Антиоксидант и потенциал против стареене на пептидна формула (Gal2–Pep), конюгирана с галова киселина
May 04, 2023
Кожата е силно уязвима към преждевременно стареенепоради външен стрес, следователно, в това изследване, пептидна формула (галоил)2–KTPPTTP (гал2–Pep) се синтезира чрез комбиниране на TPPTTP пептид и галова киселинакиселина (GA). Всички пептиди са синтезирани върху 2-хлоротритил хлоридна смола с помощта на твърдофазов пептидсинтез (SPPS) и анализирани чрез електроспрей йонизация (ESI)/квадруполно време наflflight (Q-TOF) тандемна система за масспектроскопия (MS). Първоначално Гал2–Pep не показва токсичност под концентрация 100mM с клетъчна преживяемост от 88 процента за кератиноцитите ифибробласти. Theреактивни кислородни видове(ROS) прочистваща активност на Gal2–Pep беше по-стабилен в сравнение само с GA; и след четири седмици в стаятатемпература, неговатаROS почистваща дейностостана над 50 процента. Освен това, пептидната формула,гал2–Pep също показва инхибиторен ефект върху еластазата в CCD-1064Skфибробластклетки. Въз основа на резултатите от RT-qPCR, в това проучване беше доказано, че Gal2–Pep увеличи израза на PGC-1a да сепредотвратявамоксидативен стрес, и потвърди потенциала му катосредство против стареенеотувеличаване на изразяването натип I колагени отнамаляване на експресията на матриксната металопротеиназа-1 (MMP1). Theнаходки получените подсилват предположението, че пептидната формулировка, синтезирана в това изследване, може да се използва като aестествен антиоксидантисредство против стареенеза козметичните му приложения.
Щракнете тук, за да получите повече информация за продуктите Cistanche против стареене
1. Въведение
Стареене на кожатавъзниква в резултат на постепенното намаляване и евентуално спиране на клетъчното делене на кератиноцитите ивзривове в кожата. Бръчките по кожата се развиват, когато броят на клетките намалява, като произтичащата от това денатурация на извънклетъчния матрикс води до сухота и загуба на еластичностплътност в кожата.1 Увреждане на вътреклетъчната митохондриална ДНКи също така настъпва намаляване на скоростта на протеиновия синтезпо време на процеса на стареене на кожата.2 Стареенето на кожата има два основни пътяначини, вътрешни и външни, с ултравиолетово (UV) излагане
основен двигател навъншно стареене. UV светлината реагира с основните компоненти на кожата, включително липиди, протеини и нуклеинови киселини, за производство на реактивни кислородни видове (ROS), които водят до клеткитесмърт.3–5 Прекомерните нива на ROS също водят до разцепване инеобичайно свързване на колагенови или еластинови вериги и насърчаване на експресията на матрични металопротеинази (ММР), като ММР-1, които разграждат колагена, което води до набръчкване на кожата иускоряване на стареенето на кожата.6,7 Следователно, антиоксидантна терапия за премахванеROS и за активиране на митохондриалния потенциал има заслуги за защита на кожата от стареене.
В допълнение към ROS, еластазата има значителна роля в загубата наеластичност на кожата, което разгражда еластина, важен протеин наизвънклетъчен матрикс.8 Еластин, поради значителния си еластичен откатхарактеристики, осигуряват еластичност на кожата, докато еластазата имаспособността да разцепва еластин и други протеини.8 Следователно, inhibiна ензима еластаза може да бъде ключова стратегия за отпускане на кожата чрез предотвратяване загубата на еластичност на кожата.
В това проучване разработихме нов материал, който съчетавапероксизомен пролифератор-активиран рецептор гама коактиватор1-алфа (PGC-1a)-производен пептид TPPTTP и галова киселина (GA)за използване в козметиката против стареене. GA е фитохимикал, открит в различни плодове и зеленчуци, включително грозде, домати и зелен чай, за който е известно, че има високо антиоксидантно и антибактериално действие effects.9 Въпреки че GA се използва в козметичната и хранително-вкусовата промишленост поради тези полезни effects, формулировката му е склонна да бъде нестабилна.10 Така разработихме (галоил)2–KTPPTTP (гал2–Pep), за да се увеличи стабилността на GA чрез свързването му с PGC-1a-производен пептид TTPTTP.
В това изследване ние синтезирахме (галоил)2–KTPPTTP (гал2– Pep) пептидна формулировка в конюгация с галова киселина и потвърденапотенциала му като антиоксидант и агент против стареене.
2. Материали и методи
2.1. Материали
Модифициран на DulbeccoEagle's Medium (DMEM), пеницилин/стрептомицин, фетален говежди серум (FBS), фосфат-буffередфизиологичен разтвор (PBS) и трипсин са закупени от Gibco (Carl
лошо, Калифорния). Хидроксибензотриазол (HOBt), диизопропил карбодиимид (DIC), 1,8-диазабицикло[5.40]ундец-7-ен (DBU),N, N-диизопропилетиламин (DIEA), галова киселина иN-сукцинил-три-аланил-pнитроанилид са получени от Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).L-Образувайте аминокиселини (Fmoc-Lys (Boc)–OH, Fmoc-Thr (tБу)–OH, и Fmoc-Pro–OH) са закупени от Bead-Tech (Сеул,Корея).
2.2. Синтез на пептиди и пептиди, свързани с галова киселина
Всички пептиди са синтезирани върху 2-хлоротритил хлоридна смола (200mмолна скала, стойност на заместване¼ 1,46 mmol g 1) с помощта на HOBt–DIC медииран твърдофазов пептиден синтез (SPPS).
Пептидният синтез с помощта на метода SPPS се провежда с леки модификациикатиони, отнасящи се до предишни проучвания.11–13 2-хлоротритилхлоридна (СТС) смола се набъбва в дихлоро
метан (DCM, 8 mL) за 30 min. Смолата се измива сдиметилформамид (DMF). Всички реакции се провеждат при стайна температура. Fmoc защитени аминокиселинни производни (2 еквивал(Еквив.), зафипървата прикрепена аминокиселина или 5 еквивалента, за другите аминокиселини) бяха свързани или с DIEA (5 еквивалента, за прикрепена аминокиселина) или HOBt/DIC (6 еквивалента/5 еквивалента) в DMF aфутаеризвършване на премахване на защитата на Fmoc, използвайки 2 процента (v/v) DBU в DMF (2 пъти, 2 min на път, 8 mL). И всички стъпала бяха измити 5 пъти с DMF. Крайната галова киселина се свързва с лизин-прикрепени пептиди.След свързването на галовата киселина, смолата бешеaфилтриран, измит,и се изсушава под силен вакуум. Разтворът за разцепване (TFA:дейонизирана [DI] вода: TIS¼ 95 : 2,5 : 2,5, v/v/v процента) се третира в продължение на 2 часаза получаване на суровите пептиди. Суровите пептиди се утаяват и се промиват три пъти със студен диетилов етер.
Аналитична обратнофазова високоефективна течна хроматография(RP-HPLC) се провежда на Waters 2695 SeparationsМодул с колона Capcell Pak C18 (4,6 mm 250 mm, 5mм, Shiseido). Мобилната фаза се състоеше от 0.05 процента TFA в H2O (подвижна фаза A) и 0.05 процента TFA в ацетонитрил (подвижна фаза B).
Елуирането беше постигнато чрез използване на линеен градиент за мобилни устройствафаза B от 5 процента до 65 процента за 30 минути при aскорост на поток от 1.0 mL мин 1. Пептидните пикове се откриват при дължина на вълната 230 nm. Полупрепаративната RP-HPLC се провежда на Waters HPLC система (помпа 600E, детектор UV-484) с Gemini RP-C18колона (21,2 мм 250 mm, 5mм, Phenomenex). Мобилната фаза се състоеше от 0.05 процента TFA в H2O (мобилна фаза A)и 0.05 процента TFA в ацетонитрил (подвижна фаза В). Елуирането беше постигнато чрез използване на линеен градиент за подвижна фаза В на7 процента до 22 процента за 15 минути при alскорост на поток от 10 ml мин 1. Theпептидните пикове се откриват спектрофотометрично при дължина на вълната 230 nm.
Синтезираните пептиди се разтварят в 5 процента мравчена киселина във вода и се анализират чрез електроспрей йонизация (ESI)/квадруполно време-на-light (Q-TOF) тандемна масспектроскопия(MS) система (TripleTOF6600, ABSciex, Фостър Сити, Калифорния). Пробите бяха инжектирани в системата Q-TOF, оборудвана сизточник на нано-спрей в alтекуща скорост от 1mL мин 1. Йонът ESIпараметрите на източника бяха както следва: напрежение на йонно разпръскване от 1,5 kV, завесен газ при 10 psi и обвивен газ при 5 psi. Спектрите врежим на пълно сканиране и MS/MS бяха събрани в диапазона отm/z
100–1200 Da при време на натрупване от 25 ms на спектър.Енергията на сблъсъка беше увеличена от 10 на 80. Резултатътданните са получени с помощта на Analyst TF такафаянс и автоматичнозададен от центроида 80 процента с минимален пик, намаляване на шума от 10 процента, средно деизотопиране с 3 процента праг, без намаляване на шума и без изглаждане. Синтезираните пептиди бяха идентифициранис масов толеранс от 0.05 Da и ръчно секвенирани с помощта на MS/MS толеранс от 0.01 Da.
2.3. Клетъчни култури и тестове за жизнеспособност
Човешки, възрастни, клетки с ниско съдържание на калций и висока температура (HaCaT).и CCD-1064Sk (нормална човешка кожафибробластни) клетки бяхакултивиран в DMEM с 10 процента FBS и 1 процент пеницилин/стрептомицин. Клетките се инкубират при 37°С C в камера с овлажнен въздух с 5 процента CO2.За анализите на жизнеспособността беше използван комплект за преброяване на клетки-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Пекин, Китай). HaCaT и CCD-1064Sk клеткибяха посяти в 96-ямкови микроплаки (5 103 клетки на ямка) и се инкубират при 37 C в 5 процента CO2 за 24 ч. След това културите се излагат на различни концентрации на синтезираните пептиди или GA и се инкубират при 37 C в 5 процента CO2 за 24 ч. Клетъчна жизнеспособноствпоследствие беше измерен с помощта на CCK-8 в съответствие с указанията на производителя.
2.4. Определяне на антиоксидантна активност
2.4.1. DPPH анализ.Антиоксидантната активност на синтезиранитепептиди и GA се оценява индивидуално с помощта на DPPH анализ. DPPH анализите бяха извършени след докладвани по-рано
методология с незначителни модификациикатион.12,14–16 Първо, 0.12 mg mL 1 DPPH разтвор се приготвя в метанол, след това 100mL разтвор на DPPH и 100mL от синтезираните пептиди или GA бяха смесени при различни концентрации ({{0}}.1 mM, 0.05 mM, 0.01 mM и 1mM) в 96-ямкови микроплаки. В орбитален разклащащ инкубатор,смесите реагират в продължение на 30 минути при 37 C и 100 оборота безсветлина. След това се измерва абсорбцията при 517 nm и се изчислява антиоксидантният капацитет.
2.4.2. ROS почистваща активност.
Вътреклетъчната активност на изчистване на ROS беше оценена с помощта на комплект 20,70-дихлорофлуоресцеин диацетат(DCF-DA, Abcam, САЩ). HaCaT клетки бяха посяти в 96-ямкови микроплаки (5 103 клетки на ямка) и се инкубират при 37 C за 24 часа.Aфутаслед инкубацията, културите бяха изложени на синтезираните пептиди или GA (100mM) и се инкубира при 37 C за 24 часа. След това клетките бяха изложени на 10mM DCF-DA разтвор и се инкубира за 30 минути. Афутаслед инкубиране, разтворът се промива с PBS. Theклетките бяха анализирани с помощта на четец на микроплаки при възбуждане и
емисионни дължини на вълната съответно 485 nm и 530 nm.
Фиг. 1Синтетична стъпка и потвърждение на последователността на пептиди с помощта на квадруполно време наполет(Q-TOF) мас спектрометрия: (a) подробна синтетична процедура (b) TPPTTP, (c) галоил–TPPTTP и (d) (галоил)2–KTPPTTP.
2.5. Анализ на потенциала на митохондриалната мембрана
JC-1 багрило (Thermo Fisher, САЩ) е използвано за митохондриалнианализ на мембранен потенциал (MmP). CCD-1064Sk и HaCaT клетки бяха посяти в 96-ямкови микроплаки (5 10 3клетки на ямка)
и се инкубира на 37 C и в 5 процента CO2 за 24 ч. Кърматаинкубация,културите бяха изложени на различни концентрации на синтезираните пептиди и инкубирани при 37 C в 5 процента CO2 за 24 ч.Багрилото JC-1 беше добавено към клетките CCD-1064Sk и HaCaT, за дапроизвеждам a крайна концентрация 10mM. Aфутаслед 10 минути инкубация, клетките се промиват два пъти с 37 C PBS. Зелено и червенофлуоресценциябяха измерени с помощта на Varioskan LUXМногомодов четец на микроплаки (ThermoFisher, САЩ) на ексцитация (lПр)/емисия (lЕм) от 475/530 nm и alПр/lЕмот 475/590 nm, съответно.
2.6. Тест за инхибиторна активност на еластаза
CCD-1064Sk клетки се посяват в 6-ямкови плаки и се инкубират при 37 C в 5 процента CO2 за 24 ч. След това културите бяха изложени на концентрация от 100mM от синтезираните пептиди или GA и инкубирани при 37 C в 5 процента CO2 за 24 ч. Клетките бяха промити с dPBS два пъти и ние събрахме всяка клетка с помощта на клетъчен скрепер. Адобавям 0.2 M Tris–HCl (pH 8.0) с 0.1 процента Triton-X към събранотоклетки, клетките бяха хомогенизирани чрез ултразвук. Хомогенизираният разтвор се центрофугира в продължение на 20 минути при 3000 rpmи 4 C. След това, aфутаer вземане на супернатанта, протеинови количества-катион се извършва с помощта на BCA протеинов анализ. Протеин за всекипробата беше разпределена вфикрайна концентрация от 100mgmL 1, иN-сукцинил-три-аланил-p-нитроанилид беше добавен прикрайна концентрация от 1,6 mM и реагира при 36 C за 1 час.След това се измерва абсорбцията при 405 nm с помощта на четец на микроплаки.
2.7. RT-qPCR
Нивата на иРНК на маркери против стареене в CCK-1064Sk клеткибяха оценени с помощта на RT-qPCR. Общата РНК се събира с помощта на TRIzol реагент (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) и обратно
транскрибира се с помощта на комплекта реактиви PrimeScript RT (Takara BioInc., Кусацу, Япония). Система CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Херкулес, Калифорния) и iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora
tories) бяха използвани за RT-qPCR.b-Актинът се използва за нормализиране на нивата на иРНК на колаген тип I, MMP-1 и PGC-1a.
2.8. Статистически анализ
Данните са представени като средна стойност стандартно отклонение оттри независими измервания и анализирани с помощта на Student'st-тестове, с ap < 0.05 considered to be a signiняма разлика.
Питай за още:
Имейл:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: плюс 86 15292862950
