Анти-стареене - Klotho Gene-Activated Scaffold насърчава подмладяващия отговор на заздравяването на рани в човешки адипозни стволови клетки

3. Дискусия

Това проучване имаше за цел да проучи функционалното въздействие на анти-стареенето -Klotho ген-активирано скеле върху човешки ADSC за подобрени приложения за заздравяване на рани. Като цяло открихме, че генно-активираното скеле предлага контролирано активиране на регенеративните способности на ADSC, както е показано на фигура5. По-конкретно, генно-активираното скеле временно подобрява стволовостта на ADSC чрез активирането на транскрипционния фактор Oct-4. Генно-активираното скеле също насърчава ранното активиране на антифиброзния ген TGF- 3, решаващ фактор за контролирано заздравяване с намалени белези. Освен това, активираните ADSC контролират временно ендотелната ангиогенеза и поддържат заздравяването на дермални фибробласти чрез паракринно сигнализиране. Към съзряването, ADSC също така контролират активирането на профиброзния отговор в дермалните фибробласти. Междувременно ADSC на генно-активираното скеле ефективно регенерират дермалната базална мембрана чрез повишаване на отлагането на ламинин и колаген IV. Този отговор беше допълнително свързан с намалена свързаност с белези -SMA протеинова експресия и подобрено качествено отлагане на еластинова матрица. Нашето проучване колективно установи, че -Klotho ген-активиранЦистанчепритежава огромен потенциал зазаздравяване на рании можешенапреднала терапия, базирана на стволови клетки за подмладяващи лечебни приложения.

Фигура 5. Схема на функционалното въздействие на B-Klotho ген-активирано скеле върху човешки ADSC за приложения за заздравяване на рани. Ключовите констатации от това проучване са (1) преходно усилване на плурипотентността на стволовите клетки и антифиброзния отговор, (2) подобрен паракринен контрол към ангиогенеза и профиброзно ремоделиране на колаген в дермалните фибробласти и в крайна сметка (3) повишено съзряване на базалната мембрана с контрол върху експресията на протеини, свързани с белег. Пунктираните линии за еластинова матрица предполагат подобрено качествено отлагане.

Щракнете тук, за да разберете как CistancheЕфекти за заздравяване на рани

В стратегиите за заздравяване на рани се прилага генна терапия, базирана на плазмид, за временно усилване на клетъчните реакции, докато възстановяването на раната приключи [37]. Нашето генно-активирано скеле също показва, че терапевтичното -Klotho генът се регулира временно за 14 дни. Значително подобреното (170-кратно) изражение на -Klotho иРНК на ден 3 може да се припише на незабавно-ранния CMV промотор, за който е известно, че подобрява транскрипционното активиране на кодирания трансген [38]. Въпреки това, в MSCs, CMV може да претърпи ДНК метилиране или хистоново деацетилиране, което може да намали трансгенната експресия [39]. Нещо повече, плазмидите обикновено са нерепликиращи се епизоми, ограничаващи трансфера на трансген към делящи се клетки и причинявайки спад в трансгенната експресия с течение на времето [40]. Наличието на хетерохроматични маркери, произхождащи от бактериалните последователности наплазмидът може допълнително да потисне трансгенната експресия [41], като цяло допринася за преходна генна експресия.

Един от пътищата, преследвани при лечението на трудно зарастващи рани, е прилагането на биоактивни скелета с клетъчни семена. Една от причините е способността им да насърчават бързо възстановяване на рани. Метаболитно активните клетки в присадката отделят паракринни фактори и претърпяват диференциация, организирайки сложните сигнални събития в средата на раната [42]. По-специално, стволовите клетки имат уникална способност да усещат външни стимули и да модулират отговора си, за да възстановят хомеостазата [43]. Въпреки това, стволовите клетки губят своята стволовост, когато се размножават in vitro, за да генерират голям брой клетки за присадката. Нашето проучване показва, че стволовостта може да бъде временно подобрена с помощта на генно активирано скеле, носещо ген против стареене -Клото. По-конкретно, отбелязахме, че скелето, активирано от ген против стареене, засилва експресията на гена на стволови клетки Oct-4 в ADSC. Oct-4 е един от ключовите транскрипционни фактори в ембрионалните стволови клетки и е от съществено значение за контролираното ембрионално развитие [44]. В ADSC, активирането на гена Oct-4 може да насърчи техния потенциал за пролиферация и диференциация [45]. По този начин повишената експресия на Oct-4 може да улесни бързата диференциация на ADSC върху генно-активираното скеле в клетките гостоприемници и да подпомогне процеса на оздравяване.

След като наблюдавахме активирането на гена Oct-4 в ADSCs, след това оценихме ангиогенната сила на ADSCs. Ангиогенезата е от решаващо значение за ефективната интеграция на присадката с тъканта на гостоприемника [46]. Клетките в присадката предизвикват ангиогенеза чрез секреция на паракринни фактори. Ангиогенезата също е решаващо събитие за развитието на гранулационната тъкан и нейната активност намалява с узряването на гранулационната тъкан [47]. Това програмирано ограничаване на ангиогенната активност в по-късните етапи на заздравяването е от съществено значение за контролиране на белези и хипер гранулация, които могат да възпрепятстват повторната епителизация [48]. Нашето откритие също така показва, че ADSC на генно-активираното скеле могат да подобрят ендотелното поникване и да контролират растежа им чрез паракринно сигнализиране. Освен това, значителните увеличения на метаболитната активност на ендотелните клетки и покълването в отговор на ден 3 CM демонстрират потенциала на натовареното с ADSCs генно активирано скеле да се интегрира бързо с тъканта на гостоприемника. Освен това използването на стволови клетки CM е често възприет безклетъчен подход за подобряване на качественото заздравяване на рани [49]. Като ограничение, ние признаваме, че възрастни дермални ендотелни клетки биха служили като по-добър клетъчен модел за изследване на ангиогенезата; въпреки това, за да поддържаме последователност с нашите предишни проучвания и HUVECs, които са широко приети като „златен стандарт“ за клетка [50], ние приехме анализа за ангиогенеза на HUVECs.

Увеличаването на активността на ремоделиране на фибробластите е обща характеристика на узряването на гранулационната тъкан [51]. По време на този етап матриците на колаген III постепенно се заменят от по-силни влакна на колаген I [51]. След това колагеновите влакна насърчават свиването на раната [52], а свиването на раната е необходимо за пълното затваряне на раната [53]. Въпреки това, агресивното продължително увеличаване на отлагането на колаген I може да увеличи образуването на белези [54]. Контролирането на белези е от решаващо значение, тъй като може да попречи на развитието на други кожни придатъци като космени фоликули, мастни и потни жлези, например при рани от изгаряне [54]. Нашето откритие показва, че възрастният (ден 14) CM от групата на генно-активираното скеле може да контролира експресията на профибротичен колаген I в възрастни дермални фибробласти. Този контролиран ефект върху фибробластите се проявява без по-нататъшно влияние върху миграцията на фибробластите или техните анти-фибротични експресии на колаген III по отношение на групата без генно скеле. Следователно, ние предполагаме, че натовареното с ADSCs ген-активирано скеле може да предложи по-добър контрол при ограничаване на белези in vivo чрез контролирана експресия на колаген I. Li et al. също показаха, че ADSCs CM може значително да намали експресията на колаген I във фибробластите, получени от хипертрофични белези [55]. Друго проучване на Wang et al. демонстрира подобно намаляване на експресията на колаген I във фибробласти, получени от келоид [56], като колективно демонстрират антифиброзния потенциал на CM на ADSCs.

Една от значимите констатации, които отбелязахме с прилагането на -Klotho ген-активирано скеле е подобрената регенерация на базалната мембрана в ADSCs. Регенерацията на базалната мембрана е от съществено значение за съзряването на кръвоносните съдове и пълната реепителизация [57,58]. Важно е тенденцията, в която протеините ламинин(2.1-кратно) и колаген IV (8.8-кратно) са регулирани нагоре, което допълнително показва повишено съзряване на базалната мембрана в групата на генно-активираното скеле [59]. Освен че действа като фактор против стареене [60], бета клото функционира за повишаване на чувствителността към фибробластния растежен фактор (FGF) от FGF рецепторите [61]. Освен това е установено, че увеличаването на FGF сигнализирането насърчава узряването на базалната мембрана чрез отлагането на ламинин и колаген IV [62]. Следователно, като се има предвид ролята на бета клото като ко-рецептор на FGF, повишеното съзряване на основата в групата на генно-активираното скеле е потенциално медиирано от увеличаване на FGF сигнализирането на ADSC.

Компонентът на базалната мембрана, забележително регулиран нагоре в групата на генно-активираното скеле, е протеинът колаген IV. Протеинът колаген IV представлява 50 процента от всички базални мембрани [63] и осигурява структурна стабилност на базалната мембрана [59]. Въпреки това, стареенето значително намалява експресията на колаген IV в дермално-епидермалната връзка [58,64] и липсата на колаген IV може да насърчи патогенезата на белези [65]. По този начин нашите резултати предполагат, че повишената регенеративна мощност на базалната мембрана на натовареното с ADSCs генно-активирано скеле може значително да подпомогне засиленото заздравяване при възрастни пациенти. Други проучвания също показват, че ECM, получен от мастната тъкан, притежава огромен терапевтичен потенциал за възстановяване на кожата [66]. Освен това тъканно инженерните присадки, богати на ламинин и колаген IV, също представляват интерес за възстановяване на респираторния епител [67]. 

В допълнение към профиброзния контрол към фибробластите, нашето проучване допълнително показва, че ADSCs в генно-активираното скеле също експресират 2-кратно по-ниска експресия на протеина, свързан с белег -SMA [68]. Въпреки че не оценихме въздействието му in vivo, намаляването на местното -Изразяването на SMA е от решаващо значение за подобрено качествено изцеление [69]. Използване на фиброзни средства като блеомицин [70] може да бъде един от начините за по-добро оценяване на антифиброзните свойства на ADSCs/генно-активирана конструкция на скеле in vitro; обаче, нашият фокус беше да установим временния терапевтичен потенциал на конструкцията.

Друг индикатор, че натовареното с ADSCs генно активирано скеле може да подобри качественото заздравяване е отлагането на фиброзна еластинова матрица вместо неравномерни екстрацелуларни секрети в групата на скеле без гени. Отлагането на еластин е една от основните дейности, които стимулират заздравяването на рани без белези на плода [71]. В кожата на възрастни обаче липсва отлагането на еластин [71]. Като такъв, тропоеластинът, прекурсор на еластин, често се включва в скелета от биоматериали за контролиране на белези при заздравяване на рани [72]. Взети заедно, нашите открития предполагат, че ADSCs/ -Klotho ген-активиран конструкт на скеле може да даде силен антифибротичен отговор in vivo.

4. Материали и методи

4.1. Подготовка на ген-активирано скеле

Генно-активираното скеле е разработено чрез 2-етапен процес. Първо, твърди порести колаген-хондроитин сулфатни скелета бяха произведени чрез суспензия чрез изсушаване чрез замразяване на колаген тип 1 на телешко сухожилие и хондроитин-6-сулфат, получен от хрущял на акула (Sigma, UK). Оптимизиран процес на сушене чрез замразяване, предназначен за създаване на еднакви пори, беше използван за производството на скелета [73]. Въз основа на нашия публикуван протокол [74], лиофилизираните скелета след това бяха дехидротермално (DHT) третирани при 105◦C под вакуум за стерилизация и механично подобрение. След това стерилизираните скелета бяха химически омрежени с 14 mM N-(3-диметиламинопропил)-N'-етилкарбодиимид хидрохлорид и 5,5 mM N-хидроксисукцинимид (2,5 моларни съотношения на EDC/NHS) (Sigma, UK) разтвор до допълнително подобряване на механичната стабилност [75]. След това омрежените скелета се промиват с PBS (Gibco, Paisley, UK) за отстраняване на остатъчните химикали. След като скелетата бяха готови, бяха приготвени полиплекси при съотношение N/P10 (съотношение азот към фосфат) чрез смесване на предварително определен обем разтвор на разклонен полиетиленимин (PEI) с плазмидна ДНК (pDNA), кодираща човешкия бета-Klotho ген ( -Klotho), получен от SinoBiological, Пекин, Китай. Съотношението N/P10 беше избрано въз основа на нашите предишни проучвания, които откриха, че полиплексите, формулирани в съотношение N/P 10, могат ефективно да образуват малки, стабилни катионни наночастици с плазмиди, големи като GLuc (5,76 kb) [21,23]. Преди употреба плазмидите се разреждат във вода без ендотоксини, за да се получи работна концентрацияот 0.5µg/µL. Плазмидът съдържа човешки усилен незабавен ранен цитомегаловирус(CMV3) промотор за насърчаване на стабилна и преходна експресия на високо ниво на кодиранотоген в клетките на бозайници.

Сместа от плазмид/PEI се оставя да се утаи за 30 минути, за да се самосглоби в полиплекснаночастици. След това наночастиците бяха заредени чрез накисване върху скелетата чрез пипетиранеравни обеми от полиплексния разтвор за всяка страна на скелето. Общо 2µg pDNA бешеизползвани за скеле за разработване на генно-активирано скеле.

4.2. Засяването на клетки е включено -Klotho генно активиран скеле

Човешките ADSCs (iXCells Biotechnologies, Сан Диего, Калифорния, САЩ) бяха разширени до пасаж 4 в ADSCs растежна среда (Кат. номер MD0003), доставена от компанията. Общо 5× 105 ADSC (2.5× 105 на страна) след това се посяват на безгенно скеле (контрола,n = 3) или генно активирано скеле (тест,n = 3). След като клетките се оставят да се утаят за около 20 минути, се добавят 2 mL среда за трансфекция OptiMEM (Gibco, UK) и клетъчните скелета се инкубират при 37°С.◦C за 24 часа. След 24-часовата инкубация, клетъчните свободни от гени или генно-активираните скелета бяха прехвърлени в нови 12-плаки с ямки и захранени с 2 mL среда за растеж на ADSCs. След това смяната на средата се извършва на всеки 3-4 дни до ден 14 чрез събиране на 1 mL от кондиционираната среда (CM) и замяната й с равен обем свежа среда. Всички CM бяха съхранени в−80 ◦C до анализ.

4.3. qRT-PCR анализи за определяне - Свръхекспресия на ген Klotho и активиране на функционални гени

За да се определи преходната регулация на целевите гени, клетките бяха събрани на ден 3 (рано) и 14 (късно) след засяване върху свободни от гени или генно-активирани скелета. Клетките първо бяха лизирани с помощта на реагент за лизис Qiazol (Qiagen, Germantown, MD, USA). След това се добавя хлороформ, за да се раздели клетъчният лизат на протеинови, ДНК и РНК фази. Използвайки RNeasy Kit (Qiagen, Манчестър, Обединеното кралство), РНК се екстрахира и тяхното качество и количество се определят с помощта на четец на плаки Multiskan Go (Thermo Scientific, Обединеното кралство) с абсорбция, настроена на 260 nm. След това геномната ДНК се отстранява чрез смесване на РНК с буфер за изтриване на геномна ДНК (Qiagen, Манчестър, Обединеното кралство) и нагряване до 42◦C за 2 минути. Впоследствие беше извършена обратна транскрипция за получаване на cDNA. Дубликати на cDNA на реплика (n = 3) бяха заредени в qRT-PCR плаките и след това анализът беше проведен, като се използваха праймерите, изброени в табл.1. Кратната промяна в експресията на иРНК по отношение на клетките на скелета без гени беше изчислена с помощта на 2−∆∆CTметод от средни стойности от три повторения на група. Човешки GAPDH (Hs_GAPDH_1_SG, кат. № QT00079247) беше използван като домакински ген.

4.4. Анализи на биоактивност на секретирани фактори от ADSC на -Klotho генно активиран скеле

4.4.1. Анализи на проангиогенна биоактивност

4.4.2. Анализи на заздравяването и съзряването на дермалните фибробласти

След анализа на ангиогенезата, ние изследвахме ефикасността на CM за дермално заздравяване чрез използване на тест с надраскване на дермални фибробласти на възрастен човек (iXcells, кат. № 10 HU-014). За това проучване ние специално избрахме остарелия CM от ден 14, за да проучим неговото влияние върху затварянето на фибробластната рана по време на узряването. Общо 1× 104 клетки/ямка в 96-плака с ямки се посяват и инкубират за една нощ в средата за растеж на фибробласти. На следващия ден беше създадена рана върху монослоя чрез хоризонтално надраскване с върха на 200 uL пипета през ямката. След това монослоят се изплаква с PBS, за да се отстранят всички остатъци и се захранва с CM. Затварянето на раната е записано между 12–16 часа след надраскването. Имунооцветяването се използва за изследване на експресията на профибротичен колаген I (1:100, Novusbio, UK) и анти-фибротичен колаген III (1:100, Novusbio, UK) във фибробластите. Фибробластите бяха насрещно оцветени с родамин (1: 800, Abcam, UK) за изобразяване на F-актин. Имунооцветяването се извършва, както е описано в Раздел4.5, с изключение на тъканна обработка и депарафинизация. Както HUVECs, така и фибробластите бяха използвани при пасаж 4.

4.5. Имунофлуоресцентно изобразяване на извънклетъчни матрични протеини

След 14 дни култивиране, клетъчните безгенни или генно-активирани скелета бяха събрани за откриване на отлагане на матрица с помощта на имунофлуоресценция. Обработката на пробите се извършва, както е описано по-горе. Накратко, скелетата първо се промиват с PBS и се фиксират в 10 процента неутрален буфериран формалин за 20 минути. Фиксираните проби след това се обработват с помощта на стандартния протокол за депарафинизация. След това блоковете бяха нарязани на 7-µm дебели резени и събрани върху заредени слайдове. След това срезовете се депарафинизират с помощта на ксилен, последвано от рехидратиране на среза с намаляващи градиенти на етанол. Впоследствие клетките бяха пермеабилизирани с 0.2 процента Tween®20 (Sigma-Aldrich, Франция) разтвор в PBS за 30 минути (10 минути промиване× 3) и блокиран с помощта на 10 процента NGS (нормален кози серум, Invitrogen, Рокфорд, Илинойс, САЩ)/5 процента BSA/0,3 М глицин (приготвен в пермеабилизиращ разтвор) за 1 час. След блокиране слайдовете се изплакват в PBS и след това се инкубират при 4°С◦C за една нощ с антителата за насочване към матрични протеини, изброени в табл2. На следващия ден предметните стъкла се изплакват в PBS три пъти за 2-3 минути всеки, за да се отстранят всички несвързани първични антитела. Впоследствие предметните стъкла се инкубират или в Alexa 488-конюгиран кози анти-миши IgG (A32723, Invitrogen, UK) или Alexa 594-конюгиран кози анти-заешки IgG (A11012, Invitrogen, UK) при 1: 800 разреждане при стайна температура за 1 час на тъмно. Етапът на изплакване се извършва както преди и се оцветява обратно за ядра, като се използва монтиращата среда с DAPI (ab104139, Abcam, UK). След това слайдовете се изобразяват с помощта на флуоресцентен микроскоп (Olympus BX43, Япония) при 20× обективен. Проби, инкубирани само с вторични антитела, бяха използвани като контроли.

Количествено определяне на изображението

Image] софтуер (Image, NIH, MD, USA) беше използван за полуколичествено определяне на количеството на експресираните протеини. За всеки маркер първо беше определена постоянна прагова стойност чрез предварително изобразяване на различни секции. С помощта на зададената прагова стойност се определя интегрираната плътност (оцветена площ х средна стойност на сивото) на изображенията и след това се нормализира към броя на клетките (DAPI преброяване), за да се получи крайна средна плътност на флуоресценция на клетка. Средната стойност беше количествено определена от 8-10 произволни изображения на реплика с минимум три реплики на група. Средните стойности, получени от трите повторения/група, след това бяха използвани за измерване на относителната експресия между групите.

4.6. Статистически анализ

Всички резултати са изразени като средна стойност плюс стандартно отклонение. Несдвоен, двустранен t-тест обикновено се използва за изчисляване на статистическата значимост между групите, където p < 0.05 се счита за значимо

Това проучване показа, чепротив стареене -Klotho ген-активирана цистанкаконтролирани оферти активиране на регенеративния капацитет на ADSC. Основните констатации от това проучване са (1)преходно усилване на плурипотентността на стволовите клетки и антифиброзния отговор, (2)подобрен паракринен контрол към ангиогенеза, и профиброзно ремоделиране на колагенв дермалните фибробласти и в крайна сметка, (3)повишено съзряване на базалната мембранас контрол върху експресията на протеини, свързани с белег. В заключение тези резултати предполагатче натоварените с ADSC -Klotho ген-активирано скеле може да притежава голям потенциал aлечение на широк спектър от кожни рани.

ресурси, ALL, FJO и MBK; обработка на данни, ALL и MBK; писане—оригинална чернова препарция, ВСИЧКИ; писане—преглед и редактиране, ALL, FJO и MBK; визуализация, ВСИЧКИ; надзор,FJO и MBK; администриране на проекти, MBK; придобиване на финансиране, FJO и MBK Всички авториса прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Конфликти на интереси:Авторите декларират, че не съществува конфликт на интереси.

Препратки

1. Laiva, AL; О'Брайън, FJ; Keogh, MB Иновации в системите за доставка на гени и растежни фактори за заздравяване на рани при диабет.J. Tissue Eng. Regen. Med.2018, 12, e296–e312. [КросРеф] [ПубМед] 

2. Макрантонаки, Е.; Wlaschek, М.; Scharffetter-Kochanek, K. Патогенеза на нарушенията на зарастването на рани при възрастни хора.JDDG J. Dtsch. Dermatol. Ges.2017, 15, 255–275. [КросРеф] [ПубМед]

3. Гангули, П.; El-Jawhari, JJ; Бурска, А.Н.; Ponchel, F.; Giannoudis, PV; Jones, EA Анализът на in vivo стареенето в мезенхимни стромални клетки на човешки костен мозък, използвайки анализ на фибробластни единици, образуващи колонии, и CD45lowCD271 плюс фенотип.Стволови клетки Int.2019, 2019, 5197983. [КросРеф] 

4. Westerweel, PE; Тераа, М.; Рафифи, С.; Jaspers, JE; Уайт, IA; Хупър, AT; Verhaar, MC Нарушена мобилизация на ендотелни прогениторни клетки и дисфункционална строма на костен мозък при захарен диабет.ПЛОС ЕДИН2013, 8, e60357. [КросРеф] 

5. Мъри, RZ; Запад, ZE; Cowin, AJ; Farrugia, BL Разработване и използване на биоматериали като терапии за заздравяване на рани.Горя. Травма2019, 

6. [CrossRef] [ПубМед] 6. Ебрахимян, Т.Г.; Pouzoulet, F.; Squiban, C.; Буард, В.; Андрé, М.; Братовчед, Б.; Tamarat, R. Клетъчна терапия, базирана на стромални клетки, получени от мастна тъкан, насърчава физиологичното и патологичното зарастване на рани.Артериосклер. Thromb. Vasc. Biol.2009, 29, 503–510. [CrossRef] 

7. Ву, Й.; Чен, Л.; Скот, PG; Tredget, EE Мезенхимни стволови клетки подобряват заздравяването на рани чрез диференциация и ангиогенеза.Стволови клетки2007, 25, 2648–2659. [КросРеф] [ПубМед] 

8. Фубер, П.; Гонзалес, АД; Теодосеску, С.; Берард, Ф.; Doyle-Eisele, M.; Йекала, К.; Fraser, JK Възстановяваща клетъчна терапия, получена от мастна тъкан за заздравяване на рани от изгаряне: Сравнение на два метода за доставяне.адв. Грижа за раната2016, 5, 288–298. [КросРеф] [ПубМед]

9. Аси, Р.; Фостър, TR; Той Х.; Стамати, К.; Bai, H.; Huang, Y.; Dardik, A. Доставянето на мезенхимни стволови клетки в биомиметично проектирани скелета насърчава заздравяването на диабетни язви.Regen. Med.2016, 11, 245–260. [КросРеф] [ПубМед] 

10. Jiang, Y.; Чен, Б.; Liu, Y.; Zhufu, Z.; Ян, X.; Hou, X.; Tan, Q. Ефект на колагеново скеле с клетки от стромална васкуларна фракция, получени от мастна тъкан, върху заздравяването на рани при диабет: Проучване в модел на диабетно прасе.Тъкан инж. Regen. Med.2013, 10, 192–199. [КросРеф] 

11. Фаланга, В.; Саболински, М. Двуслойна жива кожна конструкция (APLIGRAF®) ускорява пълното затваряне на трудно зарастващи венозни язви.Реген за възстановяване на рани.1999, 7, 201–207. [КросРеф] 12. Харт, CE; Loewen-Rodriguez, A.; Lessem, J. Dermagraft: Използване при лечение на хронични рани.адв. Грижа за раната.2012, 1, 138–141. [КросРеф] [ПубМед] 13. Дин, Т.Л.; Veves, A. Ефикасността на Apligraf при лечението на диабетни язви на краката.Пласт. Реконстр. Surg.2006, 117, 152S–157S. [КросРеф] [ПубМед]

14. Eaglstein, WH; Falanga, V. Тъканно инженерство и развитието на Apligraf®, еквивалент на човешка кожа.Clin. Там.1997, 19, 894–905. [КросРеф] 

15. Дзян, Т.; Xu, G.; Wang, Q.; Янг, Л.; Zheng, L.; Zhao, J.; Zhang, X. In vitro, експанзията наруши стволовостта на мезенхимните стволови клетки при ранно преминаване за лечение на хрущялни дефекти.Клетъчна смърт Dis2017, 8, e2851. [КросРеф] [ПубМед]

16. Лиу, Дж.; Динг, Й.; Лиу, З.; Liang, X. Стареене в мезенхимни стволови клетки: функционални промени, молекулярни механизми и стратегии за подмладяване.Отпред. Cell Dev. Biol.2020, 8, 258. [КросРеф] [ПубМед] 

17. Wang, W.; Xu, X.; Li, Z.; Lendlein, A.; Ma, N. Генетично инженерство на мезенхимни стволови клетки чрез доставяне на невирусен ген.Clin. Хемореол. Microcirc.2014, 58, 19–48. [КросРеф] 

18. Девеза, Л.; Choi, J.; Лий, Дж.; Хуанг, Н.; Кук, Дж.; Yang, F. Индуцирана от полимер-ДНК наночастици свръхекспресия на CXCR4 подобрява присаждането на стволови клетки и регенерацията на тъканите в модел на исхемия на заден крайник на мишка.Теранотика2016, 6, 1176–1189. [КросРеф] [ПубМед] 

19. O'Brien, FJ Биоматериали и скелета за тъканно инженерство.Матер. Днес2011, 14, 88–95. 20. Янас, И.; Церанис, Д.; Харли, Б.; И така, P. Биологично активни скелета на базата на колаген: Напредък в обработката и характеризирането.Филос. прев. R. Soc. Математика. Phys. инж. Sci.2010, 368, 2123–2139. [КросРеф] 

21. Laiva, AL; Рафтери, RM; Keogh, MB; O'Brien, FJ Проангиогенно въздействие на SDF-1 генно активирани скелета на основата на колаген в ангиогенезата, управлявана от стволови клетки.Вътр. J. Pharm.2018, 544, 372–379. [КросРеф] [ПубМед] 

22. Лакингтън, Вашингтон; Рафтери, RM; O'Brien, FJ In vitro ефикасност на ген-активиран канал за насочване на нервите, включващ невирусни PEI-pDNA наночастици, носещи гени, кодиращи NGF, GDNF и c-Jun.Акта Биоматер.2018, 75, 115–128. [CrossRef] 

23. Tierney, EG; Duffy, GP; Hibbitts, AJ; Cryan, SA; O'Brien, FJ Разработването на невирусни генно активирани матрици за костна регенерация с помощта на полиетиленимин (PEI) и скелета на базата на колаген.J. Контрол. Освобождаване2012, 158, 304–311. [КросРеф] [ПубМед] 24. Laiva, AL; О'Брайън, FJ; Keogh, MB SDF-1 генно-активирано колагеново скеле задвижва функционалната диференциация на човешки Schwann клетки за приложения за заздравяване на рани.Биотехнология. Bioeng.2021, 118, 725–736. [КросРеф] [ПубМед]