ЧАСТ 1 Подобни на антидепресанти ефекти на екстракт от Cistanche Tubulosa върху плъхове с хроничен непредсказуем стрес чрез възстановяване на хомеостазата на чревната микробиота

Нарастващите доказателства показват, че невропсихиатричните разстройства, като депресия, са свързани с чревния микробиом чрез оста черво-мозък.Cistanches Herbaе добре известно за лечение на дефицит на "бъбрек-ян" в традиционната китайска медицина (TCM) и се използва за лечение на невродегенеративни заболявания през последните години. В това проучване беше създаден моделът на депресия, предизвикана от хроничен непредсказуем стрес (CUS), за да се изследва въздействието наCistanche tubulosaекстракт (CTE) върху поведенчески тестове, моноаминови невротрансмитери и невротрофични фактори в хипокампуса и дебелото черво, състав на чревната микробиота и производство на късоверижни мастни киселини (SCFA). Освен това, корелационният анализ беше използван за оценка на функционалната връзка между променената чревна микробиота, променените невротрансмитери и невротрофини в хипокампуса и дебелото черво и нарушената концентрация на SCFAs. CTE значително подобрява подобно на депресия поведение при плъхове под CUS. Мозъчното ниво на 5-хидрокситриптамин (5-HT) и експресията на невротрофичен фактор, получен от мозъка (BDNF) при CUS плъхове беше възстановено от CTE. Относителното изобилие на чревната микробиота и концентрациите на ацетат и хексанова киселина също могат да бъдат модулирани чрез лечение с CTE. Освен това показахме, че прилагането на CTE при плъхове CUS доведе до силна корелация между нарушената композиция на чревната микробиота, нивата на невротрансмитери в хипокампуса и производството на невроактивни метаболити SCFA. Като цяло, тези резултати идентифицират CTE като потенциално лечение на депресивни симптоми чрез възстановяване на хомеостазата на чревната микробиота за нарушения на оста микробиота-черва-мозък, отваряйки нови пътища в областта на невропсихофармакологията.

Ключови думи: Cistanche tubulosa, антидепресант, хроничен непредвидим стрес, чревна микробиота, оста микробиота-черва-мозък

За повече информация моля свържете се с:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola има много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

ВЪВЕДЕНИЕ

Cistanches Herba(Rou Cong-Rong на китайски) е официално записано като изсушени сочни стъбла наCistanche deserticola(YC Ma) иCistanche tubulosa(Schrenk) в Комисията по китайската фармакопея (2015 г.). Това е добре известна традиционна китайска медицина (TCM) за лечение на бъбречна недостатъчност, импотентност, женско безплодие, болестна левкорея, профузна метрорагия,

Ехинакозидв cistanche може да насърчавазаздравяване на рани

и сенилен запек (Комисия по китайската фармакопея, 2015 г.). Предишни проучвания разкриха няколко основни химични съставки наCistanches Herba, включително фенилетаноидни гликозиди (PhGs), иридоиди и иридоидни гликозиди, лигнани, алдитоли, олигозахариди и полизахариди. Фармакологичният анализ показва, че Cistanches Herba проявява широк спектър от невропротективни, имуномодулиращи, противовъзпалителни и хепатопротективни действия (Jiang and Tu, 2009; Fu et al., 2017). PhG се считат за основните активни компоненти на Cistanches Herba, притежаващи различни фармакологични действия, като невропротективни, имуномодулиращи, противовъзпалителни, хепатопротективни, антиоксидантни и т.н. (Jiang and Tu, 2009; Fu et al., 2017). Cistanches Herba първоначално е записан в Classic of Herbal Medicine („Shennong Bencao Jing“ на китайски), добре известна книга за лечебни растения, написана между около 200 и 250 г. сл. н.е., като „силна билка“, която може да регулира „пет (вътрешности ) напрежение и седем (преяждане, гняв, влага, студ, безпокойство, вятър и дъжд и страх) увреждания" (Huang, 1982). Днес Cistanches Herba е широко приета като билков тоник за обща слабост (Fu et al., 2017).C. tubulosaгликозидни капсули (Memoregain®) се използват за лечение на болестта на Алцхаймер (Guo et al., 2013). Дисфункционалната допаминергична система е една от ключовите патогенези на моноаминовата хипотеза за депресия (Duman et al., 1997; Krishnan and Nestler, 2008). Установено е, че ехинакозид (един от PhG) и PhG от Cistanche salsa предпазват допаминергичните неврони срещу невротоксичност на допамин (DA), индуцирана от 1-метил-4-фенил-1,2,3,{ {8}}тетрахидропиридин (MPTP), който може да повиши нивата на DA в стриатума на C57 мишки (Tian и Pu, 2005; Geng et al., 2007). В допълнение, каталпол и генипозид са два представителни иридоида в Cistanches Herba и е установено, че подобряват подобно на депресия поведение, причинено от хроничен непредсказуем стрес (CUS), чрез възстановяване на дисфункциите на хипоталамо-хипофизно-надбъбречната (HPA) ос, а каталполът може да регулира нагоре мозъчната експресия на получен невротрофичен фактор (BDNF) (Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). Нещо повече, последната публикация дава ново доказателство, че отварата от Cistanches Herba значително намалява периода на неподвижност при теста за окачване на опашката на мишката, което силно предполага, че Cistanches Herba притежава потенциални антидепресантни качества (WangD. et al., 2017).

Традиционната китайска медицина привлича все по-голямо внимание като лечение на депресия поради своите сравнително умерени странични ефекти (Sarris et al., 2011; Feng et al., 2016). Различни видове ТКМ, като отделни съединения от суровите лекарства (гинзенозид Rb1, гинзенозид Rg3 и Yuanzhi-1) (Jin et al., 2015; Kang et al., 2017; Wang GL et al., 2017 ), единични китайски лекарствени материали (корен от Panax ginseng, коренище от Acorus tatarinowii и Morinda Officinalis) (Dang et al., 2009; Han et al., 2013; Xu et al., 2016) и TCM отвари (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan и Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010; Su et al., 2011; Su et al., 2014; Yan et al., 2016) са задълбочено проучени и показани за обръщане или смекчаване на подобни на депресия симптоми. Например, беше установено, че Kai-Xin-San значително облекчава симптомите на CUS-индуцирани депресивни плъхове чрез увеличаване на броя на невротрансмитерите, невротрофичните фактори и съответните им рецептори и насърчаване на експресията на синаптотагмин и гъстотата на дендритния шип (Yan et al. , 2016).

Въпреки това, предишни проучвания на TCM разчитат на резултати от поведенчески тестове, подобни на депресанти, и се фокусират върху конвенционалния фармакологичен механизъм на действие. Връзката между антидепресивната ефикасност на перорално прилагания TCM и чревната микробиота не е добре разбрана. Все повече доказателства подкрепят, че чревната микробиота играе решаваща роля в регулирането на мозъчните функции, особено депресията и други свързани със стреса разстройства (Foster and Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). Например, хроничният стрес води до дисрегулация на чревната микробна структура на плъхове, с намаляване на съотношението Firmicutes/Bacteroidetes, и по-конкретно, намаляване на относителното изобилие на Lactobacillus и увеличаване на Oscillibacter (Meng et al., 2017). Освен това, фекална трансплантация на нерегулирана микробиота от пациенти с депресия на свободни от микроби мишки придава подобен на депресия фенотип при тези животни, което показва, че нерегулираната чревна микробиота причинява поведенчески и физиологични симптоми на депресия и тревожност (Kelly et al., 2016; Zheng et al. ., 2016). При експерименти с животни е установено, че някои модулатори на микробиотата като пробиотици и пребиотици подобряват подобно на депресия поведение при хронично стресирани мишки чрез подобряване на чревната микробиота (Bravo et al., 2011; Bharwani et al., 2017; Burokas et al., 2017). ).

Като се има предвид връзката между чревната микробиота и развитието на заболяването, както и пластичността на структурата на чревната микробиота, ние решихме да проучим ефектите на чревната микробиота за медииране на депресия, което привлече вниманието ни и беше изследвано (Chang et al., 2017; Xu et al. ., 2017). За да се постигне това, беше извършен комбиниран метастатистически анализ на 16S rRNA генно секвениране (White et al., 2009), за да се анализира съставът на чревната микробиота. В настоящото изследване,C. tubulosaбеше избран за оценка на неговите подобни на антидепресант ефекти, тъй като има по-високо ниво на PhGs в сравнение сC. deserticola. Създаден е модел на депресия, предизвикана от CUS при плъхове, за да се изследва въздействието наЕкстракт от C. tubulosa(CTE, състоящ се от 48,6 процента PhGs, 6,9 процента иридоидни гликозиди и 20.0 процента общо захариди) върху поведенчески тестове, моноаминови невротрансмитери и невротрофични фактори в хипокампуса и дебелото черво, състав на чревната микробиота и късоверижни производство на мастни киселини (SCFA). Освен това, функционалната връзка между променената чревна микробиота променя невротрансмитерите и невротрофините както в хипокампуса, така и в дебелото черво и е изследвана нарушената концентрация на SCFA. Корелационният анализ беше използван за обосноваване на доказателства, че CTE е насочен към чревната микробиота за лечение на депресия чрез модулиране на оста микробиота-черва-мозък.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Материали

Флуоксетин (FLX) е закупен от Aladdin Industrial Inc. (Шанхай, Китай). Комплектите 5-хидрокситриптамин (5-HT), норепинефрин (NE) и BDNF ELISA бяха закупени от Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Китай). HPLC-клас ацетонитрил е закупен от Merck (Дармщат, Германия). Дейонизираната вода се приготвя от дестилирана вода с помощта на система за пречистване на вода Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, Съединени щати). Всички други използвани реактиви и химикали са с аналитичен клас.

Изсушени стръкове отC. tubulosaбяха събрани от окръг Хетиан (Синдзян, Китай). Образците от ваучери бяха заверени от проф. Xiaobo Li и депозирани в хербариума на Факултета по фармация, Шанхайския университет Jiao Tong (Шанхай, Китай). Хомогенната прахообразнаC. tubulosaстъблата се суспендират в десетократно 70 процента етанол и се загряват на обратен хладник три пъти, всеки за 1 час при 100 градуса. Екстрактите се филтруват с марля, изпаряват се под вакуум при 65 градуса и се лиофилизират. Пробата се разтваря отново и след това се отделя с макропореста смола D101. След адсорбция, фракцията, елуирана с вода, се изхвърля. CTE се получава след елуиране с 40 процента етанол, след което се изпарява под вакуум при 65 градуса и се лиофилизира.

Анализ на химичния състав на CTE

Относителното съдържание на PhGs в CTE се определя чрез UV спектрофотометрия при 330 nm, като се използва ехинакозид като стандарт. Относителното съдържание на иридоиди и иридоидни гликозиди се измерва чрез UV спектрофотометрия с метод с двойна дължина на вълната, за да се избегне спектралната интерференция от PhGs (237 nm се използва за спектроскопско количествено определяне, изобестична точка 280 nm се използва за референтна дължина на вълната), използва се генипозид като стандарт. Общото съдържание на въглехидрати в CTE се определя чрез колориметричен метод на фенол-сярна киселина с глюкоза като стандарт (Chow and Landhausser, 2004).

Основните химични съставки на CTE се характеризират с UPLC-Q-TOF-MS. UPLC-Q-TOF-MS анализът беше извършен на система Waters ACQUITY UPLC (Waters Corp., Milford, MA, Съединени щати) с колона ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm x 2.1 mm id, 1,7 段m, Waters Corp., Съединени щати) чрез градиентно елуиране с използване на 0.1 процента ацетонитрил на мравчена киселина (A) и 0.1 процента мравчена киселина във вода (B) при скорост на потока 0,4 ml/min. Профилът на градиента беше: 0-5 минути (A: 5-20 процента), 5-7.5 минути (A: 20-30 процента), 7.5-10 минути ( A: 30-70 процента), 10-11 минути (A: 70-100 процента) и задържани за 1,5 минути. Градиентът се рециклира обратно до 5 процента за 0,5 минути и се задържа за 2,5 минути за следващия цикъл. Инжекционният обем беше 3 [il. Температурата на колонната пещ беше настроена на 35 градуса.

Масспектрометрията се провежда с помощта на Waters Vion IMS масспектрометър (Waters Corp., Milford, MA, Съединени щати). Йонизацията се извършва в режим на отрицателен електроспрей (ESI). MS параметрите бяха както следва: капилярно напрежение, 2.0 kV; напрежение на конуса, 20 V; температура на източника, 120 градуса; температура на десолватация, 500 градуса; газови потоци на конус и десолватация, съответно 50 и 1,000 L/h. За точно измерване на масата левцин-енкефалин беше използван като заключваща маса за генериране на [МН]- йон (m/z 554.2615). Експеримент MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) в две функции на сканиране беше проведен, както следва: функция 1 (ниска енергия): m/z 50-1,000, 0,25 s време за сканиране, 0,02 s забавяне между сканирането , 6 eV енергия на сблъсък; функция 2 (висока енергия): m/z 50-1,000, 0,25 s време за сканиране, 0,02 s забавяне между сканирането, рампа на енергията на сблъсък от 20-45 eV. Данните бяха обработени с помощта на софтуер UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, Съединени щати).

цистанчемогаподобряване на бъбречната функция

Експерименти с животни

Мъжки плъхове Sprague-Dawley (200 土 20 g) бяха доставени от Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Пекин, Китай) и настанени в Центъра за лабораторни животни на Шанхайския университет Jiao Tong (Шанхай, Китай). Животните бяха настанени в групи при контролирана стайна температура (25 ± 2 градуса, 55 ± 10 процента относителна влажност) с 12:12 часа цикъл светло-тъмно. На плъховете беше разрешен свободен достъп до обичайната храна за лабораторни плъхове и вода в продължение на 1 седмица. Съоръженията и протоколите за животни бяха одобрени от Комитета по етика на животните на Шанхайския университет Jiao Tong (Шанхай, Китай).

След 1 седмица на аклиматизация, 40 наивни плъха бяха подложени на период от 72 часа обучение със захароза и тестване на базовата линия на захароза. Плъховете бяха разделени на пет групи (n=8) въз основа на техните предпочитания за захароза в базовия тест за захароза (допълнителна фигура S1). На контролната група и CUS групата беше даден физиологичен разтвор (10 ml/kg). За останалите три групи CTE при висока доза (CTEH) (400 mg/kg), ниска доза (CTEL) (200 mg/kg) и FLX (10 mg/kg) са приложени интрагастрално 1 час преди CUS процедурата (8:00 сутринта до 9:00 сутринта) в продължение на 4 седмици.

Хроничният непредсказуем стрес е разработен, както е описано по-рано (Willner, 1997; Xue et al., 2013), с изключение на контролната група без стрес, върху плъховете са приложени серия от стресови фактори: стробоскопично осветление с нисък интензитет през нощта (120 светкавици/ min), бял шум (100 dB) за 1 час, лишаване от вода за 24 часа, празни бутилки за вода за 1 час (след лишаване от вода), лишаване от храна за 24 часа, принудително плуване (5 минути), физическо ограничаване ({{11 }} h), замърсена клетка за 24 часа (200 ml вода в 100 g постелка от дървени стърготини), прищипване на опашката (1 минута), наклон на клетката от 45 градуса за 24 часа, шок за 30 минути и осветяване през нощта (12 часа). Стресорите се прилагат непрекъснато и на случаен принцип в продължение на 4 седмици, подробности за които са описани в допълнителна таблица S1. Храната и водата бяха свободно достъпни за контролните нестресирани плъхове, които останаха необезпокоявани в друга стая, с изключение на 14-часовия период на лишаване преди всеки тест за захароза. Един плъх умря по време на CUS процедурата. След това беше извършен тест за принудително плуване (FST).

4 дни остър прием и след 28 дни на стрес бяха проведени тест за предпочитане на захароза (SPT) (ден 29), тест на открито (OFT) (ден 31) и тест за потискане на новост (NSFT) (ден 33). Схемата на дизайн за CUS и поведенчески тестове е показана на допълнителна фигура S2.

Извършен е тест за принудително плуване, както е описано по-горе (Porsolt et al., 1978). Процедурата се състоеше от предварителни и тестови сесии, като се използваше същия апарат и условия (диаметър 20 cm, височина 45 cm, съдържащ 25 cm вода, поддържана при 26 градуса). По време на предварителната сесия, плъховете бяха принудени да плуват в продължение на 15 минути; 24 часа по-късно, плъховете бяха поставени в същия апарат за 5 минути плувна тестова сесия. Плувното поведение вътре

5 минути са наблюдавани с видеокамера и е измерена и анализирана продължителността на неподвижността.

За SPT, плъховете първо бяха обучени да консумират 1 процент (v/v) разтвор на захароза за 72 часа преди SPT. Базовият тест за захароза преди CUS процедурата и SPT в края на CUS бяха извършени, както е описано по-горе (Xue et al., 2013).

Тестът в открито поле беше извършен в края на CUS процедурата, апаратът и методът бяха същите като описаните по-рано (Xue et al., 2013). Използвана е система за видео проследяване (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.) за записване на общото изминато разстояние.

Тестът за потиснато новост при хранене беше оценен, както е описано по-горе (Xue et al., 2013) и латентността за започване на хранене в рамките на 5 минути беше записана и анализирана.

Измерване на невротрансмитери и невротрофични фактори

След поведенчески тестове бяха получени най-малко четири фекални пелети от всеки плъх, поставени в стерилни конични епруветки и незабавно замразени при -80°C за анализ на микробна общност и SCFAs. След това плъхове бяха пожертвани; хипокампусът и дебелото черво бяха изолирани и претеглени веднага. Тъканните проби се промиват с физиологичен разтвор, бързо се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80°С за съхранение. След последователно размразяване при -20°C и 4°C, тъканните проби се хомогенизират във физиологичен разтвор и се центрофугират за 25 минути при 2500 rpm/4°C. Полученият супернатант се събира и съхранява при 4°С до употреба. Нивата на 5-HT в хипокампуса и дебелото черво, NE в хипокампуса и BDNF в хипокампуса бяха определени от търговски комплекти ELISA съгласно протоколите на производителя (Hou et al., 2017).

Анализ на съставния профил на чревната микробиота

Общата ДНК на чревната микробиота от фекални проби беше извлечена, както е описано по-горе (Wei et al., 20{{20}}4). Всяка фекална проба (0.2 g) се смесва в 1 ml PBS и се хомогенизира два пъти, след което се центрофугира при 200 g за 6 минути. Супернатантата се добавя с 20 ± 20 процента PVP и се центрофугира при 300 g за 6 минути. След това полученият супернатант се центрофугира при 12,000 g за 6 минути и клетъчните пелети се събират. Клетъчните пелети се промиват с PBS и след това се ресуспендират в 300 лизата I (150 mM NaCl, 100 mM EDTA・Na2・2H2., рН 8.0). Суспензията се смесва със 100 µl разтвор на лизозим (100 mg/ml) и 20 µ 1% РНКаза, 37°С се затопля в продължение на 30 минути, след което се добавят 300 µl лизат II (100 mM NaCl, 500 mM Tris база, pH 8.0) . Клетъчната суспензия беше внимателно смесена с 50 ± 20 процента SDS, измита в ледена баня за 5 минути. След това ДНК се пречиства чрез последователна екстракция с 1 процент PVP, Tris-уравновесен фенол и хлороформ-изоамилов алкохол (обем/обем/обем/обем, 3,125:25:24:1) и хлороформ-изоамилов алкохол (обем/обем, 24 :1), последвано от утаяване при -20°С в продължение на 2 часа с два обема етанол и 50 [il 3 М NaAc. ДНК се събира чрез центрофугиране, изсушава се на въздух и се разтваря в 100 ul стерилна дейонизирана вода. Чистотата на нуклеиновата киселина беше тествана с помощта на спектрофотометър NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Съединени щати). След това общата геномна ДНК беше подложена на PCR амплификация, използвайки праймери, специфични за V3-V4 регионите на 16S rRNA гена: преден праймер 338F (5'-ACTCTACGGGAGGCAGCA-3') и обратен праймер 806R (5 '-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'). PCR ампликоните се пречистват с гранули Agencourt AMPure (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, Съединени щати) и се определят количествено с помощта на PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, Съединени щати). След индивидуалната стъпка на количествено определяне, ампликоните бяха обединени в равни количества и секвенирането в края на двойката 2 x 300 bp беше извършено с помощта на платформата Illumina MiSeq с MiSeq Reagent Kit v3 в Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Шанхай, Китай). Сдвоени крайни четения бяха събрани с помощта на софтуер FLASH (версия 1.2.7), необработените четения на последователности бяха качествено подрязани с помощта на софтуера QIIME (версия 1.8.0), за да се премахнат несъответстващи баркодове и последователности под праговете на дължина. След това филтрираните последователности бяха групирани в оперативни таксономични единици (OTU) с праг от 97 процента сходство на последователности, използвайки QIIME с UCLUST. Бета разнообразието беше извършено на QIIME за претеглен анализ на главните координати UniFrac (PCoA). И накрая, софтуерът Meta stats беше използван за сравняване на разликите в таксономичния състав на чревните микроби между различните групи.

Анализ на концентрацията на SCFA

Концентрацията на SCFA (включително ацетат, пропионат, бутират, изобутират, валерианова киселина, изовалерианова киселина и хексанова киселина) във фекални проби от плъхове се определя с GC{{0}} газов хроматограф (Shimadzu, Япония), монтиран с колона DB-FFAP (30 m x 0.25 mm x {{10}}.25 cm, Agilent, Съединени щати). Стандартни разтвори на ацетат, пропионат, бутират, изобутират, валерианова киселина, изовалерианова киселина и хексанова киселина се приготвят при 1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0.01 и 0,005 mg/ml с етер (включително 2- метил валерианова киселина 0,1 mg/ml като вътрешен стандарт), съответно. Всяка фекална проба (0,2 g) се смесва в 0,8 ml дейонизирана вода чрез завихряне и центрофугиране при 5,000 rpm за 20 минути при 4°C, 450 il от супернатанта се добавят към 50 il 50 процента H2SO4 и 500 il вътрешен стандарт разтвор, разбъркване на вортекс за 1 минута и центрофугиране при 12,000 rpm за 10 минути, след което сместа се поставя при 4°С за 30 минути. Супернатантата се взема за GC анализ. Анализът на SCFAs беше извършен, както е описано по-горе (Wang et al., 2016).

Статистически анализ

Всички данни бяха представени като средства 土 SEM. Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуера SPSS 21.0 (SPSS Inc., Чикаго, Илинойс, Съединени щати) с еднопосочна ANOVA, последвана от теста на Дънет или t-теста на Студент. Данните бяха изключени от анализите, ако са по-големи от две стандартни отклонения от средната стойност. Стойностите на p < 0.05="" се="" считат="" за="" статистически="" значими.="" корелационният="" анализ="" на="" pearson="" беше="" използван="" за="" оценка="" на="" връзката="" между="" относителното="" изобилие="" на="" чревната="" микробиота,="" scfas,="" нивата="" 5-ht,="" ne="" и="" bdnf="" на="" хипокампуса="" и="" 5-ht="" на="" дебелото="">

РЕЗУЛТАТИ

Анализ на химичния състав на CTE

Химичният състав на CTE за първи път беше анализиран изчерпателно. Както е показано в таблица 1, PhGs са основният компонент на CTE, с относително съдържание от 48,6 процента, иридоидите и иридоидните гликозиди са 6,9 процента, а общите захариди са 20.0 процента. Тези

компонентите на CTE след това се характеризират с помощта на UPLC-Q-TOF-MS. Бяха открити и идентифицирани общо 27 съставки, включително 20 съставки на PhG, пет иридоида и иридоидни гликозиди и два олигозахарида. Подробна информация, включително време на задържане, точни MS и MS/MS фрагментни йони, са изброени в поддържаща информация (допълнителна таблица S2). UPLC-Q-TOF-MS обща йонна хроматограма (TIC) на CTE е показана на допълнителна фигура S3.

CTE подобрява депресивното поведение при CUS плъхове

При CUS плъхове, общото време на неподвижност в FST и латентността за хранене при NSFT бяха значително намалени чрез лечение с CTE, а предпочитанието на захароза при SPT и общото изминато разстояние при OFT бяха увеличени.

Фигура 1А илюстрира острите ефекти на CTE върху времето на неподвижност при FST при плъхове CUS. В сравнение с моделната група CUS, 3--дневно остро перорално приложение на CTE значително намалява общото време на неподвижност при FST [еднопосочен ANOVA, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. Допълнителен последващ анализ разкри, че администрацията

ТАБЛИЦА 1|химически състав наC. tubulosaекстракт от CTE с група с висока доза (тест на Дънет, p < {{0}}.05) и група с ниска доза (тест на Дънет, p < 0,05) показва значително намаляване на общото време на неподвижност в FST .

Ефектите на CTE върху предпочитанията на захароза при SPT при CUS плъхове са показани на Фигура 1B. Двадесет и осем дневна стресова процедура причинява значително намаляване на предпочитанията за захароза в групата на CUS модела в сравнение с контролните нестресирани плъхове [еднопосочен ANOVA, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}}09; Тест на Dunnett, p <0,05], което="" показва,="" че="" cus="" моделът="" е="" разработен="" успешно.="" като="" положителна="" контрола,="" flx="" групата="" значително="" повишава="" предпочитанието="" за="" захароза="" при="" cus="" плъхове="" [еднопосочен="" anova,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" тест="" на="" dunnett,="" p=""><0.05], демонстриращ="" предсказващата="" валидност="" на="" cus="" модела.="" хроничното="" перорално="" приложение="" на="" cte="" в="" група="" с="" високи="" дози="" показва="" ключови="" ефекти="" върху="" предпочитанията="" за="" захароза="" [еднопосочен="" anova,="" f(4,34)="3.993,p=0.009;" тест="" на="" dunnett,="" p="">< 0,01],="" който="" го="" възстановява="" до="" нормални="" нива="" при="" cus="" плъхове.="" cte="" с="" групата="" с="" ниска="" доза="" показва="" нарастваща="" тенденция,="" но="" ефектът="" не="" е="" статистически="" значим="" (тест="" на="" dunnett,="" p="">

Както е показано на Фигура 1C, общото разстояние, покрито в OFT, също беше използвано за оценка на ефектите на CTE върху CUS плъхове. В сравнение с нестресирани плъхове, групата с CUS модел показа много по-късо общо разстояние [еднопосочен ANOVA, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}}01; Тест на Dunnett, p < 0.001]="" след="" 4-седмично="" излагане="" на="" cus="" и="" лечението="" с="" flx="" с="" положителна="" контрола="" увеличава="" общото="" разстояние="" при="" cus="" плъхове="" [еднопосочна="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001;" тест="" на="" dunnett,="" p=""><0.05]. ежедневното="" перорално="" приложение="" на="" cte="" с="" висока="" доза="" и="" ниска="" доза="" показва="" очевиден="" ефект="" върху="" общото="" разстояние="" при="" cus="" плъхове="" [еднопосочен="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" тест="" на="" dunnett,="" p="">< 0,01="" за="" група="" с="" висока="" доза,="" p="">< 0,001="" за="" група="" с="" ниска="" доза,="" съответно].="" допълнителна="" фигура="" s4="" показва="" картата="" на="" проследяването="" на="" активността="" в="">

Фигура 1D показва ефектите на CTE върху латентността за ядене в NSFT при CUS плъхове. Двадесет и осем дневна стресова процедура предизвика значително увеличаване на латентността за започване на хранене в групата на CUS модела в сравнение с контролните нестресирани плъхове [еднопосочен ANOVA, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{{10}}19; Тест на Dunnett, p <0,05], което="" показва,="" че="" cus="" моделът="" е="" разработен="" успешно.="" дългосрочното="" перорално="" приложение="" на="" cte="" с="" висока="" доза="" показа="" очевидни="" ефекти="" върху="" латентността="" за="" започване="" на="" хранене="" в="" сравнение="" с="" cus="" групата="" (t-тест="" на="" стюдънт,="" t="2.759," p=""><0.05), докато="" ниска="" доза="" cte="" показа="" без="">

CTE възстановява нивото на невротрансмитери и невротрофични фактори в CUS плъхове

Ефектите на CTE върху нивата на {{{{10}}}}HT и NE в хипокампуса на CUS плъхове са показани на фигури 2A,B. Четириседмична стресова процедура доведе до значително намаляване на 5-HT [еднопосочен ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0{{39 }}01; Тест на Дънет, p < 0.001]="" и="" ne="" [еднопосочен="" anova,="" f(4,34)="6.376,p=0.0006;" тест="" на="" dunnett,="" p=""><0,001] концентрация="" в="" хипокампуса="" на="" cus="" плъхове="" в="" сравнение="" с="" тази="" в="" контролната="" група,="" и="" антидепресантът="" flx="" значително="" възстанови="" 5-ht="" нивата="" в="" хипокампуса="" [еднопосочен="" anova,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" p="0.0001;" тест="" на="" dunnett,="" p="">< 0.001].="" след="" перорално="" приложение="" на="" cte="" в="" група="" с="" висока="" доза="" се="" наблюдава="" значително="" повишаване="" на="" нивото="" на="" 5-ht="" [еднопосочен="" anova,="" f(4,34)="17.13," p="0.0001" ;="" тест="" на="" dunnett,="" p=""><0.001], докато="" концентрациите="" на="" ne="" не="" са="" променени.="" по="" подобен="" начин,="" експресията="" на="" bdnf="" беше="" значително="" намалена="" в="" групата="" на="" cus="" модела="" в="" сравнение="" с="" нестресираните="" плъхове="" (t-тест="" на="" студент,="" t="4.171," p=""><0.01) (фигура="" 2c).="" както="" дългосрочно="" перорално="" приложение="" на="" cte="" с="" висока="" доза="" (t-тест="" на="" стюдънт,="" t="2.548," p=""><0.05), така="" и="" flx="" (t-тест="" на="" стюдънт,="" t="2.263," p=""><0.05 )="" повишена="" експресия="" на="" bdnf="" в="" сравнение="" с="" моделната="" група="" cus.="" cte="" с="" ниска="" доза="" не="" показва="" значителен="" ефект="" върху="" експресията="" на="">

Нивото на {{0}}HT в дебелото черво на CUS плъхове е различно от това в хипокампуса и 4-седмичната стресова процедура не оказва влияние върху 5-HT на дебелото черво (Фигура 2D ). Обратно, пероралното приложение на CTE с висока доза стимулира нивата на 5-НТ в дебелото черво в сравнение с моделната група на CUS (t-тест на Стюдънт, t=2.173, p < 0,05).="" cte="" с="" ниска="" доза="" не="" показва="" ефект="" върху="" нивото="" на="" 5-ht="" в="" дебелото="">

CTE регулира чревния микробен състав на CUS плъхове

Ефектът на CTE върху микробния състав на червата на CUS плъхове беше оценен чрез метода, базиран на секвениране на 16S rRNA ген. Установено е, че 28 дни перорално приложение на CTE променя чревния микробен състав на CUS плъхове и повлиява различни

микробни таксономични нива сред групите плъхове (ниво на клас 1, ниво на разред 1, ниво на семейство 1, ниво на род 8 и ниво на вид 2). Това предполага, че чревната микробна общност може да играе роля в антидепресивните ефекти на CTE. Подробна информация за значително променени чревни микробни таксони на различни таксономични нива е показана в таблица 2.

Секвенирането на MiSeq даде общо 2 132 980 необработени четения след контрол на качеството, премахване на шума и процес на премахване на химера. След това показанията бяха групирани в OTU, които бяха присвоени на таксони от тип до ниво на вид. Изследването на анализа на бета разнообразието беше проведено, за да се изследва сходството на моделите на бактериалната общност сред петте групи плъхове. PCoA на базата на претеглени UniFrac разстояния на чревната микробиота от петте изследвани групи плъхове е показано на Фигура 3А. Бета анализът на разнообразието от PCoA показа ясно отделяне на микробната общност от контролната група и групата с CUS модел, докато CTE с групата с висока доза има тенденция да бъде по-близо до контролната група в сравнение с групата с CUS.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 процента. Както е показано на допълнителни фигури S5A, B, 4-седмична стресова процедура е причинила незначителна тенденция към повишено ниво на Firmicutes и незначително намаляване на Bacteroidetes в групата на CUS модела в сравнение с контролната група. След ежедневно прилагане на CTE с висока и ниска доза, относителното изобилие на Firmicutes и Bacteroidetes се върна до подобни нива на контролната група, макар и без статистическа значимост. И въпреки че подобни промени са наблюдавани за съотношението Firmicutes/Bacteroidetes сред групите плъхове, не са показани статистически разлики (допълнителна фигура S5C). Незначима тенденция към понижено ниво на цианобактерии от тип цианобактерии беше открита в групата с CUS модел в сравнение с контролните нестресирани плъхове; докато прилагането на CTE с висока доза доведе до значително увеличение на относителното изобилие на цианобактерии в сравнение с групата CUS (допълнителна фигура S5D).

На ниво род, Bacteroides и Ruminococcus са два от най-разпространените микробни таксони, които представляват приблизително 30 процента относително изобилие във всичките пет групи плъхове. Четириседмична стресова процедура причинява значително намаляване на относителното изобилие на Bacteroides и значително увеличение на Ruminococcus в групата на модела CUS в сравнение с контролните нестресирани плъхове (Фигури 4A, B). Дългосрочното приложение на CTE доведе до значително увеличаване на изобилието на Bacteroides, както и значително намаляване на Ruminococcus в сравнение с CUS плъховете. Освен това, шест рода Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus и Brachybacterium показват статистически значими разлики между групата на CUS модела и контролната група (фигури 4C-H). След 28 дни лечение на CTE, относителното изобилие на гореспоменатите шест рода съответно се променя до нива, подобни на контролната група.

Ниско изобилие на Deinococcus в различни таксономични нива, включително ниво на клас (Deinococci), ниво на разред (Deinococcales), ниво на семейство (Deinococcaceae) и ниво на род (Deinococcus) беше открито в групата на плъхове CUS, докато не успя да бъде открито в контролата група и административните групи (Фигури 5A-D).

На ниво вид, Weissella beninensis е много по-нисък в CUS групата, отколкото в контролната група, и се наблюдава значително увеличение на относителното изобилие след прилагане на CTE с висока доза (Фигура 5E). Обратно, прилагането на CTE обърна значителното увеличение на относителното изобилие на конгломерат Brachybacterium, наблюдавано при CUS плъхове (Фигура 5F).

CTE модулирани SCFA при CUS плъхове

Концентрациите на SCFA (включително ацетат, пропионат, бутират, изобутират, валерианова киселина, изовалерианова киселина и хексанова киселина) във фекални проби от плъхове са анализирани чрез GC и са показани на Фигура 6. Нивата на ацетат [еднопосочен ANOVA, F( 4,32)=2.721, p=0.0467; Тест на Дънет, p < 0.05]="" и="" хексанова="" киселина="" [еднопосочен="" anova,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" тестът="" на="" dunnett,="" p="">< 0,05]="" са="" значително="" увеличени="" при="" плъховете="" от="" cus="" моделната="" група="" в="" сравнение="" с="" контролната="" група.="" след="" дългосрочно="" приложение="" на="" cte="" с="" висока="" доза,="" ацетат="" (t-тест="" на="" стюдънт,="" t="2.182," p=""><0.05) и="" хексанова="" киселина="" [еднопосочен="" anova,="" f(4,30)="3" .028,="" p="0.0328;" тест="" на="" dunnett,="" p=""><0,05] концентрациите="" са="" предимно="" намалени="" в="" сравнение="" с="" cus="" групата,="" което="" показва,="" че="" cte="" може="" да="" упражнява="" своята="" антидепресантна="" активност="" чрез="" модулиране="" на="" нарушените="" невроактивни="" метаболити="" scfas.="" прилагането="" на="" cte="" с="" група="" с="" ниска="" доза="" показва="" тенденция="" на="" намаляване,="" но="" без="" забележителен="" ефект="" върху="" концентрациите="" на="" ацетат="" и="" хексанова="">

Корелационен анализ на чревната микробиота, невротрансмитерите и невротрофините в хипокампуса, 5-HT в дебелото черво и SCFAs

За да се изследва функционалната връзка на променената чревна микробиота на родово ниво, променените невротрансмитери и невротрофини в хипокампуса и дебелото черво и смущаващата концентрация на SCFA, бяха разработени коефициентите на корелация на Pearson (Meng et al., 2017). Корелациите между тях (r > 0.4 или r < -0.4,="" p=""><0.05) са="" показани="" на="" фигура="" 7.="" коефициентите="" показват="" силни="" корелации="" между="" променения="" състав="" на="" чревната="" микробиота="" на="" ниво="" род,="" концентрацията="" от="" седем="" вида="" scfas="" и="" свързани="" с="" депресията="" моноаминови="" невротрансмитери="" (5-ht="" и="" ne).="" изобилието="" на="" ruminococcus="" показва="" значителна="" отрицателна="" корелация="" с="" 5-ht="" концентрация="" в="" хипокампуса,="" което="" означава,="" че="" cus="" процедурата="" води="" до="" увеличаване="" на="" относителното="" изобилие="" на="" ruminococcus="" и="" намаляване="" на="" 5-ht="" концентрациите.="" след="" лечение="" с="" cte,="" относителното="" изобилие="" на="" ruminococcus="" беше="" намалено="" до="" нивото="" на="" контролната="" група="" и="" беше="" установено,="" че="" нивата="" на="" 5-ht="" са="" се="" подобрили.="" освен="" това,="" относителното="" изобилие="" на="" bacteroides="" е="" положително="" корелирано="" с="" 5-ht="" ниво="">

хипокампус и отрицателно свързани с концентрацията на бутират, изобутират, валерианова киселина, изовалерианова киселина и хексанова киселина; изобилието на Parabacteroides показва значителна положителна корелация с 5-HT ниво в хипокампуса и концентрацията на пропионат, докато показва отрицателна корелация с концентрациите на изобутират и изовалерианова киселина; също така се наблюдава значително положителна връзка между относителното изобилие на Butyricimonas и нивото на NE в хипокампуса, а относителното изобилие на Deinococcus е положително корелирано с концентрацията на ацетат. Това демонстрира, че CTE може да упражнява своята антидепресантна активност чрез промяна на състава на чревната микробиота, нарушаване на нивата на невротрансмитери в хипокампуса и възстановяване на невроактивните метаболити SCFA. Подробни данни от корелационния анализ са показани в допълнителна таблица S3.

цистанчеможе да лекувадиабет

ДИСКУСИЯ

Идентифициране на антидепресивната активност на CTE и нейните клинични предимства

Това проучване оценява антидепресивната активност на CTE при плъхове CUS, потвърждава ефикасността на in vivo модели като FST, SPT, OFT и NSFT и потвърждава антидепресивната активност наC. tubulosaпри CUS плъхове, който често се използва за лечение на бъбречна недостатъчност, импотентност и женско безплодие в TCM. В момента най-често предписваните антидепресанти са инхибиторът на обратното захващане на серотонин и норепинефрин (SNRI) венлафаксин, следван от селективния инхибитор на обратното захващане на серотонина (SSRI) FLX (Thase et al., 2001; Mcintyre, 2017). Доказано е обаче, че тези антидепресанти притежават тежки странични ефекти, включително сърдечна токсичност, кръвно налягане, сексуална дисфункция и нарушения на съня (Ferguson, 2001; Jin et al., 2015). Сред всички класове антидепресанти, SSRI и SNRI са свързани с най-високата честота на сексуална дисфункция (Montejogonzalez et al., 1997; Clayton et al., 2014). Особено внимание заслужава общата честота на сексуална дисфункция, която е 59,1 процента (604/1022), когато всички антидепресанти се разглеждат като цяло; и около 40 процента от пациентите показват ниска толерантност към сексуална дисфункция, като по този начин спазването на лекарствата е силно засегнато (Clayton, 2001). С оглед на недостатъците на сегашното лечение на депресия, Cistanches Herba показва голям потенциал за клинично приложение, не само поради своята мощна подобна на антидепресант активност, но и защотоCistanches Herbaтрадиционно се използва за лечение на импотентност, което би трябвало поне да елиминира едно безпокойство от най-често срещаните странични ефекти, причинени от други антидепресанти (Fu et al., 2017). В допълнение, Cistanches Herba не показва признаци на токсичност и промени, свързани с лечението