозоидната суспензия, намаляват съдържанието на MDA и имат известен защитен ефект върху функцията на мембраната на спермата. Полизахаридите Cistanche могат да повишат активността на SOD и GSH-Px в еритроцитите и белодробните тъкани на експериментално стареещи мишки, причинени от D-галактоза, както и да намалят съдържанието на MDA и колаген в белите дробове и плазмата и да увеличат съдържанието на еластин, имат добър очистващ ефект върху DPPH, удължава времето на хипоксия при стареещи мишки, подобрява активността на SOD в серума и забавя физиологичната дегенерация на белия дроб при експериментално стареещи мишки. С клетъчна морфологична дегенерация експериментите показват, че Cistanche има добра антиоксидантна способност и има потенциала да бъде лекарство за предотвратяване и лечение на заболявания, свързани със стареенето на кожата. В същото време, ехинакозидът в Cistanche има значителна способност да улавя свободните радикали DPPH и може да улавя реактивни кислородни видове, да предотвратява индуцираното от свободните радикали разграждане на колагена и също така има добър възстановителен ефект върху увреждането на аниона от свободните радикали на тимина.

Щракнете върху предимствата на Desert Cistanche

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Методи: Екстракцията с бутанол на цветята на C. fistula е завършена и активните съединения са класифицирани. Цитотоксичността на фибробластите беше оценена чрез SRB анализ, за ​​да се изберат нетоксични дози за по-нататъшни експерименти. След това синтезът на колаген и хиалуронова киселина (НА) беше измерен с помощта на комплекта за колаген и съответно ELISA. Освен това беше оценена и ензимната активност, включително колагеназа, матриксмелопротеиназа-2 (MMP-2) и тирозиназа.

Резултати: Установено е, че цветният екстракт не повлиява растежа на фибробластните клетки на кожата (IC50 > 200 ug/mL). Резултатите показват, че екстрактът от цветя значително повишава синтеза на колаген и НА в зависимост от дозата. Екстрактът от цветя (50–200 ug/mL) също значително инхибира активността на колагеназата и MMP-2. Освен това, този екстракт от цветя може да инхибира активността на тирозиназата, която причинява хиперпигментация, която предизвиква стареене на кожата.

Изводи: Екстрактът от цветя на C. fistula показва превантивен ефект, когато се използва за цели против стареене във фибробласти на човешка кожа и може да бъде подходящ избор за козметични продукти, които имат за цел да осигурят избелващ ефект и които са определени като продукти за грижа за кожата на лицето против стареене .

Ключови думи: Колагеназа, Синтез на колаген, Глюкозаминогликан, Хиалуронова киселина, Матрична металопротеиназа

Заден план

Стареенето на кожата е сложна биохимична прогресия, произтичаща от много индивидуални вътрешни и външни фактори като възраст, хормони и излагане на UV светлина [1]. Прогресията настъпва в епидермалните и дермалните слоеве и е свързана главно с разграждането на екстрацелуларния матрикс (ECM) [2]. Ензимите, участващи в разграждането на ECM, са матрични металопротеинази (MMPs) като желатинази (MMP-2) и колагеназа [3]. Кожата губи своята якост на опън поради ефекта от разграждането на ECM от MMP. В този процес се появява набръчкване на кожата и също така забележимо възникват грапавини и сухота заедно с някои пигментни аномалии като хипо- или хиперпигментация [2, 4]. За лечение на хиперпигментация са изследвани тирозиназни инхибитори. Тирозиназата е ензим, ограничаващ скоростта, който превръща тирозина в меланин [5]. По този начин тирозиновите инхибитори играят важна роля като агенти за изсветляване на кожата [6], докато синтезът на хиалуронова киселина (HA) регулира хидратацията на кожата и появата на бръчки. HA, несулфатиран гликозаминогликан (GAG), се състои от повтарящи се единици дизахариди, включително D-глюкуронова киселина и N-ацетил-Dглюкозамин [7]. HA също така регулира възстановяването на тъканите, включително засилване на отговора на имунната система чрез активиране на възпалителни клетки и в отговор на увреждане на фибробласти [8–10].

Естествени продукти, произведени от растителни източници като Glycyrrhiza glabra [11] или зелен чай [12], се използват в козметични приложения като източник на хранене и като избелващ агент. Значително количество доказателства сочат полезните ефекти на орално или локално прилагани фитохимикали от растителни екстракти, особено за подобряване на състоянието на кожата. Някои примери за полезните ефекти са, че стареенето на кожата и възпалението на кожата могат да бъдат намалени. C. fistula (златен душ), семейство Fabaceae, се среща в много азиатски страни като Тайланд, Китай, Мианмар и Индия. В предишни проучвания беше установено, че екстрактът от цветя на C. fistula притежава антиоксидантни, противоракови, антибактериални, противогъбични и антидиабетни свойства [13, 14]. Известно е, че ефектът на C. fistula в аюрведичната медицина участва в лечението на различни заболявания, включително кожни заболявания, проказа, хематемеза, пруритус и диабет [15, 16]. Различни части от C. fistula са показали фармакологични свойства [17]. Цветя, семена, плодове и пулп са били използвани за лечение на кожни заболявания, включително проказа [18]. Пулпът е признат за своите антидиабетни свойства [15] и е използван в тоник, който се прилага при лечение на подагра и ревматизъм [19]. Листата и зрелите шушулки традиционно се използват като слабително [20, 21]. Съобщава се също, че фенолните и флавоноидните фитохимикали на C. fistula са полезни при лечение на кожни заболявания [14]. Ето защо в това изследване се интересуваме от ролята на екстракта от цветя на C. fistula в козмецевтичните приложения. Изследвани са превантивните ефекти от разграждането на ECM заедно с ензимите за стареене на кожата, които включват активности на колагеназа и MMP-2, както и тирозиназа. Освен това е определен синтезът на колаген и НА.

Методи

Химикали и реактиви

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), DQ желатин и пеницилин-стрептомицин бяха доставени от Gibco (Grand Island, NY, USA). Фетален говежди серум (FBS) беше доставен от Thermo Scientific (САЩ). Комплектът за оцветяване с колаген Sirius Red/Fast Green е закупен от Chondrex, Inc. (Редмънд, Вашингтон, САЩ). Сулфородамин В реагент, хиалуронова киселина и тирозиназа от гъби са получени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ).

Растителни материали

Цветовете на C. fistula са получени от Lampang Herb Conservation, провинция Lampang, Тайланд. Номерът на екземпляра на ваучер (023197) е заверен от Wannaree Charoensup, ботаник в хербариума на флората на Тайланд, Факултет по фармация, Университет Чианг Май, Тайланд.

Приготвяне на екстракт от цветя на касия фистула

Цветовете на C. fistula се изсушават в проветрива стая и след това 500 g изсушени цветове се смилат на прах. След това прахът се накисва в 50 процента етанол и след това се разклаща при 70 rpm в продължение на 24 часа. След 24 часа пробите се филтруват през филтърна хартия за отделяне на остатъка. Остатъкът се накисва в 50 процента етанол и се разклаща при 70 rpm в продължение на 24 часа и този етап се повтаря 2 пъти. Филтрираните проби се събират заедно и се изпаряват чрез ротационен вакуумен изпарител (BUCHI, Швейцария), за да се получат водните фракции. Към водната фракция се добавя хексан в съотношение на хексан 2:1. Пробите се разклащат и се оставят да се разделят в продължение на 30 минути. Пробите бяха разделени на две фракции, които бяха хексанова и водна фракции. След това водната фракция се събира и се добавят 10 процента въглен за период от 30 минути с леко разбъркване при стайна температура. Пробите се филтруват през филтърна хартия и целит за отделяне на въглен. Пробите се смесват с наситен бутанол в съотношение на наситен бутанол 2:1 и пробите се оставят да се разделят за период от 12 часа и този етап се повтаря 3 пъти. Пробите се разделят на две фракции, които включват вода и бутанол. Допълнително се добавя вода към бутаноловите фракции до равен обем и тези фракции се оставят да се изпарят чрез използване на ротационен вакуум изпарител. Изпарените проби се сушат чрез замразяване, за да се получи прахът от екстракт от цветя на C. fistula.

Количествено определяне на общото фенолно съдържание в екстракт от цветя на C. fistula с помощта на UV-видим спектрофотометър

Общото фенолно съдържание в екстракта от цветя на C. fistula се определя с помощта на анализа на Folin-Ciocalteu. Накратко, 0.4 mL цветен екстракт от C. fistula се смесват с 0.3 mL 10 процента реагент на Folin-Ciocalteau и се инкубират на тъмно при стайна температура в продължение на 3 минути . След това бяха добавени 0.3 mL разтвор на натриев карбонат и разтворът беше допълнително инкубиран на тъмно при стайна температура в продължение на 30 минути. Абсорбцията беше оценена при 765 nm с помощта на UV-видим спектрофотометър. Концентрацията на общото фенолно съдържание се изчислява и се сравнява със стандартна крива за галова киселина (GA) при 0–20 ug/mL. Общото фенолно съдържание се отчита като милиграми GA еквиваленти на грам C. fistula. екстракт от цветя (mg GAE/g екстракт).

Количествено определяне на фенолни съединения в екстракт от цветя на C. fistula чрез HPLC анализ

Различни видове фенолни съединения в екстракти от цветя на C. fistula бяха анализирани с помощта на HPLC анализ и след това бяха сравнени със стандартна галова киселина, катехини, протокатехинова киселина, ванилова киселина, хлорогенова киселина, ферулинова киселина и кумарова киселина. Екстрактите от цветя се разтварят в 50 процента етанол и се оценяват допълнително чрез HPLC (Agilent Technologies, Калифорния, САЩ), като се използва колона С18 с обърната фаза (ВОДА, Масачузетс, САЩ). Подвижната фаза се състои от метанол (А) и 0.1 процента трифлуорооцетна киселина (TFA) във вода (В) с градиентни условия. Скоростта на потока беше настроена на 1.0 mL/min и дължината на вълната на откриване беше записана при 280 с UV детектор. Нивата на концентрация на фенолните съединения се изчисляват и се сравняват със стандартната крива, като се вземат предвид стандартните концентрации и пиковите площи (mg/g екстракт).

Количествено определяне на общото флавоноидно съдържание в екстракт от цветя на C. fistula с помощта на колориметричен анализ

Общото съдържание на флавоноиди се определя чрез колориметричен анализ с модифициран алуминиев хлорид (AlCl3), както беше описано по-горе [22]. Накратко, 0.25 mL цветен екстракт се смесва с 0.125 mL 5 процента натриев нитрит (NaNO2) и разтворът се инкубира в продължение на 5 минути при стайна температура. След това, 0.125 mL от 10 процента AlCl3 се смесва в сместа и се държи на тъмно в продължение на 5 минути. След това се добавя 1 mL натриев хидроксид (NaOH) и разтворът се инкубира в продължение на 15 минути при стайна температура на тъмно. Абсорбцията се измерва при 510 nm с помощта на UV-видим спектрофотометър. Общото съдържание на флавоноиди се изчислява и сравнява със стандартните стойности на катехин и се изразява като mg катехинов еквивалент на грам екстракт (mg CE/g екстракт).

Клетъчни култури

Първични фибробласти на човешка кожа бяха асептично изолирани от коремен белег след хирургична процедура, включваща раждане с цезарово сечение в хирургичното отделение на болница CM Maharaj, университет Chiang Mai (Чианг Май, Тайланд) (Код на изследването: BIO-2558-03549 одобрен от Medical Комитет по етика на научните изследвания, Университет Чианг Май). Мазнината се отстранява от изходния материал и се накисва в DMEM, съдържащ анти-пеницилин и стрептомицин. След това кожата се потапя в DMEM, съдържащ 1% протеаза (Dispase, Gibco, Grand Island, NY, USA) за 48 часа при 4 градуса. Епидермалните слоеве бяха отстранени и нормалните фибробласти бяха изолирани от дермата. Фибробластите се култивират в DMEM, допълнен с 10 процента FBS, 2 mM L-глутамин, 50 U/mL пеницилин и 50 ug/mL стрептомицин. Клетките се поддържат в 5 процента CO2 овлажнен инкубатор при 37 градуса.

Анализ на клетъчната жизнеспособност

Анализът на клетъчната жизнеспособност на екстракт от цветя на C. fistula срещу кожни фибробластни клетки се измерва с помощта на анализ на сулфородамин В (SRB), както беше описано по-горе [23]. Накратко, клетките (8x103 клетки/ямка) се посяват в 96-плака с ямки и се инкубират при 37 градуса, 5 процента CO2 за 24 часа. След това клетките бяха третирани с или без различни концентрации (0–200 ug/mL) екстракт от цветя на C. fistula в продължение на 48 часа. След 48 часа към клетките се добавят 10 процента (w/v) трихлороцетна киселина (TCA) и след това клетките се инкубират при 4 градуса за 1 час. Средата се отстранява и клетките се изплакват с бавно течаща чешмяна вода. 0,057 процента (w/v) разтвор на SRB (100 μL) се добавя към всяка ямка и клетките се инкубират в продължение на 30 минути при стайна температура. Разтворът на SRB се отстранява и след това клетките се промиват 4 пъти с 1 процент (v/v) оцетна киселина и се оставят да изсъхнат при стайна температура. Багрилото се разтваря с 10 mM Tris основен разтвор (рН 10.5) и абсорбцията се измерва при 510 nm с помощта на четец на микроплаки.

Анализ на синтеза на колаген

Общият вътреклетъчен колаген във фибробластните клетки се определя с помощта на комплект за оцветяване на колаген Sirius Red/Fast Green (Chondrex, Inc, Redmond, WA, USA) съгласно инструкциите на производителя. Накратко, кожни фибробластни клетки се посяват в 24-ямкови плаки за 24 часа при 37 градуса, 5 процента CO2. След това клетките бяха предварително третирани с безсерумна DMEM среда за 24 часа. Средата се отстранява и след това клетките се инкубират с или без екстракт от цветя на C. fistula (0-150 ug/mL) в продължение на 48 часа. След 48 часа култивираната среда се отстранява. След това клетките се промиват с PBS и се фиксират с фиксатор Kahle за 10 минути. Фиксаторът се отстранява и клетките се промиват с PBS. Разтворът на багрилото Sirius Red/Fast Green се добавя към всяка ямка и пробите се инкубират в продължение на 30 минути при стайна температура. Багрилото се отстранява и клетките се промиват четири пъти с DI вода или докато течността стане безцветна. Накрая беше добавен буферът за екстракция и абсорбцията беше измерена при 540 nm и 605 nm с помощта на UV-видим спектрофотометър.

Анализ на колагеназната активност

Колагеназната активност се измерва с помощта на модифициран флуорогенен DQ™-желатинов анализ, както беше описано по-рано [24]. Накратко, различни концентрации на екстракт от цветя на C. fistula (0–200 ug/mL) се добавят към 96-ямкови плаки. Една U/ml колагеназа се добавя във всяка ямка (100 μL/ямка). След това се добавят 15 ug/mL желатин (DQ желатин) и смесите се инкубират в продължение на 10 минути. Скоростта на протеолиза се определя чрез измерване на абсорбцията на интервали от 2 минути за 20 минути, като се използва четец на микроплаки при дължина на вълната на възбуждане от 485 nm и дължина на вълната на излъчване от 528 nm. Ензимната активност се оценява чрез изследване на наклона на линейната регресия между времето и абсорбцията за период от 2-6 минути.

Анализ на активността на MMP-2

Активността на MMP{{0}} се определя чрез желатинова зимография, както беше описано по-рано [25]. Фибробластните клетки се култивират в среда без серум DMEM за 24 часа. След това се събира супернатантата от културата. Супернатантата на културата беше подложена на 10 процента полиакриламидни гелове, съдържащи 0.1 процента w/v желатин при нередуциращи условия. Геловете се промиват два пъти с 2,5 процента обем/обем на Triton X-100 за 30 минути при стайна температура за отстраняване на SDS. Гелната плоча се нарязва на резени, които съответстват на лентите и след това срезовете се поставят в различни резервоари и се инкубират с активиращ буфер (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4), съдържащ различни концентрации на C екстракт от цвят на фистула (0–200 ug/mL) при 37 градуса за 18 часа. След това лента от геловете се промива и оцветява с Coomassie Brillant Blue R (0,1 процента w/v) и след това се обезцветява в 30 процента метанол и 10 процента оцетна киселина. Активността на MMP-2 се появи като ясна лента на син фон. Лентите на храносмилането се определят количествено чрез програмата Image J.

Анализ на синтеза на хиалуронова киселина (HA) чрез ELISA

Ефектът на екстракта от цветя на C. fistula върху синтеза на НА се определя с помощта на комплект ELISA, както е описано по-горе [26]. Фибробластните клетки (5.0 × 104 клетки/ямка) се посяват в 24-плаки с ямки за 24 часа при 37 градуса, 5 процента CO2. Клетките бяха предварително третирани в среда без серум в продължение на 6 часа и след това бяха третирани с или без различни концентрации на екстракт от цветя на C. fistula (0–200 ug/mL) в продължение на 48 часа. Култивираната среда се събира и синтезът на НА се измерва чрез ELISA. Абсорбцията се измерва при 450 и 570 nm с помощта на четец на микроплаки. Концентрацията на НА в култивирания супернатант, получен от третираните фибробластни клетки, се изчислява и сравнява със стандартната крива на НА.

Тест за инхибиране на тирозиназа

Тестът за инхибиране на тирозиназа се определя, както е описано по-горе [27]. Различни концентрации на екстракт от цвят на C. fistula бяха добавени към 96-плака с ямки. Реакцията се провежда в натриев буфер (рН 6.4), съдържащ 100 U/mL гъбна тирозиназа. L-DOPA субстрат (1 тМ) се добавя към реакционната смес и след това се инкубира в продължение на 10 минути при стайна температура. Промяната на абсорбцията при 490 nm се измерва на всеки 1,5 минути в продължение на 15 минути с помощта на четец на микроплаки. Процентното инхибиране на тирозиназата се изчислява по следната формула:

Анализ на антиоксидантната активност

Антиоксидантната активност на екстракта от цветя на C. fistula се определя с помощта на 1, 1-дифенил-2-пикрилхидразил (DPPH)- свободна радикална активност, както е описано по-рано [28]. Различни концентрации на цветния екстракт (0–100 ug/mL) се приготвят в метанол. 1 mL от 0,002 процента DPPH се добавя към 1 mL от разтвора на цветен екстракт и сместа се държи на тъмно в продължение на 30 минути. Абсорбцията се измерва при 517 nm с помощта на спектрофотометър. Процентът на инхибиране беше изчислен и сравнен със стандартен витамин Е (1-100 ug/mL), като се използва следната формула:

Антиоксидантната активност на цветните екстракти от C. fistula се потвърждава с помощта на ABTS анализ, както беше описано по-рано [29]. ABTS [2, 2′-азино-бис (етилбензтиазолин-6-сулфонова киселина)] радикален катион се получава чрез смесване на 7 mM изходен разтвор на ABTS с 2,45 mM калиев персулфат (K2S2O8) (1/1, v/v). Сместа се инкубира на тъмно в продължение на 12-16 часа до завършване на реакцията. Анализът се провежда върху 990 μL разтвор на ABTS и 10 μL екстракт от цветя (0–4 ug/mL). След 6 минути абсорбцията се записва веднага при 734 nm с помощта на спектрофотометър. Процентът на инхибиране на ABTS активността на екстракта от цветя се изчислява, като се използва следното уравнение:

Статистически анализ

Всички данни са представени като средни стойности ± стандартно отклонение (SD). Статистическият анализ беше анализиран от софтуера Prism версия 6.0 с помощта на еднопосочен ANOVA с тест на Dunnett. Статистическата значимост се определя при * p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0,001 или **** p < 0,0001.

Резултати

Фитохимична характеристика на екстракт от цветя на C. fistula

След етапа, включващ сушене чрез замразяване на пробите, екстрактът от цветя на C. fistula беше претеглен и допълнително подложен на фитохимични и биологични изследвания. 18.08 g цветен екстракт от C. fistula бяха получени от 500 g суров материал и процентният добив на цветния екстракт беше 3,62. HPLC пръстовият отпечатък на екстрактите от цветя на C. fistula се определя чрез HPLC анализ (фиг. 1). HPLC профилът, който показва пика на фенолните съединения, е белязан по отношение на отделните компоненти при всяко време на задържане. Характеристиката на фенолните съединения на цветен екстракт от C. fistula е показана в таблица 1. Общото фенолно съдържание в цветния екстракт е 275,32 ± 14,21 mg GAE/g екстракт. Установено е, че производните на хидроксибензоената киселина, включително ванилова киселина и протокатехинова киселина, са {{20}}.95 ± 0.09 и 2.56 ± 0. 42 mg/g екстракт, съответно, докато галовата киселина е записана при {{30}}.60 ± 0.02 mg/g екстракт. Производните на хидроксиканелената киселина, включително кумарова киселина, ферулова киселина и хлорогенова киселина, бяха открити съответно при 0,39 ± 0,08, 0,80 ± 0,09 и 0,83 ± 0,03 mg/g екстракт. Съдържанието на флавоноиди е 27,62 ± 3,56 mg CE/g екстракт. Катехинът, като производно на флавонол, е измерен при 1,10 ± 0.00 mg/g екстракт.

【За повече информация:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】