Подходящото ниво на упражнения намалява чревната дисбиоза и увеличаването на валериановата киселина за подобряване на невропластичността и когнитивната функция след операция при мишки, част 4

Профилиране на чревната микробиота

Пресни изпражнения от мишки бяха събрани за профилиране на чревната микробиота. Мишките се поставят индивидуално в автоклавна клетка за събиране на изпражнения и им се оставя да дефекират свободно. Изпражненията се събират незабавно в стерилни епруветки Eppendorf върху сух лед и след това се съхраняват при -80 градуса до по-нататъшна обработка. Бактериалната ДНК се екстрахира с Power Lyzer Power soil DNAisolation kit съгласно нашите предишни протоколи [11].

Последните изследвания показват, че микробиомът на червата има много важно влияние върху нашата памет. Точно бактериите в чревната микробиота могат да повлияят на нервната система на човешкия мозък, като по този начин променят функцията на паметта му. Това е изненадващо откритие, защото означава, че можем да подобрим паметта си, като променим чревния си микробиом.

И така, като човек, който се опитва да подобри паметта си, какво можете да направите, за да подобрите микробиома на червата си? Отговорът е прост: фокусирайте се върху балансирана диета. Балансираната диета не само помага за регулиране на баланса на чревната ви микробиота, но също така подобрява всички аспекти на телесната функция.

Първо, трябва да се съсредоточим върху разнообразна диета, която е богата на диетични фибри. Диета с високо съдържание на фибри може да помогне за поддържане на разнообразието на чревния ви микробиом, ключов фактор за насърчаване на доброто здраве. В същото време трябва да сме сигурни, че консумираме достатъчно висококачествен протеин и здравословни мазнини в храната си. Тези хранителни вещества могат да насърчат функцията на паметта и нервната проводимост.

В допълнение, редовните упражнения и намаляването на стреса също могат да насърчат баланса и разнообразието в микробиома на червата. Независимо дали става въпрос за дълбоко дишане, медитация или практикуване на йога, всичко това са ефективни начини за намаляване на стреса. Упражнението може да подобри чревния контрактилитет, да увеличи чревната жизненост и да насърчи цикличната детоксикация, като по този начин спомага за насърчаване на баланса и разнообразието на чревната микробиота.

Като цяло не трябва да се съсредоточаваме само върху нашата диета и физическо здраве, но и върху нашата чревна микробиота. Промяната на хранителните ни навици и намаляването на стреса могат да насърчат баланса и разнообразието в нашата чревна микробиота, което може да ни помогне да подобрим паметта и функцията на нервната система. Така че, нека заедно да обърнем внимание на здравето на червата си и да подобрим паметта и физическата си форма!

Вижда се, че трябва да подобрим паметта и Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola е традиционен китайски лекарствен материал, който има много уникални ефекти, един от които е да подобрява паметта. Ефикасността на Cistanche deserticola идва от многото активни съставки, които съдържа, включително танинова киселина, полизахариди, флавоноидни гликозиди и др. Тези съставки могат да насърчат здравето на мозъка по различни начини.

Щракнете върху познайте начините за подобряване на мозъчната функция

Библиотеките за секвениране на хиперпроменливата област V3–V4 бяха подготвени съгласно инструкциите на системата Illumina MiSeq. Накратко, 12,5 ng ДНК бяха използвани като ДНК шаблон за първата 16 S rRNA PCR. Използваните праймери са както следва: F: 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′ и R: 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′.
След това ампликоните бяха почистени с AMPure XPmagnetic гранули и след това използвани за Index PCR с помощта на комплекта Nextera XTIndex. Qubit dsDNA HS комплект за анализ и TapeStation с висока чувствителност D1000ScreenTape (Agilent, Blacksburg, VA, USA) бяха използвани за измерване на концентрациите на PCR продукти и нормализиране на количеството за подготовка на библиотеката.

Секвенирането се извършва на инструмент Illumina MiSeq от MiSeq reagent kit v2 (500 цикъла). Данните бяха анализирани със софтуера MiSeqReporter Metagenomics workflow v2.5.1.3 (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Сдвоените показания, получени чрез двойно-терминално секвениране, бяха свързани в последователност чрез софтуер Pandaseq. Бяха получени дългите показания с високо променливи региони.

Четенията, чийто среден phred резултат в прозореца (5 bp по размер, 1 bp дължина на стъпка) бяха подрязани. Четенията, съдържащи двусмислено „N“ или с дължина < 220 bp, бяха отхвърлени. След контрол на качеството на оригиналните данни, висококачествени последователности без химери бяха подредени според изобилието от големи до малки и след това групирани с 97% сходство в оперативни таксономични единици (OTU). Счита се, че всеки OTU представлява вид. За да се избегне отклонението на анализа, причинено от различните размери на данните за секвениране на проби, броят на четенията към OTU беше въведен според минималния номер на последователност, съответстващ на OTU, когато дълбочината на секвениране беше достатъчна. Алфа разнообразието беше анализирано чрез произволно изравняване.

ARead беше извлечен от всеки OTU като представителна последователност. Представителната последователност беше сравнена с базата данни на проекта за рибозомна база данни. Видовете бяха класифицирани за всяка OTU и бяха получени таблици за изобилие на видове за последващ анализ. Изборът на OTU беше извършен с помощта на Uclust на софтуерната платформа QIIME v1.9.1.

Алфа разнообразието, включително индексът Chao1 и индексът на покритие на стоките, беше използвано за анализ на видовото разнообразие в проба. Бета анализът на разнообразието беше използван за сравняване на разликите във видовото разнообразие между пробите и характеризиран чрез анализ на главните координати (PCoA), базиран на разстоянието Брей-Къртис. Разликите между групите бяха тествани чрез анализ на сходството (ANOSIM).

Плазмено SCFA профилиране

Плазмените концентрации на SCFA се определят количествено с помощта на 7890–5977 газова хроматография-масспектрометрия (GC-MS, Agilent, Blacksburg, VA, USA). Плазмените проби се събират от мишки във времеви точки, описани по-горе, съхранявани при -8{ {20}} градуса бързо и след това размразени до стайна температура за обработка. Накратко, 100 ul плазмена проба се смесва на вортекс с 900 улетанол (съдържащ 0.5% HCI, V/V). Ултразвукова обработка се прилага за 40 минути и след това пробите се центрофугират при 14,000 RPM за 10 минути. Супернатантата на пробите се измерва чрез GC-MS анализ на Agilent 7890–5977 GC-MS с йонизация с електронен удар и Капилярна колона DB-FFAP (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm).

Количествено определяне на кортикална валерианова киселина

Количеството валерианова киселина в мозъчната кора, събрано 24 часа след последното интраперитонеално инжектиране на валерианова киселина, се определя по метод, подобен на докладвания преди [51, 52]. Накратко, 0.1 g мозъчна кора се хомогенизира в 500 ul воден ацетонитрил. Супернатантата се екстрахира с 8 ml екстракционен буфер (хексан: диетилов етер=1:1) и се центрофугира при 1800 g за 5 минути. 7,5 ml супернатанта се събира, смесва се с 93 ul 20 mMKOH в метанол и се изсушава при 40 градуса под азотен газ. Изсушеният остатък се възстановява в 50 µl 2,5% 18-Crown-6 в ацетонитрил и се дериватизира допълнително с 9-хлорометил антрацен в ацетонитрил с добавяне на тетраметиламониев хидроксид.

Накрая, 30 µl дериватизиращ разтвор се зарежда в колона Acclaim C18 (3 µm, 4.6 × 100 mm, Thermo Scientific) и се разделя в Ultimate 3000 високоефективна течна хроматография (HPLC, Thermo Scientific), оборудвана с UV-видим детектор. Пикът на дериватизираната валерианова киселина се открива при дължина на вълната 254 nm.2-Етилмаслената киселина (2-EA) се добавя като вътрешна референтна контрола. Площта на пика на валерианова киселина се измерва като mAU*min и неговата пикова площ на всяка проба беше нормализирана с тази на 2-EA в пробата. Крайните резултати бяха представени като съотношения на групата на валерианова киселина към групата на NS.

Събиране на мозъчна тъкан

Мишките бяха претеглени и анестезирани с изофлуран на 6 часа, 24 часа, 48 часа, 72 часа, 96 часа и 7 дни след операцията и перфузирани с 4 градуса NS за събиране на мозъчна тъкан. Тези хипокампи бяха използвани за ELISA анализ или РНК анализ. Целият мозък при Bregma -3 до -6 mm се използва за имунофлуоресцентно оцветяване. Всички процедури на дисекция бяха извършени върху лед.

Подготовка на mRNA библиотека и секвениране на Illumina Hiseq

The hippocampi harvested at 24 h after surgery from the control group, surgery group, and Exe+Sur group in the first experiment were placed in liquid nitrogen for 1 h and then stored in a −80 °C freezer quickly for no >1 седмица. Пречистването на РНК, обратната транскрипция, изграждането на библиотеката и секвенирането бяха извършени в WuXi NextCODE в Шанхай съгласно инструкциите на производителя (Illumina).

Библиотеките за секвениране, фокусирани върху иРНК от общата РНК, бяха приготвени с помощта на комплекта за подготовка на проби Illumina TruSeq® RNA. PolyA mRNA се пречиства от тоталната РНК с помощта на олиго-dTattached магнитни зърна и след това се фрагментира с буфер за фрагментиране. Вземайки тези къси фрагменти като матрици, първата верига cDNA се синтезира с помощта на обратна транскриптаза и произволни праймери, последвано от синтез на втора верига cDNA. След това синтезираната кДНК беше подложена на крайно възстановяване, фосфорилиране и добавяне на база „А“ съгласно протокола за конструиране на библиотеката на Illumina.

Адаптери за секвениране на Illumina бяха добавени към фрагментите на cDNA. След PCR амплификация за обогатяване на ДНК, AMPure XPBeads (Beckman) бяха използвани за почистване на целевите фрагменти от 200–300 bp. След изграждането на библиотеката Qubit 3.0 флуорометър dsDNA HS Assay (Thermo Fisher Scientific) беше използвани за количествено определяне на концентрациите на получените библиотеки за секвениране, докато разпределението на размера беше анализирано с помощта на Agilent BioAnalyzer 2100 (Agilent). Секвенирането беше извършено с помощта на система Illumina, следвайки предоставени от Illumina протоколи за 2 × 150 секвениране в сдвоен край в WuXi NextCODE в Шанхай, Китай.

Хипокампална иРНК експресия чрез количествена полимеразо-верижна реакция (Q-PCR)

Хипокампусът, събран 24 часа след операцията от контролната група, групата с упражнения, групата с хирургия, Exe+Sur група, Trans-Control+Sur група, Trans-Exe+Sur група, Exe+Sur+NS група и Exe+Sur+ Val групата се поставя в течен азот за 1 час и след това се съхранява във фризер при -80 градуса за не повече от 3 дни. Екстракцията на РНК, обратната транскрипция на РНК към сДНК и q-PCR бяха извършени, както описахме по-рано [49, 53]. Накратко, РНК беше екстрахирана от RNeasy Micro kit. Обратната транскрипция беше завършена с помощта на 5X All-in-One MasterMix. И накрая, CFX система за свързване в реално време (Bio-Rad) беше използвана за количествено количествено определяне. Праймерите за qPCR бяха: C3ar1-F:TGGGCTGGTGCTGTGGGTAG и C3ar1-R: GATGGCGAAGGCGGTTCTCAC. Относителната генна експресия за C3ar1 беше изчислена с помощта на сравнителния прагов цикъл ΔΔCt и домакинския ген -актин за нормализиране на генната експресия. Нивата на тРНК за целевите гени се изразяват съответно като кратно увеличение спрямо съответната група.

Определяне на цитокини и GDNF в хипокампуса

IL{{0}}, IL-6, C3 и GDNF в хипокампуса бяха открити с помощта на ELISAkits. За тестване на IL-1, IL,-6 и GDNF мозъчните тъкани се хомогенизират върху лед в RIPA буфер, съдържащ 25 mM Tris-HCl с pH 7,6, 150 mMNaCl, 1% натриев дезоксихолат, 0,1% SDS и коктейл от протеазен инхибитор, съдържащ 10 mg/ml апротинин, 5 mg/ml пепстатин, 5 mg/ml леупептин и 1 mM фенилметан сулфонил флуорид.

За тестване на C3 мозъчните тъкани се хомогенизират върху лед в PTR буфер (доставен в комплекта). Супернатантът се събира за откриване чрез ELISA, след като хомогенатът се центрофугира при 13,{2}} g за 20 минути при 4 градуса и концентрацията на протеин се определя чрез BCA протеинов анализ (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Herts, UK). IL-1, IL6, C3 и GDNF в супернатантата на мозъка бяха открити съгласно инструкциите на производителя за ELISA и количеството им във всяка проба в мозъка беше нормализирано чрез общото съдържание на протеин и беше изразено като pg/ мг протеин.

Western blotting

Уестърн блотинг се извършва, както е описано по-горе [49]. Накратко, протеиновите концентрации на пробите бяха определени с помощта на BCA протеинов анализ. Двадесет микрограма от всяка проба бяха подложени на Westernblotting анализ, използвайки следните първични антитела: заешки поликлонален анти-постсинаптичен протеин на плътност 95 (PSD95) при разреждане 1:1000, заешки поликлонален анти-синапсин 1 при разреждане 1:1000 и заешки анти- - тубулиново антитяло при разреждане 1:1000. Изображенията бяха сканирани от Image Master IIscanner (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) и анализирани с помощта на софтуера ImageQuant TL v2003.03 (GE Healthcare). Лентовите сигнали на интересуващите се протеини се нормализират към тези на съответния тубулин и се изразяват като фракции от контролната проба от същите гелове.

Имунофлуоресцентно оцветяване

Имунофлуоресцентното маркиране и количественото определяне на оцветяването бяха извършени, както описахме преди [6, 54]. Накратко, мозъкът се фиксира в 4% параформалдехид при 4 градуса за 24 часа и след това се инкубира в 30% захароза за една нощ при 4 градуса, преди да се замрази в съединение с оптимална температура на рязане. Коронални срезове с дебелина 20-µm се изрязват последователно от Bregma от −3 до −6 mm с помощта на криостат и монтирани върху предметни стъкла за микроскоп.

След промиване в Tris-буфериран физиологичен разтвор (TBS), срезовете се блокират в 10% магарешки серум плюс 1% говежди серумен албумин (BSA) в TBS, съдържащ 0,3% тритон-Х100 за 2 часа при стайна температура и след това се инкубират при 4 градуса през нощта със следните първични антитела: заешко моноклонално анти-C3 антитяло (1:50), козе моноклонално анти-GFAP антитяло (1:200), плъхово моноклонално анти-C3ar антитяло (1:50) и заешко моноклонално анти-Iba{{ 21}} антитяло (1:200).

Срезовете се промиват в TBS с 0.1% Triton-x 100. Магарешкото анти-заешко IgG антитяло, конюгирано с Alexa Fluor 594 (1:200), магарешко анти-козе IgG антитяло, конюгирано с Alexa Fluor 488 (1:200) магарешко анти-заешко IgG антитяло, конюгирано с AlexaFluor 594 (1:200) или магарешко анти-заешко IgG антитяло, конюгирано с AlexaFluor 647 (1:200) се инкубират със срезовете за 1 час при стайна температура на тъмно.

Срезовете се промиват в TBS, инкубират се с Hoechst 33342 (1:1000) за ядрено оцветяване, изплакват се и се монтират с монтажна среда Vectashield (H-1000; Vector Labs, Burlingame, CA). Изображенията на имунооцветяването бяха получени чрез z-stack с LSM710 микроскопска система (ZEISS) и във всички експерименти беше включена отрицателна контрола, пропускаща инкубацията с първичното антитяло.

Количественото определяне беше извършено, както е описано по-рано [6, 54]. Накратко, цялата област на зъбния гирус (DG), която беше покрита от 2-3 неприпокриващи се полета от всяка от шестте последователни секции на хипокампуса на една мишка, беше изобразена. Броят на пикселите на изображението с интензитет над предварително определено прагово ниво се счита за положително оцветена зона за интересуващ се маркер и се определя количествено с помощта на Image-pro plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, САЩ) и представено като процент от положителна площ в общата площ. След това шест измервания на мишка бяха осреднени, за да отразят нивото на положително оцветяване. Всички количествени анализи бяха извършени по заслепен начин.

Приложение на BrdU и имунофлуоресцентно оцветяване

Седем дни след операцията, на мишките бяха дадени 7 последователни интраперитонеални инжекции от 80 mg/kg 5′-бромо-2′-дезоксиуридин (BrdU) на обяд веднъж дневно, както е описано по-горе [14]. Мишките бяха умъртвени 5 дни по-късно, за да се събере хипокампусът. Хипокампусът се фиксира в 4% параформалдехид 0.1 М фосфатно буфериран физиологичен разтвор при 4 градуса за 24 часа и се поставя в парафин. Коронални мозъчни срезове с дебелина пет микрона бяха изрязани последователно от Bregma -2 до -4 mm. Извличането на антиген се извършва чрез инкубиране на срезове с натриев цитратен буфер, съдържащ 10 mM натриев цитрат, 0,05% Tween 20 (рН 6,0) при 95–100 градуса за 20 минути.

Денатурирането на ДНК се извършва чрез инкубиране с 1 N НС1 върху лед за 3 минути, 2 N НС1 при стайна температура за 3 минути и при 37 градуса за 6 минути. Срезовете бяха блокирани с 5% магарешки серум във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), съдържащ 0.5% тритон-Х 100 за 2 часа при стайна температура. След това срезовете се инкубират една нощ при 4 градуса със следните първични антитела: плъше моноклонално анти-BrdU антитяло (1:100) и козе моноклонално анти-GFAP антитяло (1:200). Срезовете се инкубират с магарешко анти-плъхово IgG антитяло, конюгирано с Alexa Fluor 594 (1:200) или магарешко анти-козе IgG антитяло, конюгирано с Alexa Fluor 488 (1:200) в продължение на 1 час при стайна температура в тъмна стая. След промиване в PBS, срезовете бяха насрещно оцветени с Hoechst 33342 (1:1000), изплакнати и монтирани с монтажна среда Vectashield (Vector Labs).

Изображенията са получени с флуоресцентен микроскоп с камера със свързано устройство (High MagOlympus BX51) и система за конфокална микроскопия LSM710 (ZEISS). Във всички експерименти беше включена отрицателна контрола, пропускаща инкубацията с първичното антитяло. За всеки мозък на мишка бяха използвани шест последователни хипокампални секции за преброяване на клетките. Броят на всички клетки, положително оцветени за интересуващ се маркер или комбинация от два маркера в суб-гранулираната зона на DG на всяка секция, беше преброен. Количествените анализи бяха извършени по заслепен начин.

Петно Голджи

Оцветяването по Голджи беше извършено с помощта на комплекта FD Rapid GolgiStainTM. Деветнадесет дни след операцията мозъците на 6 мишки във всяка група бяха потопени в разтвора за импрегниране (разтвори А и В: 1:1) за 2 седмици и след това прехвърлени в разтвор С за 3 дни. Коронални мозъчни срезове с дебелина 100 μm и около -2,7 mm от брегма бяха изрязани на вибратом (Microslicer® 10110, Ted Pella, Inc. Калифорния, САЩ).

Както е описано по-горе [55, 56], повече от 1 0 добре индивидуализирани неврони в DG региона на хипокампуса бяха избрани на случаен принцип от всяка мишка и бяха направени последователни оптични многослойни сканиращи изображения на интервал 2,0 μma по оста z (3DHISTECH, Pannoramic MIDI, Унгария) с 20 ×обектив. Файловете за многослойно сканиране бяха насложени, за да станат един ясен файл за сканиране, който може да се преглежда с Caseviewer (3DHISTECH, Унгария) на компютър. Общият брой на разклоненията и дендритната дължина бяха измерени от софтуера на Фиджи (Fiji-win64, NIH, САЩ). Сложността на общите дендритни дървета (пресечни точки) беше оценена чрез анализ на Sholl. Измерване на плътността на гръбначния стълб, 5 неврона бяха избрани от всяко животно.

Пет произволно избрани микроскопични полета в апикалните или базалните дендрити бяха фотографирани от сканиращите файлове. Числата на гръбначния стълб в 40 μms сегменти бяха преброени от наблюдател, който беше сляп за групово разпределение. Резултатите бяха изразени като брой шипове/10 μms сегменти. Данните за броя на дендритните разклонения, дължината и пресичанията, както и плътността на гръбнака от една мишка бяха осреднени, за да отразят нивото на мишката.

Статистически анализ

Не е извършено изчисляване на размера на извадката за всеки експеримент. Определянето на размера на извадката се основаваше най-вече на нашия опит: по-големи размери на извадките бяха използвани за експерименти, тестващи учене и памет, отколкото тези за биохимични изследвания. Всички данни, които бяха събрани, бяха включени в анализите. Липсващите данни включват животните, които отговарят на предварително определени критерии за изключване за тренировка с упражнения, и животните, които са умрели преди планирания период на наблюдение. Броят на животните, които са предоставили данни за анализ за всяко експериментално условие, е посочен в легендите на фигурата.

Резултатите са представени като средни стойности ± SD (данни за нормално разпределение) или медиана ± интерквартилен диапазон (не данни за нормално разпределение) с представяне на индивидуални данни за животни в лентовата графика и средни стойности ± SD в линейните диаграми. Данните от тренировъчните сесии на BarnesMaze бяха анализирани чрез двупосочен повторен анализ на дисперсията (ANOVA), последван от теста на Tukey.

Данните за чревната микробиота бяха анализирани, както е описано в раздела Профилиране на чревната микробиота. Другите данни бяха анализирани чрез еднопосочен ANOVA, последван от теста на Tukey, ако данните са нормално разпределени, чрез еднопосочен ANOVA на ранга, последван от метода на Student-Newman-Keuls на тестора на Tukey, ако данните не бяха нормално разпределени, чрез двупосочен ANOVA , чрез t-тест или тест за ранг сума. Значима разлика беше дефинирана като P < 0.05 въз основа на двустранно тестване на хипотези.

Не са извършени корекции за множество сравнения. Всички статистически анализи бяха извършени със SigmaStat (Systat Software, Inc., Пойнт Ричмънд, Калифорния, САЩ).

ПРЕПРАТКИ

1. Moller JT, Cluitmans P, Rasmussen LS, Houx P, Rasmussen H, Canet J, et al. Дългосрочна постоперативна когнитивна дисфункция при проучване ISPOCD1 при възрастни хора. Изследователи на ISPOCD. Международно изследване на следоперативна когнитивна дисфункция. Lancet.1998;351:857–61.

2. Monk TG, Weldon BC, Garvan CW, Dede DE, van der Aa MT, Heilman KM, et al. Предиктори на когнитивна дисфункция след голяма несърдечна хирургия. Анестезиология. 2008; 108: 18-30.

3. Newman MF, Kirchner JL, Phillips-Bute B, Gaver V, Grocott H, Jones RH, et al. Надлъжна оценка на неврокогнитивната функция след коронарен артериален байпас. N. Engl J Med. 2001; 344: 395-402.

4. Hall M, Schwartzman A, Zhang J, Liu X. Данни за амбулаторна хирургия от болници и центрове за амбулаторна хирургия: 2010 г. Национален доклад за здравна статистика 2017 г.

5. Li Y, Chen D, Wang H, Wang Z, Song F, Li H и др. Интравенозни срещу летливи анестетични ефекти върху следоперативното познание при пациенти в напреднала възраст, подложени на лапароскопска коремна хирургия. Анестезиология. 2021; 134: 381–94.

For more information:1950477648nn@gmail.com