Ефект против стареене на уролитин А върху говежди ооцити in vitro
Aug 30, 2022
Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация
Резюме:Оксидативният стрес и митохондриалната дисфункция се свързват със свързаното с възрастта влошаване на качеството на яйцеклетките и в момента се поставят под въпрос стратегии за тяхното предотвратяване. Уролитин А (UA) е естествен метаболит с проапоптотични и антиоксидантни ефекти, способен да предотврати натрупването на дисфункционални митохондрии в клетки с различна възраст. UA никога не е тестван в говежди овоцити. Нашата цел беше да проучим ефекта на UA върху потенциала за развитие на експресията на кумулус-ооцитни комплекси (COCs) и гранулозни клетки (GCs) на важни гени, свързани с репродуктивната компетентност. Прогресията на ядреното съзряване, потенциалът на митохондриалната мембрана (MMP) и компетентността за развитие на физиологично зрели (22 h) и in vitro остарели овоцити (30 h IVM), получени от препубертетни и възрастни жени, допълнени с UA или не, бяха оценени. Освен това, количеството на mRNA на няколко гена (NFE2L2, NQO1 и mt-DN5) и броят на mt-ND5 ДНК копия бяха количествено определени в култивирани GCs от препубертетни и възрастни жени, допълнени с UA или не. Нашето проучване потвърди вредния ефект от стареенето на ооцитите върху прогресията на ядреното съзряване, MMP, компетентността за развитие и нивата на генна експресия. Лечението с UA по време на in vitro съзряване е подобрено (стр<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">
Моля, щракнете тук, за да научите повече
Ключови думи:овоцит; стареене; Уролитин А; асистирани репродуктивни технологии
1. Въведение
Намаляването на женската репродуктивна способност е една от първите физиологични функции, засегнати неблагоприятно от стареенето и поради това се счита за възникващ здравен проблем в световен мащаб [1,2]. В допълнение към няколко патологични проблема, свързаното с възрастта намаляване на женския фертилитет до голяма степен се дължи на намаляване на яйчниковия резерв на яйцеклетките [1, 3-5], свързано с зависимото от времето влошаване на тяхното качество [2]. Този процес на влошаване може да възникне поради излагането на ооцитите на остаряла овариална микросреда преди овулацията. В допълнение, женската гамета често е подложена на стареене след овулация, когато процесът на оплождане не настъпи в рамките на най-добрия оптимален период от време и неоплоденият овоцит остава в яйцепровода или in vitro преди инсеминацията за продължителни периоди [6] Увреждането на Качеството на овоцитите е критичен фактор, свързан с неуспеха на асистираните репродуктивни технологии (ART), тъй като качеството им е основният определящ фактор за потенциала за развитие на ембриона след оплождане [7,8]. Често се съобщава, че асинхронността на овулацията и остарелите овоцити влошават успеха на програмите за изкуствено осеменяване и производство на ембриони при кобили, говеда и овце, което предполага значителни икономически загуби [1,9,10]. Ето защо е от първостепенно значение да се изследват механизмите, лежащи в основата на стареенето на ооцитите, за да се проектират по-добри терапевтични подходи за спасяване на плодовитостта при няколко вида, включително хора, а също и като инструмент за генетично подобряване на добитъка.cistanche wirkungОсобено внимание трябва да се обърне на подобряването на капацитета за развитие на яйцеклетките от препубертетни говеда, които често се използват за ускоряване на генетичното придобиване и съкращаване на интервалите между поколенията.
Една от основните причини за нарушена компетентност за развитие на остарелите овоцити е увеличаването на оксидативния стрес, което предизвиква митохондриална дисфункция, увреждане на ДНК и грешки при формирането на вретено, влияещи върху качеството на овоцитите [1]. Добре установено е, че повишеното производство на свободни радикали е причина за клетъчно стареене при няколко хронични заболявания, а също и в репродуктивната биология, което води до лоши резултати за плодовитостта [12]. Овариалната микросреда, която включва ооцити и гранулозни клетки (GCs), осигурява антиоксидантен защитен механизъм, способен да регулира окислителните условия и да поддържа баланса оксидант/антиоксидант [13]. Въпреки това, по време на процеса на стареене, ефективността на антиоксидантната защита за неутрализиране на реактивните кислородни видове (ROS) се отслабва, като по този начин се повишава нивото на оксидативен стрес. Свързаният с ядрен фактор E2-фактор2 (Nrf2 или NFE2L2), известен също като Nrf2/подобен на Kelch ECH-асоцииран протеин 1 (Keap1) път, е доминантна каскада от реакции, активирана от оксидативен стрес[14]. Този път е клетъчен защитен механизъм, който клетките са разработили, за да се справят с вредните ефекти на оксидативния стрес. При нормални условия, Nrf2 се регулира отрицателно от Keap1, задържа се в цитоплазмата и се поддържа на ниски нива. Когато е изложен на оксиданти, Nrf2 се дисоциира от Keapl, което позволява неговата транслокация в ядрото, където се свързва със специфични ДНК последователности. Тези последователности, наречени елементи на антиоксидантен отговор (ARE), водят до транскрипционно активиране на цитопротективни гени, като NAD(P)H:хинон-оксидоредуктаза-1 (NQO1), хем оксигеназа-1 (HMOX1) и каталитична субединица на глутамат-цистеин лигаза (GCLC)[15,16]. Предишни проучвания показват, че активирането на сигналния път на Nrf2-Keapl намалява увреждането от оксидативен стрес чрез повишаване на нивата на антиоксиданти в човешки GCs и яйчници на мишки[17,18]. Въпреки това, неговата роля в процеса на стареене на женските гамети остава неуловима, въпреки че е ясно установено, че митохондриите са основното място за производство на ROS по време на този процес [9,10].
Cistanche може да спре стареенето
Обратно, митохондриите участват в няколко критични клетъчни функции и са основни за посрещане на търсенето на производство на енергия, необходимо по време на узряването на ооцитите и последващото ембрионално развитие [19]. Компетентната митохондриална активност е силно свързана с по-високо съдържание на митохондриална ДНК (mt-DNA) и генериране на АТФ [20], по-висок потенциал на митохондриалната мембрана [21] и поддържане на качеството и количеството на митохондриите чрез митофагия [22]. Освен това се предполага, че митохондриалната активност е пряко свързана с жизнеспособността на ембриона и по-добрите резултати за плодовитостта [23]. Все повече доказателства подкрепят, че свързаните с възрастта митохондриални промени водят до стареене на яйчниците и впоследствие намалена жизнеспособност на ембриона и имплантационен потенциал. Тези промени включват намален брой копия на mt-ДНК, намалено генериране на АТФ [20], промени в експресията на митохондриален ген [24, увреждане на mt-ДНК [25] и намален потенциал на митохондриалната мембрана [26].
Терапевтичните подходи, насочени към митохондриите, предизвикаха огромен интерес към няколко патологии, свързани със стареенето, поради големия им потенциал за подобряване на митохондриалната функция [27]. В рамките на тази рамка е доказано, че уролитин А (UA) – естествен метаболит, получен след поглъщане на храна като нарове, последвано от преобразуването му от чревната микробиота – предотвратява натрупването на дисфункционални митохондрии с възрастта, предизвиквайки митофагия и поддържайки митохондриите биогенеза и респираторен капацитет [28,29]. UA се прилага като обещаващо терапевтично лекарство за предотвратяване на някои видове рак, като колоректален рак и рак на простатата [30,31]. Освен това UA също има противовъзпалителни свойства [32], против затлъстяване [33], антиоксидант [34] и свойства против стареене [35].цитрусови биофлавоноидиСкорошно проучване подчертава ефектите от добавянето на UA към стареещи фибробласти на човешка кожа върху активирането на пътя на Nrf2-Keapl, повишавайки техния антиоксидантен капацитет. Това активиране на пътя на Nrf2-Keapl ефективно смекчава нивото на ROS, чрез регулиране на експресията на Nrf2 надолу по веригата ARE-реагиращи гени (SOD, NQO1, GCLC и HMOX1), което показва обещаващ ефект против стареене [ 35].
Проведени са няколко проучвания с цел забавяне на стареенето на яйчниците, като по този начин се подобри качеството на яйцеклетките и резултатите от фертилитета. Поради приноса на оксидативния стрес към процеса на стареене на яйчниците, както и към митохондриалната дисфункция, добавките с антиоксиданти се явяват като обещаваща терапия [36,37]. Въпреки това, не е известно дали добавката с уролитин А може да възстанови щетите, настъпили по време на стареенето на яйчниците, допринасяйки за предотвратяване на проблеми с безплодието. Следователно, целта на това проучване беше: (1) да се демонстрира, че стареенето може да промени потенциала за развитие на кумулус-ооцитни комплекси (COC) и експресията на GC на важни гени, участващи в сигналния път на Nrf2; (2) да се определи дали UA може да спаси женски фертилитет, демонстриращ ефект против стареене при остарели COC и GC; и (3) за оценка на ефекта на UA върху нивото на експресия на гени, включени в Nrf2 сигналния път, както и върху качеството на ооцитите.
2. Материали и методи
2.1. Експериментален дизайн
Това проучване е одобрено от Комитета за грижа за животните към Националния ветеринарен орган (N степен 08965DGAV), следвайки указанията на Европейския съюз (№.86/609/EEC). За изследване на ефекта от стареенето върху промяната на качеството на ооцитите и потенциалния ефект против стареене на UA, модел, използващ КОК, събрани от препубертетни и възрастни крави, подложени на стареене in Vitro (30 часа съзряване) или на физиологично съзряване (22 з) приложени са процеси.
2.1.1. Предишен анализ — изследване на доза-отговор
Предишен анализ за определяне на концентрацията на UA, която трябва да се използва по време на процеса на узряване на говежди КОК, беше извършен на базата на изследване доза-отговор в четири сесии. Тъй като UA никога не е бил тестван в говежди овоцити, бяха използвани предишни дози, успешно приложени за превенция и смекчаване на някои видове рак и за демонстриране на ефекта против стареене на UA в различни клетъчни линии [28,39]. COC, получени от препубертетни и зрели възрастни крави (n=978) бяха избрани и след това произволно разделени на пет групи за тестване на различни дози UA: контрола, 1, 10, 25 и 50 uM по време на физиологично in vitro съзряване. След периода на узряване, някои ооцити (n=154) бяха оцветени, за да се определи хромозомната конфигурация и етапите на узряване. Останалите узрели овоцити бяха подложени на ин витро инсеминация със замразена/размразена сперма. Предполагаемите зиготи бяха култивирани и скоростта на разцепване и бластоциста беше определена съответно на ден 2 и ден 7 от културата. Въз основа на получените резултати, а именно липсата на вредни ефекти и насърчаването на узряването и развитието на бластоциста, беше избрана концентрация от 1 uM UA.
2.1.2.Опит1
В този експеримент, проведен в шест сесии, КОК от предпубертетен период (средна възраст=9 месеца, n=660) и възрастни (средна възраст =39 месеца, n=674) крави бяха събрани, за да се оцени качеството на овоцитите и потенциала за развитие на остарели и физиологично узрели овоцити, както и ефекта на UA за спасяване на женския фертилитет. КОК бяха разделени на случаен принцип в 8 групи: (1) контролна препубертетна група, КОК от препубертетни телета, зрели за 22 часа (n=148); (2)UA препубертетна група, КОК от препубертетни телета, зрели в среда, допълнена с 1 uM от UA за 22 часа (n=155); (3) контролна група на възраст 30 часа преди пубертета, КОК от телета в предпубертет на възраст до 30 часа съзряване in oitro (n =149); (4) UA на възраст 30 часа препубертетна група, COCs от препубертетни телета, остарели in vitro в продължение на 30 часа в среда за зреене, допълнена с 1 uM UA(n=144); (5) контролна възрастна група, COCs от възрастни крави, зрели 22h (n=155 );(6) UA група възрастни, COCs от възрастни крави, зрели в среда, допълнена с 1 uM UA за 22 часа (n=129);(7) контрола на възраст 30 h възрастна група, COCs от възрастни крави на възраст до 30 часа съзряване in oitro (n=148); и (8) група възрастни UA на възраст 30 часа, COCs от възрастни крави, остарели in oitro в продължение на 30 часа в среда за зреене, допълнена с 1 uM UA(n=138).ползи от cynomoriumСлед съответните периоди на съзряване in vitro, овоцитите бяха осеменени с размразена капацитирана бича сперма. Впоследствие беше оценено ембрионалното развитие, като се оцени както скоростта на разцепените и произведените ембриони, така и тяхното качество.
Освен това, в този експеримент, КОК от всяка група бяха извлечени, за да се оцени техният етап на ядрено съзряване (контролна група преди пубертета, n=7; UA група преди пубертета, n =7; контролна група на възраст 30 часа преди пубертета, n{ {3}}; UA на възраст 30 h предпубертетна група, n=6; контролна група възрастни, n=16; UA група възрастни, n=21; контролна възраст на 30 h група възрастни, n{ {9}}; UA на възраст 30 h възрастна група, n=18). Потенциалът на митохондриалната мембрана (MP) на КОК също беше оценен (контролна препубертетна група, n=10; UA препубертетна група, n{ {13}};контролна група на възраст 30 часа преди пубертета,n=9;група UA на възраст 30 часа преди пубертета,n=9;контролна група възрастни, n=15; група възрастни UA, n{ {19}}; контролна група на възраст 30 часа, n=10; UA на възраст 30 часа група възрастни, n=14).
2.1.3.Опит2
Тъй като GCs играят съществена роля в растежа на фоликулите и развитието на ооцитите, беше извършен втори експеримент в пет сесии за по-нататъшно изследване на ефекта на възрастта и UA върху експресията на NFE2L2, NQO1 и mt-ND5. Броят на копията на гена mt-ND5 също беше оценен. GC бяха получени след центрофугиране на фоликуларната течност, аспирирана от яйчниците на препубертетни (средна възраст=10 месеца) и възрастни крави (средна възраст =62 месеца). Тези клетки се култивират при следните условия: (1) препубертетен контрол, култура на GCs на препубертетни телета; (2) препубертетен UA, култура на GCs на препубертетни телета, допълнен с 1 uM UA; (3) възрастен контрол, култура на GCs на възрастни крави; и (4) възрастни UA, културата на GCs на възрастни крави, допълнена с 1 uM UA. След сливането на GCs на 5-ия ден от култивирането, те бяха моментално замразени в течен азот и по-късно ДНК и РНК бяха извлечени, позволявайки последващо количествено определяне на NFE2L2, NQO1 и mt-ND5 mRNA транскрипти, както и броя на копията на mt-ND5.
2.2. Събиране на ооцити и ин витро съзряване
Яйчниците от възрастни и предпубертетни крави (предишен анализ, n {{0}} и експ. 1, n=1334) бяха събрани в местна кланица и държани при 35-37 степен, в фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (PBS), допълнен с 0.15 процента говежди серумен албумин (w/v, BSA), допълнен с 0,05 mg mL-l канамицин. В лабораторията яйчниковите фоликули с диаметър 2-8 mm бяха аспирирани с 19-игла за измерване. Само COC с най-малко три слоя компактни кумулусни клетки и хомогенна ооплазма бяха промити и избрани за узряване съгласно експерименталния дизайн.пустинен зюмбюлУзряването е извършено в инкубатор при 38,8 градуса, 5 процента CO2 във влажен въздух за 22 или 3 0 часа в среда за зреене, съставена от среда за тъканна култура 199 (TCM) с 10 процента фетален говежди серум, 0,2 mM натрий пируват, 10 ng mL-l епидермален растежен фактор и 10 μL mL-l гентамицин【40】.
2.3. Събиране и култура на Granulosa клетки
Гранулозни клетки бяха получени от възстановената фоликуларна течност след центрофугиране за 10 min при 200x g[41]. Пелетата се суспендира в 1 mL културална среда (TCM199 плюс 10 процента серум), за да се извърши друго центрофугиране за 5 минути. Новата пелета се ресуспендира в 1 mL културална среда, допълнена с 1 uM UA или не, в съответствие с експерименталния план, и се хомогенизира със спринцовка, прикрепена към 19G-игла, най-малко 30 пъти, за да се отделят клетките. След оценка на жизнеспособността на GC (багрило трипаново синьо, 0,4 процента w/v), клетките се посяват при концентрация от 2 × 105 жизнеспособни клетки mL-1 и се култивират в продължение на пет дни при 38,8 градуса, 5 процента CO2 във влажен атмосфера до сливане. На всеки 48 часа културалната среда се изхвърля и се освежава с нова. За екстракция на ДНК и РНК, GCs се събират и промиват чрез центрофугиране при 200x g за 10 минути. Клетъчните пелети се ресуспендират в 1 mL PBS, веднага се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80 градуса.
2.4. Ядрено съзряване на ооцита
Етапите на ядрено съзряване бяха оценени след 22-часовия или 30-часовия период на съзряване in vitro.Метод за екстракция на флавоноиди pdfОголените ооцити се фиксират в разтвор на оцетна киселина/етанол (1:3, обем/обем) и се поддържат при 4 градуса за 48 часа. След това ооцитите се оцветяват с 1% ацето-лакмоиден разтвор, монтират се в камера на Neubauer и се наблюдават под фазов контрастен микроскоп (Olympus BX41). Ооцитите са класифицирани както следва: зародишни везикули (GV), кондензиращи хромозоми I (CCI), кондензиращи хромозоми II (CCII), диакинеза, анафаза-I/телофаза-I (AI/TI) и MII (метафаза-II) . Бяха взети предвид само ооцити с видимо оцветяване с хроматин [42].
2.5. Оценка на потенциала на митохондриалната мембрана
За измерване на митохондриалния мембранен потенциал (MP), индикатор за митохондриална активност, митохондриите се оцветяват с 5, 6, 6'-тетрахлоро-1, 1', 3, 3'тетраетилбензимидазолкарбоцианин йодид (JC-1 , Invitrogen, Waltham, MA, САЩ). Оголените ооцити се инкубират с 5 ug mL-l JC-1 [37] в среда за зреене в продължение на 30 минути при 38,8 градуса и 5 процента CO2 в овлажнен въздух на тъмно. Ооцитите се промиват два пъти в PBS и веднага се прехвърлят в предварително загрята стъклена стъкла и се наблюдават под флуоресцентен микроскоп (Olympus BX51), като се използва син флуоресцентен филтър (BP 470-490 обектив UPlanFI 20×/0.50). След това потенциалът на митохондриалната мембрана се изчислява като съотношението на измерената червена/зелена флуоресценция с помощта на софтуера Image] (Национален институт по здравеопазване, Бетезда, MD, САЩ). 2.6.Оплождане ин витро и култура на ембриони
Оплождането in vitro беше извършено със замразена-размразена сперма на холщайн-фризийски бик, предварително подложен на капацитация с помощта на метода на градиента на Percoll (45 и 90), при концентрация от 2 x 10 градуса сперматозоиди mL-4.COCs и сперматозоидите се инкубират съвместно в продължение на 20 часа при 38,8 градуса и 5 процента CO2 във влажен въздух. След това предполагаемите зиготи бяха прехвърлени в капчици от синтетична среда на яйцепроводна течност (SOF), допълнена с BME и MEM аминокиселини, глутамин, глутатион и BSA [40]. След 48 часа от осеменяването, скоростта на разцепване (разцепени ембриони на общо осеменени ооцити) беше премината и разцепените ембриони бяха поддържани в SOF, допълнен с BSA и 10 процента фетален говежди серум (FBS). Ембрионите се култивират в продължение на 12 дни [41, 43], за да се оцени скоростта на развитие на бластоциста (на дни 7, 9 и 12; D7 ембриони на разцепени ембриони) и скоростта на излюпени ембриони (излюпени ембриони на D7 ембриони) и тяхното качество [43]. Ембрионите от ден 7 бяха класифицирани като степен 1 (добро качество), 2 (прилично качество) и степен 3 (лошо качество) [4].
2.7. Извличане и количествено определяне на ДНК и РНК
Общата ДНК и РНК бяха изолирани от GC с помощта на High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Basel, Switzerland) и PureLinkTM RNA Mini Kit (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA), съответно, съгласно инструкциите на производителя. Тези протоколи включват използването на въртящи се колони, използвани за изолиране на висококачествена обща ДНК и РНК и ДНКаза като лечение за отстраняване на геномна ДНК от РНК [40]. След екстракцията пробите се съхраняват при -80 градуса. Концентрацията и качеството на ДНК и РНК се определят с помощта на спектрофотометър NanoDropTM One/OneC (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA).
2.7.1. Допълнителен ДНК синтез
Синтезът на комплементарна ДНК (cDNA) от РНК изолати се извършва с помощта на комплекта Xpert cDNA Synthesis Mastermix (GRiSP, Порто, Португалия, съгласно инструкциите на производителя. РНК се транскрибира обратно, като се използват 500 ng екстрахирана РНК от всяка проба за извършване на cDNA синтез, което беше извършено с помощта на термоциклер (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, Калифорния, САЩ). Получените сДНК бяха съхранени при -20 градуса до използване за допълнителни анализи. 2.7.2. Дизайн на праймера
За това проучване са проектирани праймери за целевия (NFE2L2 и NQO1) и ендогенен контролен ген (6-актин) с помощта на софтуера Primer-BLAST на Националния център за биотехнологична информация (NCBI) (http://www .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, достъпен на 6 март 2020 г.). Последователностите на праймерите за референтните гени и целевите гени са изобразени в таблица 1. Освен това, генът mt-ND5 е използван в тази работа и подробности за mt-ND5 праймерите са извлечени от предишно проучване [45].
2.7.3. Количествена полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция
PCR анализите в реално време бяха извършени с помощта на Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X с ROX в термоциклер QuantStudio 3 (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA), използвайки cDNA в концентрация от 25 ng uL-l. Оценката на броя на копията на митохондриалната ДНК (mt-DNA) на гена ND5 беше извършена чрез qPCR чрез предварително извлечена ДНК, като се използва същото оборудване като за количественото определяне на гените. Всяка оптимизирана реакция беше извършена, състояща се от Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X с ROX, праймер (напред и назад) на всеки целеви ген, проба (cDNA/DNA) и вода без РНКаза, съставляваща общ обем от 10 μL. Пробите бяха анализирани в два екземпляра и реакции, съдържащи вода вместо шаблон, бяха включени като отрицателни контроли. Пробите бяха подложени на протокол за усилване, който се състоеше от първоначален цикъл при 95 градуса за 2 минути фаза на денатурация, последван от 40 цикъла на денатурация при 95 градуса за 55 s, 40 цикъла на отгряване за 30 s при 60 градуса (в зависимост от температурата на топене на праймерни последователности), и фаза на удължаване при 72 градуса за 30 s и, накрая, краен период на удължаване при 72 градуса за 10 минути.
За количественото определяне на генната експресия беше използван методът на относително количествено определяне. Този метод на относително количествено определяне на генната експресия беше извършен с нивата на експресия на изследваните целеви гени, които бяха нормализирани с домакинските гени, чрез CT сравнителен метод. Тъй като амплификацията чрез RT-qPCR се извършва в два екземпляра, средните CT стойности за всеки ген се определят и нивата на експресия се изчисляват, като се използва следната формула:
където △Ct=Ct целеви ген -Ct ендогенен контролен ген.
За количественото определяне на броя на копията на mt-DNA беше използвано относителното количествено определяне, нормализирано спрямо метода на единица маса. Този метод беше проведен с CT стойности на GCs, третирани с UA (наречени като тест), които бяха нормализирани с контролни проби (понастоящем обозначени като калибратор). Тъй като броят на копията на mt-ND5 беше оценен чрез qPCR и извършен в два екземпляра, бяха определени средните CT стойности за пробите от тестовете и калибраторите и съотношенията бяха изчислени по следната формула:
където △Ct=Ct калибратор-Ct тест и E е ефективността.
Тази статия е извлечена от Animals 2021, 11, 2048. https://doi.org/10.3390/ani11072048 https://www.mdpi.com/journal/animals
