Резюме.Арбутинът е естествено съединение, извлечено от различни растения, включително листа от мечо грозде, което упражнява множество ефекти, включително избелване на кожата и противовъзпалителни и окислителни защитни свойства срещу стреса. Ефектите на арбутина върху остеобластите обаче остават неизвестни. Настоящото проучване имаше за цел да изследва функцията и механизмите на арбутин върху пролиферацията и диференциацията на миши остеобластни прекурсорни клетки MC3T3-E1 in vitro. Пролиферацията на MC3T3‑E1 клетки, третирани с арбутин, беше оценена с помощта на анализ на комплект за броене на клетки-8 и анализ за маркиране с 5-етинил-2'-деоксиуридин. Освен това, клетъчният цикъл и апоптозата бяха изследвани с помощта на анализ на поточна цитометрия. Ефектите на арбутин върху остеобластната диференциация бяха изследвани с помощта на оцветяване с алкална фосфатаза (ALP) и чрез изследване на нивата на експресия на mRNA на колаген тип I 1 верига (COL1A1), костен карбоксиглутаматен протеин (BGLAP) и Sp7 транскрипционен фактор (SP7). За по-нататъшно изследване на молекулярния механизъм, лежащ в основата на функцията на арбутин за насърчаване на остеогенезата, нивата на експресия на мРНК и протеин на свързания с runt транскрипционен фактор 2 (RUNX2) и -катенин бяха анализирани чрез обратна транскрипция-количествена полимеразна верижна реакция и Western blotting. Арбутинът значително насърчава клетъчната пролиферация на MC3T3-E1 и увеличава съотношението на клетките в S-фазата. Лечението с арбутин повишава активността на ALP и нивата на експресия на иРНК на COL1A1, BGLAP и SP7 в клетки MC3T3-E1. Освен това нивата на експресия на протеина и иРНК на RUNX2 и -катенин се повишават значително след лечение с арбутин. Взети заедно, настоящите открития предполагат, че арбутинът е в състояние да насърчи пролиферацията и диференциацията на MC3T3-E1 клетки чрез Wnt/-катенин сигналния път.
Според съответните проучвания,цистанчее широко разпространена билка, известна като „чудотворната билка, която удължава живота“. Основният му компонент ецистанозид, който има различни ефекти катоантиоксидант, противовъзпалително, и насърчаване на имунната функция. Механизмът между цистанче иизбелване на кожатасе крие в антиоксидантния ефект на цистанхевите гликозиди. Меланинът в човешката кожа се произвежда от окислението на тирозин, катализирано оттирозиназа, а окислителната реакция изисква участието на кислород, така че свободните от кислород радикали в тялото се превръщат във важен фактор, влияещ върху производството на меланин. Cistanche съдържа цистанозид, който е антиоксидант и може да намали генерирането на свободни радикали в тялото, като по този начининхибиране на производството на меланин.
За повече информация:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
Въведение
Остеопорозата е здравен и социално-икономически проблем, характеризиращ се с ниска костна маса и влошена костна микроархитектура, което увеличава риска от фрактури на чупливост (1,2). В Европейския съюз (ЕС) степента на разпространение на остеопорозата при лица на възраст над или равна на 50 години се оценява съответно на 6,6 и 22,1 процента за мъжете и жените през 2010 г. От икономическа гледна точка общата цена на остеопорозата за ЕС беше ~37,4 милиарда евро през 2010 г. (3). Поради увеличаването на продължителността на живота и нарастващото застаряване на населението, все по-голям брой хора може да страдат от остеопоротични фрактури в бъдеще (4). Остеопорозата се причинява от дисбаланс между образуването на кост, медиирано от остеобласти, и резорбцията, медиирано от остеокласти (5). Наличните лечения за остеопороза включват лекарства против резорбция (като бифосфонати и денозумаб), калцитонин и естроген. Въпреки това, тези съединения показват определени ограничения; по-специално, те намаляват степента на остеогенен обмен и чрез намаляване на процеса на костно ремоделиране, те причиняват намаляване на образуването на кост (6). Естрогенната терапия не е идеална за дългосрочна терапия на остеопороза, тъй като високите нива на естроген могат да предизвикат маточно кървене, рак на гърдата и сърдечно-съдови заболявания (7). В допълнение, лекарствата против резорбция не са в състояние да възстановят загубената костна структура. Въпреки това, анаболните агенти могат да стимулират образуването на кост и да увеличат костната маса (8). Следователно е важно да се идентифицират нови безопасни и ефективни лекарства, способни да стимулират образуването на кост.
Арбутин (4-хидроксифенил--D-глюкопиранозид; Фиг. 1) е естествено срещащо се производно на хидрохинон (молекулна маса 272 Da), присъстващо в различни видове растения. Високи нива на арбутин са идентифицирани в растения, включително майорана (Origanum majorana, Lamiaceae) и круши (Pyrus communis, Rosaceae) и по-специално семейство Ericaceae, като листата на мечо грозде (Arctostaphylos uva-ursi) (9). Арбутинът проявява различни биологични активности. Например може да се използва арбутин
като средство за избелване на кожата; чрез инхибиране на активността на тирозиназата в меланозомите е установено, че арбутинът насърчава депигментацията (10,11). Предишно проучване показа, че арбутинът може да играе защитна роля от индуцирана от X-облъчване апоптоза чрез намаляване на вътреклетъчните нива на хидроксилни радикали (12). Освен това арбутинът може да инхибира диференциацията на остеокластите чрез намаляване на вътреклетъчните нива на супероксид и чрез регулиране на ядрения фактор на активираните Т клетки 1 (13). Ефектите на арбутина върху функцията на остеобластите обаче остават неизвестни. Следователно, настоящото проучване има за цел да изследва ефектите и механизмите на арбутин върху пролиферацията и диференциацията на миши остеобластни прекурсорни клетки MC3T3-E1.
Сигналната пътека на Wnt може да засегне остеобластите и остеокластите, пряко и косвено, увеличавайки образуването на кост и намалявайки костната резорбция (14). Каноничното Wnt сигнализиране може да регулира пролиферацията, диференциацията и функцията на остеобластите на множество нива (15). При животински модели, намаляване на активността на инхибиторите на Wnt/-катенин сигналния път чрез използване на антитела срещу секретиран frizzled протеин-свързан протеин 1, склеростин и dickkopf WNT инхибитор на сигналния път 1 (DKK1) и инхибитори с малки молекули на гликоген синтаза киназа 3 (GSK-3) може да увеличи костната маса и да намали риска от фрактури (16). Следователно сигналният път на Wnt представлява потенциална терапевтична цел за разработването на нови лекарства за лечение на остеопороза (17). В настоящото проучване са изследвани ефектите на арбутин върху клетъчната пролиферация и диференциация на MC3T3-E1. Освен това беше изследван молекулярният механизъм, лежащ в основата на функцията на арбутин при индуциране на клетъчна диференциация на MC3T3-E1.
Материали и методи
Химикали. Арбутин (чистота, по-голяма или равна на 98 процента) е закупен от Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. (Далиан, Китай), разтворен в диметилсулфоксид (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Дармщат, Германия) и съхраняван в концентрация от 0.5 М. Рекомбинантен човешки DKK1 е закупен от PeproTech, Inc. (Rocky Hill, NJ, САЩ; кат. № 120-30).
Клетъчна култура. Миши калвариални пре-остеобласти MC3T3‑E1 са закупени от Центъра за клетъчни ресурси на Шанхайските институти за биологични науки към Китайската академия на науките (Шанхай, Китай) и са култивирани в -Minimum Essential Medium (-MEM; HyClone; GE Healthcare Life Sciences, Logan, UT, USA), допълнен с 10 процента фетален говежди серум (FBS; Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Израел), 100 µg/ml стрептомицин и 100 U/ml пеницилин (HyClone; GE Healthcare Life Sciences). Клетките се поддържат в инкубатор за клетъчни култури с 5 процента CO2 при 37˚C. Средата се сменя през ден. Клетки с 80 процента сливане се посяват отново в колби с тъканна култура след третиране с 0,25 процента трипсин (HyClone; GE Healthcare Life Sciences) за 1-2 минути при 37 °C. За експерименти с остеобластна диференциация клетките бяха третирани с остеогенна добавка, съдържаща 50 µg/ml L-аскорбинова киселина (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) и 10 mM -глицерофосфат динатриева сол хидрат (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) в продължение на 9 дни при 37 ° С. За механични изследвания клетките MC3T3-E1 бяха предварително третирани с DKK1 (0,5 µg/ml) в продължение на 6 часа при 37˚C и след това бяха третирани с арбутин (100 µM) в продължение на 3 дни при 37˚C.
Клетъчна пролиферация. Анализ на комплект за броене на клетки{{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc., Кумамото, Япония) беше използван за оценка на ефектите на арбутин върху клетъчната пролиферация. Клетките се посяват в 96-плаки с ямки при плътност от 5x103 клетки/ямка за 24 часа при 37˚C. Впоследствие клетките бяха третирани с арбутин при различни концентрации (0, 10, 50 и 100 цМ). След 24, 48 или 72 часа, клетките бяха третирани с 9,1% разтвор на CCK-8, съдържащ 10 µl CCK-8 и 100 µl -MEM за 1-2 часа при 37˚C. Стойността на оптичната плътност на всяка ямка се измерва с помощта на четец на микроплаки (ELx808; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) при дължина на вълната 450 nm. Относителната клетъчна жизнеспособност се изчислява като съотношението между средната абсорбция на пробата и контролата.
Тест за маркиране на 5-етинил-2'-дезоксиуридин (EdU). Ефектът на арбутина върху клетъчната пролиферация беше измерен с помощта на комплект EdU Apollo®567 in vitro Imaging (Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Гуанджоу, Китай). Клетките се инокулират в 96-плака с ямки при плътност 1x103 клетки/ямка и се инкубират в -MEM, съдържащ 10 процента FBS с 0, 10, 50 или 100 µM арбутин. След 72-h инкубиране, EdU се добавя към всяка ямка в концентрация от 50 µM преди допълнителна инкубация за 2 часа при 37˚C. Клетките се промиват два пъти с PBS и се фиксират с PBS, съдържащ 4 процента параформалдехид в продължение на 30 минути при стайна температура (RT). След промиване с глицин (2 mg/ml) и PBS, клетките се пермеабилизират с Triton X-100 (0,5 процента) в продължение на 10 минути при RT. Клетките се инкубират с 1X Apollo оцветяваща реакционна течност при стайна температура за 30 минути на тъмно. Клетъчните ядра бяха насрещно оцветени с 1X Hoechst 33342 за 30 минути при RT. EdU-позитивните клетки се визуализират чрез флуоресцентна микроскопия (увеличение, x200; Eclipse Ti; Nikon Corporation, Токио, Япония) в пет произволно избрани полета.
Анализ на клетъчния цикъл и апоптозата. Клетките MC3T3-E1 се посяват в плочи с шест ямки при плътност 2x105 клетки/ямка. След 24-h инкубация, клетките бяха третирани с арбутин в концентрации от 0, 10, 50 и 100 µM. Клетките се събират след 3 дни при RT и се фиксират със 70 процента етанол в продължение на 12 часа при 4˚C. Клетките се промиват три пъти с PBS и се оцветяват с оцветяващ разтвор на пропидиев йодид (PI) (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Китай) в продължение на 30 минути при 37˚C на тъмно. Съдържанието на ДНК се измерва с помощта на поточен цитометър FACSCalibur (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) със софтуер CellQuest Pro (Версия 5.2; BD Biosciences) и софтуер ModFit LT (Версия 3.0; Verity Software House, Inc., Topsham, ME, САЩ). За анализ на апоптоза клетките, третирани с арбутин, бяха събрани и оцветени с белязан с флуоресцеин изотиоцианат Анексин-V и P I (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) на тъмно в продължение на 15 минути при RT. Скоростта на клетъчна апоптоза беше оценена с помощта на FACSCalibur поточен цитометър (BD Biosciences) със софтуер CellQuest Pro (Версия 5.2; BD Biosciences).
Тест за оцветяване с алкална фосфатаза (ALP). Остеобластите се посяват в {{0}}плаки с ямки при плътност от 5x104 клетки/ямка, инкубирани в -MEM, съдържаща остеогенна добавка и третирани с 0 (контрола), 10, 50 или 100 цМ арбутин. След 9 дни при 37˚C, клетките се промиват три пъти с PBS и се фиксират в 4% параформалдехид при RT за 10 минути. Клетките бяха изплакнати три пъти с дестилирана вода и впоследствие оцветени с помощта на 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат/нитро син тетразолиев хлорид ALP комплект за цветно проявяване (Beyotime Institute of Biotechnology) в продължение на 2 часа в RT. Оцветените клетки се изобразяват с помощта на светлинен микроскоп (увеличение, x40; Eclipse Ti; Nikon Corporation).
Количествена полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT-qPCR). Клетките се посяват в 6-плаки с ямки при плътност от 2x105 клетки/ямка. След третиране с арбутин при различни концентрации в продължение на 3 дни при 37˚C, общата РНК се екстрахира от MC3T3-E1 клетки с помощта на реагент RNAiso Plus (Takara Biotechnology Co., Ltd., Далиан, Китай). Общо 1 µg РНК беше обратно транскрибиран в сДНК, като се използва реактивен комплект PrimeScript RT с gDNA Eraser (Takara Biotechnology Co., Ltd.), съгласно инструкциите на производителя. Реакционните условия са както следва: 42°С за 2 минути, 37°С за 15 минути и 85°С за 5 секунди. qPCR се извършва, като се използват равни количества cDNA от всяка проба в общ обем от 20 µl с ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), като се използва SYBR премикс Ex Taq II (Takara Biotechnology Co., Ltd.). Използвани са следните условия на термоциклиране: Първоначална денатурация при 95°С за 30 секунди, последвана от 40 цикъла от 95°С за 5 секунди и 60°С за 34 секунди. Специфичността на амплификацията се оценява чрез анализ на кривата на топене и -актинът служи като вътрешен контрол. Относителните нива на генна експресия бяха анализирани с помощта на метода 2-ΔΔCq (18). Последователностите на използваните праймери са следните: Runt-свързан транскрипционен фактор 2 (RUNX2), напред 5'-CCAACCGAGTCATTTAAGGCT-3', обратен 5'-GCTCACGTCGCTCATCTTG-3'; колаген тип I 1 верига (COL1A1), напред 5'-GCCTCCCAGAACATC ACCTA‑3', обратен 5'-GCAGGGACTTCTTGAGGTTG-3';костен -карбоксиглутамат протеин (BGLAP), напред 5'-CGCTACCTTGGAGCCTCAGT-3', обратна 5'-AGGCGGTCTTCAAGCCATAC‑3'; Sp7 транскрипционен фактор (SP7), напред5'-AAGGTGTACGGCAAGGCTTC-3', реверс 5'-CGTCAGAGCGAGTGAACCTC‑3'; -катенин, напред 5'-ATGGAGCCGGACAGAAAAGC‑3', реверс 5'-CTTGCCACTCAGGGAAGGA‑3'; -актин, напред 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3', обратен 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'.
Western blot анализ. Клетките MC3T3‑E1 се посяват в 6-плаки с ямки при плътност от 2x105 клетки/ямка. Клетките се третират с арбутин при различни концентрации в продължение на 3 дни и се изплакват три пъти с леденостуден PBS. Общият клетъчен протеин се екстрахира от MC3T3-E1 клетки с помощта на лизисен буфер за радиоимунопреципитационен анализ (Beyotime Institute of Biotechnology), съдържащ 1 mM фенилметилсулфонил флуорид. Протеините се изолират след центрофугиране при 13,800 xg за 15 минути при 4˚C. Концентрацията на протеин се определя количествено с помощта на комплект за анализ на протеин на бицинхонинова киселина (Beyotime Institute of Biotechnology). Равни количества протеин (20-30 µg) във всяка проба се разделят с 10 процента SDS-PAGE за 2 часа при постоянно напрежение (110 V) и се прехвърлят върху мембрана от поливинилиден флуорид (PVDF) (EMD Millipore, Billerica, Масачузетс, САЩ). Мембраните бяха блокирани в TBS плюс Tween-20 (TBST; 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7,5 и 0,1 процента Tween-20), съдържащ 5 процента обезмаслено мляко при стайна температура за 2 часа и след това инкубирани за една нощ при 4˚C с подходящи първични антитела. Използваните антитела бяха следните: заешки моноклонален анти- -катенин (1:5,000; кат. № ab32572; Abcam, Cambridge, MA, САЩ), заешки поликлонален анти-RUNX2 (1: 1,000; кат. № ab23981; Abcam) и миши поликлонален анти- -актин (1:1,000; кат. № AF0003; Beyotime Институт по биотехнологии). Впоследствие мембраните се промиват три пъти с TBST и PVDF мембраните се инкубират с пероксидаза от хрян (HRP)-конюгиран кози анти-заешки имуноглобулин G (IgG; 1:10, 000; кат. № ZB{{ 52}}; OriGene Technologies, Inc., Пекин, Китай) или HRP-конюгиран кози анти-миши IgG (1:10 000; кат. № ZB-2305; OriGene Technologies, Inc.) при RT за 2 часа . Протеините се визуализират с помощта на подобрени хемилуминесцентни реагенти (Thermo Fisher Scientific, Inc.) и се откриват със система за хемилуминесцентно откриване (Amersham Imager 600; GE Healthcare Life). Протеините бяха количествено определени с помощта на софтуер ImageJ (версия 1.52; Национални институти по здравеопазване, Bethesda, MD, САЩ). След нормализиране, относителните нива на протеинова експресия се изчисляват с -актин като вътрешна контрола.
Статистически анализ. Всички експерименти се повтарят независимо най-малко три пъти. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, Калифорния, САЩ). Данните са представени като средно ± стандартно отклонение и значителните разлики са анализирани чрез еднопосочен анализ на дисперсията, съчетан с post hoc теста на Dunnett. П<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.
Резултати
Арбутинът насърчава клетъчната пролиферация на MC3T3‑E1. Ефектите на арбутина върху клетъчната пролиферация на MC3T3‑E1 бяха изследвани с помощта на CCK-8 анализ. Арбутинът се прилага в различни концентрации (0, 10, 50 и 100 µM) за 24, 48 и 72 часа и се извършва анализ на CCK-8 (Фиг. 2A). След 24 часа не са установени статистически разлики в пролиферацията на остеобласти в сравнение с нетретираните контролни клетки. Въпреки това, клетъчната пролиферация на MC3T3-E1 беше значително увеличена след лечение с арбутин при 100 µM след 48 и 72 часа. Тестът за маркиране с EdU беше извършен след 72 часа и резултатите показаха, че процентът на EdU-позитивните MC3T3-E1 клетки, третирани с арбутин в концентрация от 50 и 100 µM, е значително повишен в сравнение с нетретираната контрола (фиг. 2B и C) .
Арбутинът ускорява прогресията на клетъчния цикъл. Ефектите на арбутин върху прогресията на клетъчния цикъл бяха оценени с помощта на анализ на клетъчния цикъл (фиг. 3). Третирането с арбутин при 50 и 100 µM доведе до увеличаване на процента на клетките в S-фаза (фиг. 3A и C), а 100 µM арбутин доведе до намаляване на процента на клетките в G1-фаза ( Фиг. 3D). Не са установени статистически значими разлики в групата с 10 µM в сравнение с контролната група. Ефектите на арбутин върху апоптозата на MC3T3-E1 също бяха оценени с помощта на поточна цитометрия (фиг. 3B и E). Скоростта на апоптоза не се променя значително след лечение с арбутин при 10, 50 и 100 µM в сравнение с контролата.
Ефекти на арбутин върху активността на ALP. Ефектите на арбутин върху диференциацията на остеобластите бяха анализирани чрез оцветяване с ALP. След 9 дни лечението с различни концентрации на арбутин (0, 10, 50 или 100 µM) значително повишава активността на ALP в сравнение с контролната група (Фиг. 4A). Настоящите открития предполагат, че арбутинът може да увеличи активността на ALP в клетките MC3T3-E1.
Ефекти на арбутин върху нивата на експресия на иРНК на COL1A1, ‑катенин, RUNX2, BGLAP и SP7. Нивата на експресия на иРНК на COL1A1, -catenin, RUNX2, BGLAP и SP7 бяха оценени в клетки MC3T3‑E1 с помощта на RT-qPCR след третиране с арбутин при различни концентрации (0, 10, 50 или 100 µM) за 3 дни. Нивата на експресия на COL1A1 и -катенин бяха повишени в остеобласти, третирани с 10, 50 и 100 µM арбутин в сравнение с нетретираните клетки (Фиг. 4B и C). Нивата на експресия на RUNX2, BGLAP и SP7 бяха значително повишени след третиране с арбутин при 50 и 100 µM (фиг. 4D-F).
Ефекти на арбутин върху нивата на протеинова експресия на -катенин и RUNX2. За да се изследват основните механизми на индуцирана от арбутин остеобластна диференциация, нивата на протеинова експресия на RUNX2 и -catenin бяха изследвани в MC3T3-E1 клетки чрез Western blotting (Фиг. 5A и B). Третирането с арбутин при 100 µM значително повишава нивата на протеинова експресия на -катенин и RUNX2 в остеобластите в сравнение с контролите (фиг. 5C и D, съответно). Настоящите резултати предполагат, че арбутинът може да повлияе диференциацията на остеобластите чрез регулиране на нивата на протеинова експресия на -катенин и RUNX2. За да се изследва дали арбутинът стимулира остеобластната диференциация чрез Wnt/-catenin сигнален път, MC3T3-E1 клетките бяха третирани с 0,5 µg/ml DKK1 в продължение на 6 часа преди третиране със 100 µM арбутин.
DKK1 значително инхибира индуцираната от арбутин RUNX2 протеинова експресия (фиг. 5E). Настоящите резултати предполагат, че арбутинът може да повлияе диференциацията на остеобластите чрез сигналния път на Wnt/-catenin.
Дискусия
Остеопорозата може да доведе до сериозни фрактури и увреждания и представлява проблем, свързан с възрастта в световен мащаб (19). Натрупващите се доказателства показват, че дисбалансът между остеокластите и остеобластите при образуването и резорбцията на костите може да доведе до остеопороза (20). Трябва да се отбележи, че образуването на кост зависи от пролиферацията и диференциацията на остеобластите (21, 22).
Множество налични лекарства, използвани за лечение на остеопороза, са антирезорбтивни лекарства (23); обаче, тези лечения не са в състояние да обърнат костната загуба (24). Анаболните агенти, които стимулират образуването на кост, могат да възстановят силно увредената микроструктура на скелета и загубата на костна маса (24). Терипаратид е един анаболен агент, за който е доказано, че стимулира образуването на кости, а клиничните проучвания показват, че лечението с терипаратид намалява риска от нови вертебрални фрактури и повишава костната минерална плътност в бедрото, лумбалния гръбнак и шийката на бедрената кост (25). Трябва да се отбележи, че терипаратид е скъпо лечение. Следователно е важно да се разработят нови лекарства, които могат ефективно да насърчават образуването на кост.
Арбутинът е цитопротективен агент и не проявява значителни цитотоксични ефекти при високи концентрации (26). Въпреки че концентрацията на арбутин в кръвта не е ясна (13), арбутинът се използва като антимикробно лекарство за урината и се счита за безопасен перорален агент (27,28). Предишни проучвания показват, че арбутинът може да проявява множество дейности, включително избелване на кожата (10, 11), противовъзпалително (29), противораково (30) и потискане на диференциацията на остеокластите (13). Необходими са обаче допълнителни проучвания за изследване на ефектите на арбутин върху остеобластите и неговия потенциал да се използва като ново съединение за лечение на остеопороза. Ето защо, настоящото проучване изследва ефектите на арбутин върху пролиферацията и диференциацията на MCET3-E1 клетки и механизмите, които са в основата на функцията на арбутин in vitro.
Образуването на кост е свързано с броя на остеобластите и активността на единичните остеобласти (31). Броят на остеобластите може да бъде увеличен чрез насърчаване на предостеобластна репликация или диференциация или чрез намаляване на клетъчната смърт на зрели остеобласти (32). В настоящото изследване арбутинът повишава пролиферацията на MC3T3-E1 клетки, без да повлиява скоростта на апоптоза. В допълнение, арбутинът повишава прогресията на клетъчния цикъл чрез изместване на клетките от G1-фаза към S-фаза. Тези резултати предполагат, че арбутинът може да индуцира остеобластна пролиферация.
ALP е ранен маркер за остеогенна диференциация (33). ALP се свързва с калцификацията на скелета по време на образуването на кост (34). В настоящото проучване резултатите от оцветяването на ALP предполагат, че остеобластите, третирани с арбутин при 10, 50 и 100 µM и с остеогенна добавка в продължение на 9 дни, показват повишена активност на ALP, което предполага, че арбутинът може да насърчи ранната диференциация на остеобластите.
Доказано е, че остеогенезата се регулира от различни транскрипционни фактори, включително RUNX2 и SP7, и множество специфични за костите матрични протеини, включително ALP,BGLAP и COL1A1 (35). RUNX2 и SP7 са важнитранскрипционни фактори, участващи в диференциацията на остеобластитепо време на образуването на кост (36). COL1A1 е извънклетъченматричен протеин, който насърчава костната регенерация и остеобластна диференциация (37). BGLAP е неколагеновпротеин на костната матрица, който регулира костния обмен и косттаминерализация (38). Настоящото проучване установи, че арбутинможе да индуцира нивата на експресия на иРНК от важно значениеостеогенни регулатори, включително RUNX2, BGLAP, SP7 иCOL1A1. Освен това нивото на експресия на -катенин бешеувеличена. Тези резултати предполагат, че арбутинът може да насърчиостеобластна диференциация чрез механизъм, включващWnt/ -катенинова сигнализация.
Wnt сигнализиращият път влияе върху образуването на кост по време на развитието и костното ремоделиране по време на обновяването на тъканите (39). Каноничният Wnt сигнален път бешеидентифицирани като инициирани от Wnt лигандно сигнализиране в клеткатаповърхност чрез липопротеин с ниска плътност, свързан с рецепторпротеин 5 или 6 (Lrp5/6) и седем проходна трансмембранаНакъдрен рецептор (40). Взаимодействието между Wnt лигандии техният рецептор може да инхибира GSK3- в цитоплазмата,което води до освобождаване на -катенин, транскрипционната медатор на канонично Wnt сигнализиране. След освобождаването, -катенинможе да влезе в ядрото, като по този начин контролира експресиятанива на неговите целеви гени (41). RUNX2 принадлежи на Runtдомейн генно семейство и е транскрипционен фактор, участващ востеобластна диференциация (42). RUNX2 служи важенроля в координирането на множество сигнални пътища по време наостеобластна диференциация (43). Демон от предишно проучванезаяви, че каноничното Wnt сигнализиране може директно да регулираRUNX2. По-конкретно, на -катенин/HNF1 хомеобокс Aкомплекс може да активира нивото на експресия на RUNX2,като по този начин насърчава образуването на кост (44). DKK1 е мощенинхибитор на Wnt/ -катенинов каноничен път, чрез свързванекъм Lrp5/6 (45,46). Резултатите от настоящото изследване предполагатче лечението с арбутин значително повишава протеинанива на експресия на RUNX2 и -катенин в MC3T3-E1клетки и DKK1 значително намалява протеиновата експресияниво на RUNX2. Настоящите резултати предполагат товаарбутинът може да насърчи клетъчната диференциация на MC3T3-E1 чрез каноничния Wnt/-катенинов път.
Колективно, доколкото е известно на авторите, настоящото изследване е първото, което показва, че арбутинът може да стимулира пролиферацията и диференциацията на MC3T3-E1 клетки чрез Wnt/-catenin сигнален път. Следователно арбутинът може да представлява нов потенциален кандидат за лечение на остеопороза. Необходими са обаче допълнителни проучвания за идентифициране на специфичната роля на Wnt/-катенин сигналния път в индуцираната от арбутин остеогенеза, включително фосфорилирането на -катенин при Ser675 (47); допълнителна информация относно ролята на Wnt/-catenin сигнализиране може да бъде постигната с помощта на Wnt агонисти. В бъдеще по-нататъшни проучвания могат да изследват способността на арбутина да насърчава образуването на кост in vivo.
Благодарности
Не е приложимо.
Финансиране
Настоящата работа беше подкрепена от Основната програма на Националната фондация за природни науки на Китай (грант № 81370981) и Изключителния научен фонд на болница Shengjing.
Наличие на данни и материали
Наборите от данни, използвани и/или анализирани по време на настоящото проучване, са достъпни от съответния автор при разумно искане.
Авторски принос
QF, XM и LiY замислиха и проектираха експериментите. XM извърши експериментите и написа ръкописа. SL, LiY, LeY и ML анализираха данните и критично ревизираха ръкописа. QF ръководи всички изследвания и ревизира ръкописа. Всички автори прочетоха и одобриха окончателния ръкопис.
Етично одобрение и съгласие за участие
Не е приложимо.
Съгласие на пациента за публикуване
Не е приложимо.
Конкуриращи се интереси
Авторите декларират, че нямат конкурентни интереси.
Препратки
1. Das S и Crockett JC: Остеопороза - текущ поглед върху фармакологичната превенция и лечение. Drug Des Devel The 7435-448.2013.
2. Rachner TD, Khosla S и Hofbauer LC: Остеопороза: сега и бъдещето. Lancet 377: 1276-1287. 2011 г.
3.Hernlund E, Svedbom A, Ivergard M, Compston J, Cooper CStenmark JMcCloskey EVJOnsson B и Kanis JA: Остеопороза в Европейския съюз: Медицински мениджмънт, епидемиология и икономическо бреме. Доклад, изготвен в сътрудничество с международната фондация за остеопороза (IOF) и Европейската федерация на асоциациите на фармацевтичната индустрия (EFPIA). Arch Osteoporos 8: 136.2013.
4. Cauley JA: Въздействие на остеопорозата върху общественото здраве. J Gerontol ABiol Sci Med Sci 68: 1243-1251.2013.
5. Manolagas SC и Jilka RL: Костен мозък, цитокини и костно ремоделиране. Нововъзникващи прозрения в патофизиологията на остеопорозата. N Engl J Med 332: 305-311. 1995 г.
6. Baron R и Hesse E: Актуална информация за костните анаболи при лечение на остеопороза: Обосновка, текущо състояние и перспективи. J ClinEndocrinol Metab 97: 311-325.2012.
7.TangDZ, Hou WZhou Q, ZhangM, HolzJ, SheuTJ, LiTF ChengSDShi O. Harris SE.et al: Osthole стимулира диференциацията на остеобластите и образуването на кост чрез активиране на бета-катенин-BMP сигнализация Bone Miner Res 25: 1234-1245 . 2010 г.
8. Canalis E: Актуализация на новите анаболни терапии за остеопороза. J Clin Endocrinol Metab 95: 1496-1504.2010.
9. Lamien-Meda A, Lukas B, Schmiderer C, Franz C и Novak J: Валидиране на количествен анализ на арбутин с помощта на газова хроматография в екстракти от Origanum majorana и Arctostaphylos uva-ursi. Phytochem Anal 20: 416-420.2009 .
10.Lim YJ, Lee EH, Kang TH, Ha SK, Oh MS, Kim SM, Yoon TJ.Kang C, Park JH и Kim SY: Инхибиторни ефекти на арбутин върху биосинтезата на меланин на алфа-меланоцит-стимулиращ хормон индуцирана хиперпигментация в култивирани кафеникави кожни тъкани на морско свинче. Arch Pharm Res 32: 367-373.2009.
11. Маеда К и Фукуда М: Арбутин: Механизъм на неговото депигментиращо действие в човешка меланоцитна култура. J Pharmacol ExpTher 276: 765-769.1996.
12. Wu LH Li P Zhao OL. Piao JL Jiao YF Kadowaki M и Kondo T: Арбутин. вътреклетъчен улавяне на хидроксилни радикали защитава индуцирана от радиация апоптоза в човешки лимфом U937 клетки. Апоптоза 19: 1654-1663.2014
13. Omori A Yoshimura Y. Deyama Y и Suzuki K: Rosmarinicacid и arbutin потискат диференциацията на остеокластите чрез инхибиране на супероксида и NFATel низходящата регулация в RAW 264.7 клетки Biomed Rep 3: 483-490.2015
14. Baron R и Kneissel M: WNT сигнализиране в костната хомеостаза и заболяване: От човешки мутации до лечения. Nat Med l9.179-197.2013
15. Baron R и Rawadi G: Насочване към пътя на Wnt/бета-катенин за регулиране на образуването на кости в скелета на възрастните. Ендокринология 148: 2635-2643.2007.
16. Hoeppner LH Secreto FJ и Westendorf JJ: Wnt сигнализиране като терапевтична цел за костни заболявания. Експертно мнение TherTargets 13: 485-496.2009.
17. Williams BO и Insogna KL: Къде отиде Wnts: Експлодиращото поле на Lrp5 и Lrp6 сигнализиране в костите. J Bone Miner Res 24:171-178.2009
18. Livak KJ и Schmittgen TD: Анализ на данните за относителната генна експресия с помощта на количествена PCR в реално време и метода 2(-Delta DeltaC(T) Методи 25:402-408.2001.
19.Lin X. Xiong D. Peng YO. Шенг ЗФ. Wu XY Wu XP Wu FYuan LO и Liao EY: Епидемиология и лечение на остео. порозата в Китайската народна република: текущи перспективи.Clin Interv Aging 10: 1017-1033.2015.
20. Manolagas SC: Раждане и смърт на костни клетки: Основни регулаторни механизми и последици за патогенезата и лечението на остеопороза. Endocr Rev 21: 115-137.2000.
21.Liu S. Fang T. Yang L. Chen Z. Mu S и Fu O: Гастродин предпазва остеобластите MC3T3-El от индуцирана от дексаметазон клетъчна дисфункция и насърчава образуването на кост чрез индукция на NRF2 сигналния път. Int J Mol Med 41: 2059-2069.2018.
22. Yun HM Park KR. Куанг TH Oh H. Hong JT. Kim YC и Kim EC: 2.4.5-Trimethox yldalbergiquinol насърчава остеобластната диференциация и минерализация чрез BMP и Wnt/B-catenin пътя. Клетъчна смърт Dis 6: el819. 2015 г.
23. Cosman F Nieves JW и Dempster DW: Treatment sequence1718.22.matters: Anabolic and antiresorptive therapy for osteoporosis Bone Miner Res 32: 198-202.2017
24. Uihlein AV и Leder BZ: Анаболни терапии за остеопороза. Endocrinol Metab Clin North Am 41: 507-525.2012
25. Nakamura T Sugimoto T. Nakano T. Kishimoto H. Ito MFukunaga MHaginoH Sone T. Yoshikawa Nishizawa Y.eralRandomized Teriparatide (човешки паратироиден хормон (PTH1-341 Едноседмично изследване на ефикасността (TOWER) изпитване за изследване на намаляването на нови вертебрални фрактури при пациенти с първична остеопороза и висок риск от фрактури J Clin Endocrinoetab 97: 3097-3106.2012
26. Jurica K BrCic Karabonji l, Mikolic A, Milcjkowic-Opsenica DBenkovic V и Kopjar N: In Vitro оценка на безопасността на екстракт от водни листа на ягодовото дърво (Arbrrfus redo L) и арбутин човешки периферни кръвни лимфоцити. Цитотехнология 70: 1261-1278.2018
27. Schindler G. Patzak U Brinkhaus B. спечели Niecieck A. Wittig JKrihmer N Glockl и Veit M: Urinary excretion and Metabo. списък на арбутин след перорално приложение на екстракт от Arctosfaphylos reversi под формата на филмирани таблетки и воден разтвор при здрави хора. J Clin Pharmacol 42: 920-927.2002.
28. Genowese C Davinelli S. Mangano K, Tempera G, Nicolosi D.Corsello S.Vergalito F Tartaglia E. Scapagnini G и Di Marco R: Ефекти от нова комбинация от растителни екстракти плюс d-маноза за управление на неусложнени рецидивиращи пикочни пътища инфекции. J Chemother 30: 107-114. 2018 г
29. Lee HJ и Kim KW: Противовъзпалителни ефекти на арбутин в липополизахарид-стимулирани BV2 микроглиални клетки. InfiammRes 61: 817-825.2012.
30. Jiang L. Wang D Zhang Y. Li J. Wu Z. Wang Z и Wang D Изследване на проапоптозните ефекти на арбутин и неговото ацетилирано производно върху миши меланомни клетки. Int J Mol Med 41:1048-1054.2018
31. Marie PJ и Kassem M: Остеобласти при остеопороза: Pastemerging и бъдещи анаболни цели. Eur J Endocrinol 165:1-10.2017
32. Canalis E: Управление на ендокринни заболявания: Нови анаболни лечения за остеопороза. Eur J Endocrinol 178: R33-R44. 2018 г
33. Weinreb M Shinar D и Rodan GA: Различен модел на експресия на алкална фосфатаза, остеопонтин и остеокалцин в развиващата се кост на плъх, визуализирана чрез in situ хибридизация. J BoneMiner Res 5: 831-842.1990.
34. Ким YJ. Lee MH Wozney JM Cho JY и Ryoo HM: Индуцираната от костен морфогенетичен протеин-2-експресия на алкална фосфатаза се стимулира от Dlxs и се потиска от Msx2. J BioChemm 279: 50773-50780.2004
35. An JYang H Zhang O. Liu C. Zhao J. Zhang L и Chen B. Естествени продукти за лечение на остеопороза: Ефектите и механизмите за насърчаване на живота, медииран от остеобласти, Sci 147: 46-58.2016
36. Kobavashi T и Kronenbere H: Мини преглед: Транскрипционна регулация в развитието на костите. Ендокринология 146: 1012-1017.2005.
37. Cathev и Reddy ABaltordal.oiczThrombospondin-2 улеснява сглобяването на матрица, богата на колаген тип-I, в стромални клетки на костен мозък, подложени на остеобластна различна станция. Connect Tissue Res 54: 275-782.2013
38. Neve A. Corrado A и Cantatore FP: Остеокалцин: Ефекти върху скелета и извън скелета J Cell Physiol 228: 1149-1153.2013
39. Wang Y.Li YP Paulson C, Shao Jz, Zhang X Wu M и Chen отидоха и Wnt сигналния път в развитието на костите и заболяванията. Front Biosci (Landmark Ed) 19: 379-407.2014
40.MacDonald BT. Tamai K и He X: Wnt/бета-катенин сигнализиращи компоненти. механизми. и болести. Dev Cel1 17: 9-26. 2009 г
41. Kramer l.Halleux C, Keller H, Pegurri M, Gooi JHWeber PB. Фън ДЖО. Bonewald LF и Kneissel M: OsteocytWnt/beta-catenin сигнализиране е необходимо за нормална костна хомеостаза. Mo Cel1 Biol 30: 3071-3085.2010
42. Ducy P Schinke T и Karsenty G: Остеобластът: сложен фибробласт под централно наблюдение. Наука 289:1501-1504.2000
43. Franceschi RI и Xiao G: Регулиране на остеобласт-специфичния транскрипционен фактор. RUNX2: Отзивчивост към множество пътища на сигнална трансдукция. J Cell Biochem 88: 446-454.2003
44. Gaur T, Lengner Cl, Howhannisyan H, Bhat RA, Bodine PVKomm BS. Javed A. van Wijnen AJ. Щайн JL. Stein GS Lian JB: Каноничното WNT сигнализиране насърчава остеогенезата, директно стимулирайки Runx2 генната експресия. J Biol Chem 280:33132-33140.2005
45. Kawano Y и Kypta R: Секретирани антагонисти на Wnt сигналния път. J Cel1 Sci 116: 2627-2634.2003
46. Daoussis D и Andonopoulos AP: Нововъзникващата роля на Dickkopf-l в биологията на костите: това ли е основният превключвател, контролиращ ремоделирането на костите и ставите? Semin Arthritis Rheum 41: 170-177.2011
47. Taurin S.Sandbo N. Qin Y. Browning D и Dulin NO: Фосфорилиране на бета-катенин от циклична AMP-зависима протеин киназа. J Biol Chem 281: 9971-9976.2006
За повече информация: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
