Аристолоховата киселина предизвиква бъбречна фиброза и стареене при мишки
Mar 23, 2022
Резюме:Бъбреците са един от най-податливите органи на свързани с възрастта увреждания. Като цяло, бъбречното стареене е придружено от бъбречна фиброза, която е последният общ път на хроничнобъбречни заболявания. Аристолохинова киселина (AA), нефротоксичен агент, причинява АА нефропатия (AAN), която се характеризира с прогресивна бъбречна фиброза и функционален спад. Въпреки че бъбречната фиброза е свързана с бъбречното стареене, остава неясно дали AA предизвиква бъбречно стареене. Целта на настоящото изследване е да се изследва потенциалната употреба на AAN като модел на бъбречно стареене. Тук изследвахме свързаните със стареенето фактори в AAN модели чрез хронично прилагане на AA на C57BL/6 мишки. В сравнение с контролите, групата на АА демонстрира стареенебъбрекфенотипове, като бъбречна атрофия, бъбречен функционален спад и тубулоинтерстициална фиброза. Освен това, AA насърчава клетъчното стареене специално вбъбреции повишена експресия на бъбречна p16 mRNA и свързана със стареенето -галактозидазна активност. Освен това, третирани с АА мишки показват проксимални тубулни митохондриални аномалии, както и натрупване на реактивни кислородни видове. Klotho, ген против стареене, също беше значително намален вбъбрецина мишки, третирани с АА. Взети заедно, резултатите от настоящото изследване показват, че АА променя факторите, свързани със стареенето, и че бъбречната фиброза е тясно свързана с бъбречното стареене.
Ключови думи:хронично бъбречно заболяване; бъбречна фиброза; аристолохинова киселина; стареене; клетъчно стареене
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНО/БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ
ВъведениеС непрекъснато нарастващата продължителност на живота при хората все повече хора страдат от увреждания, свързани с възрастта.Бъбрециобикновено са засегнати от свързано с възрастта увреждане на тъканите и честотата на хроничнизаболяване на бъбрецитенараства с възрастта [1]. Бъбречното стареене ускорява цялостното стареене, което води до по-кратък живот. Следователно е необходимо изследване на бъбречното стареене, въпреки че не са напълно разработени подходящи животински модели. Стареенето на бъбреците е придружено от различни патологични промени, включително бъбречна атрофия, гломерулосклероза и тубулоинтерстициална фиброза [2]. Бъбречната тубулоинтерстициална фиброза е последният общ път при повечето форми на прогресивно бъбречно заболяване, което предполага, че бъбречната фиброза е тясно свързана с възрасттабъбрек. При изследването на стареенето мишките са надежден инструмент поради тяхната генетична близост до хората, способността генетично да манипулират техния геном и факта, че те представят подобни свързани със стареенето фенотипове на хората по време на техния живот [3]. Надлъжните наблюдения с помощта на инбредни мишки са идеални като модел на стареене, въпреки че отнема много време да се следват мишките през целия им живот. Освен това има няколко генетично модифицирани модела на стареене при мишки. Мишката с дефицит на Klotho е модел на преждевременно стареене, който се използва в изследванията на стареенето. Въпреки това, в този модел, бъбречната функция не е засегната и няколко органа, различни от бъбреците, са увредени [4]. Следователно този модел на мишка може да е неподходящ за изследване на бъбречното стареене.Прилагането на аристолохинова киселина (AA) причинява специфичен тип бъбречно увреждане, известно като AA нефропатия (AAN), което се характеризира с екстензивна интерстициална фиброза [5,6]. АА е токсичен за бъбречния тубуларен епител, тъй като насърчава образуването на ДНК адукти в бъбречните тъкани [7]. Малко вероятно е АА да засегне органи, различни от пикочната система и може да бъде полезна за оценка набъбрек- специфични промени. Следователно АА обикновено се използва за установяване на модели на бъбречна фиброза при мишки [8,9]. Въпреки това, остава неясно дали промените, предизвикани от AA, са свързани със стареенето вбъбреци. В това проучване изследвахме свързани с възрастта фенотипове и молекулярни фактори в AAN при мишки
Резултати 2.1. Прилагането на AA предизвиква значителна загуба на тегло, бъбречна атрофия и намаляване на бъбречната функцияИзходното телесно тегло (BW) и систоличното кръвно налягане (BP) са идентични между групите с контролен носител и групата AA. BW в контролната група с носител се увеличава постоянно в продължение на 8 седмици. Въпреки това, наддаването на тегло е инхибирано от приложението на AA и групата на AA има значително по-ниско тегло на 4 и 8 седмици след началото на приложението на AA (Фигура 1A). Няма значителна разлика в систолното BP или сърдечната честота между групите с контролен носител и AA (Фигура 1B,C). Съотношението сърдечно тегло/BW не показва разлика между групите на 8 седмици след началото на приложението на AA (Фигура 1D), докатобъбрексъотношението тегло/тегло е значително по-ниско в групата на АА на 8-та седмица след началото на приложението на АА (Фигура 1E). След това изследвахме бъбречната функция в групите с контролен носител и АА. Плазмените концентрации на креатинин и уреен азот (UN) са значително по-високи в групата на AA, отколкото в контролната група с носител на 8 седмици след началото на приложението на AA. Освен това, лечението с AA значително намалява креатининовия клирънс в сравнение с контролната група с носител на 8 седмици след началото на приложението на AA (Фигура 1F–H).
2.2. Приложението на AA индуцира открита тубулоинтерстициална фиброза и значително повишаване на свързаната с фиброза генна експресия в бъбрецитеХистологичното изследване с помощта на оцветяване с периодична киселина-Шиф (PAS) разкрива, че гломерулната област е значително намалена в групата на АА в сравнение с контролната група с носител (Фигура 2А). Обширна тубулоинтерстициална фиброза, оценена с помощта на оцветяване с трихром на Masson (MT), се наблюдава в групата на АА (Фигура 2B), както и при регулиране на нивата на иРНК на гени, свързани с бъбречна фиброза, колаген I и III и трансформиращ растежен фактор ( TGF)-(Фигура 2C–E).
2.3.Администрирането на AA ускорява клетъчното стареене, митохондриалната дисфункция и натрупването на реакционни кислородни/генни видове (ROS) в бъбрецитеЗа да оценим клетъчното стареене, ние изследвахме бъбречната mRNA експресия на p53, p21, p16 и глутаминаза (GLS). Групата AA демонстрира значително по-високи нива на mRNA на тези свързани със стареенето гени вбъбреци(Фигура 3A-D). Освен това, свързаната със стареенето -галактозидаза(SA- -gal) интензивност на оцветяване вбъбрецие увеличен в групата на АА и почти липсва в групата с контролен носител (Фигура 3Е). В групата на АА електронната микроскопия разкрива изчезването на митохондриални кристи, митохондриална фрагментация, цитоплазмена вакуолизация и автолизозоми в проксималните тубулни клетки, едновременно с понижаване на BCL2/аденовирус E1B 19-kDa взаимодействащ протеин 3 (Bnip3), ген, свързан с митохондриите (Фигура 3FG). Бъбречна mRNA експресия на Nox2. компонент на никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидаза, е значително увеличен в групата на АА в сравнение с контролната група с носител (Фигура 3H). Освен това, Western blot анализът разкрива, че бъбречното 4-хидрокси-2-номинално (4-HNE) ниво е значително повишено в групата на AA (Фигура 3I). Тези резултати показват, че прилагането на AA предизвиква клетъчно стареене, митохондриална дисфункция и натрупване на ROS вбъбреци.
2.4. AA Намалена бъбречна експресия на Klotho протеинИзследвахме бъбречната експресия на протеини против стареене в групите за контрол на носител и АА. Експресията на Klotho беше значително намалена в групата на АА в сравнение с контролната група с носител (Фигура 4А), докато бъбречните експресии на никотинамид фосфорибозилтрансфераза (NAMPT) и сиртуин1 (SIRT1) бяха сходни между групите (Фигура 4B,C).
3. ДискусияДоколкото ни е известно, настоящото изследване е първото, което се фокусира върху оценката на свързаните с бъбречното стареене промени в AAN, използвайки маркери за стареене, като p16 и SA- -gal активност. Лечението с АА насърчава бъбречна атрофия, тубулоинтерстициална фиброза и бъбречен функционален спад, които са придружени от регулиране на бъбречната p16 mRNA и SA- -gal-положително оцветяване. Освен това, групата на АА демонстрира характеристики на механизми, свързани с бъбречното стареене, като митохондриални аномалии, повишен оксидативен стрес и понижаване на гена против стареене, Klotho. Взети заедно, нашите наблюдения показват, че хроничното приложение на АА частично имитира стареенето на бъбреците.
Клетъчното стареене е постоянно спиране на клетъчната пролиферация в отговор на различни стресори, като увреждане на ДНК, и допринася за стареенето и свързаните със стареенето заболявания. Експресията на p16, инхибитор на циклин-зависима киназа, е свързана със стареенето в различни органи, включително бъбреците. Ограничаването на калориите увеличава продължителността на живота чрез инхибиране на експресията на pl6 [10]. В допълнение, елиминирането на p16-експресиращи стареещи клетки в INK-ATTAC мишки чрез инжектиране на AP20187, FK506-свързващ протеинов димеризатор [11], причинява отслабване на фенотипове на бъбречно стареене, като гломерулна склероза и бъбречна функционален спад. Следователно p16 е един от най-важните фактори, свързани със стареенето. Стареещите клетки могат да бъдат открити с помощта на SA- -gal оцветяване, което демонстрира повишена -галактозидазна активност при рН 6,0 [12] и е широко използван биомаркер за стареещи и остарели клетки. Бъбречната mRNA експресия на pl16 се увеличава при стар плъхбъбреции е придружено от повишена активност на SA{0}}gal в бъбречния епител [13I. В настоящото проучване ние демонстрирахме повишена бъбречна експресия на p16 mRNA и SA- -gal-оцветяване, което показва, че AA индуцира бъбречно стареене. Наскоро беше съобщено, че GLS е от съществено значение за оцеляването на стареещите клетки чрез засилена глутаминолиза и неутрализация на вътреклетъчното рН [14]. Показано е, че инхибирането на GLS-зависимата глутаминолиза при възрастни мишки елиминира стареещите клетки и подобрява свързаната с възрастта органна дисфункция. В настоящото изследване, регулирането на бъбречната GLS иРНК показва бъбречно натрупване на стареещи клетки в групата. По този начин хроничното приложение на АА причинява клетъчно стареене в бъбреците.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ФУНКЦИЯ
В допълнение към клетъчното стареене, митохондриалната дисфункция е основен механизъм в основата на свързаното с възрастта тъканно увреждане и е придружено от натрупване на ROS [15,16]. Митохондриалната дисфункция задвижва и поддържа клетъчното стареене [17], докато клетъчното стареене допринася директно за митохондриалната дисфункция [18]. Bnip3, разположен предимно във външната митохондриална мембрана, може да играе роля в регулирането на митофагията в култивирани бъбречни проксимални тубулни клетки в отговор на оксидативен стрес и хипоксия. При стари мишки ограничаването на калориите увеличава аутофагията в тубулните клетки чрез регулиране нагоре на Bnip3 и подобрява индуцираната от възрастта дегенерация на бъбречната функция [19]. В настоящото изследване електронната микроскопия разкрива характеристиките на митохондриалните аномалии, които могат да бъдат повлияни от намалена бъбречна експресия на Bnip3 или клетъчно стареене. Митохондриите са основният вътреклетъчен източник на ROS. За да оценим ефектите от митохондриалните аномалии върху бъбречните ROS, ние изследвахме бъбречното натрупване на 4-HINE и демонстрирахме индуцирано от AA натрупване на ROS вбъбреци.NADPH оксидазите са основен източник на ROS. По време на острата фаза на AAN при мишки, бъбречната иРНК експресия на Nox2 беше повишена и наличността на азотен оксид беше намалена, което доведе до продължителна хипоксия и исхемия [20. При стар плъхбъбреци, натрупването на ROS е придружено от повишена експресия на Nox2 [21]. Тези открития предполагат, че АА може да индуцира свързани с възрастта фенотипове чрез натрупване на ROS, причинено от митохондриална дисфункция и регулиране на NADPH оксидазите.
Експресията на бъбречен Klotho ген е намалена в групата на АА, докато експресията на NAMPT и SIRT1 е сходна между групите. Klotho е ген против стареене, който кодира трансмембранен протеин с едно преминаване, който действа като супресор на стареенето. Процесът на стареене при мишките с дефицит на Klotho приличаше на този при хората, включително по-кратък живот, безплодие, артериосклероза, атрофия на кожата, остеопороза и емфизем [22]. Хипоморфните мутантни Klotho мишки също показват фенотип на ускорено стареене, който е възстановен чрез p16 аблация [23]. Тъй като Klotho е важен фактор за стареенето, Klotho ген-модифицирани мишки са били широко използвани в изследванията на стареенето. Въпреки това, Klotho ген-модифицираните мишки може да са неподходящи за изследване на бъбречното стареене поради системните увреждания, свързани със стареенето на тези мишки и факта, че бъбречната функция е непроверена (т.е. нивата на креатинин). За разлика от това, моделът на мишка AAN може да се използва като лекарствено-индуциран модел на бъбречно стареене за изследователски цели, тъй като има няколко предимства, като например относителната лекота на прилагане и способността да се оценят ефектите от интервенциите върху бъбречния функционален спад .
Настоящото проучване имаше някои ограничения. Ние оценихме бъбречното стареене, като се фокусирахме главно върху клетъчното стареене, митохондриалната морфология и свързаната със стареенето генна експресия. Механизмите на стареене обаче са сложни и остават слабо разбрани. Освен това, въпреки че експресията на Klotho ген беше намалена в отговор на АА, не можахме да демонстрираме причинно-следствена връзка с патологичните промени в AAN. Необходими са допълнителни изследвания, за да се определят ролите на различните молекули, участващи в развитието на AAN. Независимо от това, настоящото проучване предоставя нови прозрения за използването на Avan като модел на бъбречно стареене. Важно е да се отбележи, че фенотипните промени вбъбрекса силно свързани с продължителността на живота. въпреки чебъбрексе повлиява лесно от промени, свързани със стареенето, инхибирането на бъбречното стареене може да удължи общата продължителност на живота. Следователно по-нататъшни изследвания на бъбречното стареене, използващи модели на AAN, могат да доведат до увеличена продължителност на живота в бъдеще.
4. Материали и методи4.1. ЖивотниТова проучване е проведено в съответствие с насоките на Националния институт по здравеопазване за използване на експериментални животни. Всички експерименти с животни бяха одобрени от Комитета за изследване на животни на градския университет в Йокохама (номер на одобрение: FA20-027) и бяха проведени в съответствие с указанията на ARRIVE. Бяха положени усилия за минимизиране на броя на използваните животни и тяхното страдание. Мишките бяха настанени в контролирана среда при цикъл 12-h светлина/12-h тъмно при температура от 25 градуса C. Мишките имаха свободен достъп до храна и вода.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНА/БЪБРЕЧНА ИНФЕКЦИЯ
Осемседмични мъжки мишки C57BL/6 са закупени от Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) и са причислени към групите с контролен носител или АА след 1 седмица на аклиматизация, мишките са интраперитонеално администрирани с носител или АА (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, USA), който се разтваря в малко количество диметилсулфоксид. Преди настоящото проучване проведохме предварително проучване, използвайки няколко протокола. Първият протокол включва прилагане на AA (3 mg/kg) на мишки C57BL/6 интраперитонеално два пъти седмично в продължение на 4 седмици без време за ремоделиране; в този протокол АА причинява явни остри бъбречни лезии, като разширени проксимални тубули със загуба на граница на четката (допълнителна фигура S1). Във втория протокол, C57BL/6 мишки бяха администрирани с AA (2,5 mg/kg) интраперитонеално веднъж седмично в продължение на 4 седмици, последвано от време на ремоделиране в продължение на 4 седмици; плазменият креатинин при тези мишки беше 0.19 ± {{20}}.080 mg/dL срещу 0,18 ± 0,010 mg/dL (съответно контрола на носителя спрямо AA; средна ± стандартна грешка на средната (SEM), p=0.86, несдвоен t-тест на Student, n=4 за група) и плазмената UN е 31,3 ± 5,95 mg/dL спрямо 30,4 ± 3,87 mg/dL (контрол на носителя спрямо AA, съответно; средно ± SEM, p=0.90, несдвоен t-тест на Student, n=4 за група). Следователно, ние установихме, че този протокол не е подходящ за модел на бъбречно увреждане, тъй като АА не предизвиква значителен функционален спад на бъбреците. В третия протокол, C57BL/6 мишки бяха администрирани с AA (3 mg/kg) интраперитонеално два пъти седмично в продължение на 10 седмици без време за ремоделиране; при тези мишки смъртността в групата на АА е била 83 процента (n=6), докато нито една от мишките в контролната група с носител не е умряла (n=4). В този протокол не можахме да оценим статистически бъбречния фенотип, индуциран от АА поради високата смъртност. В четвъртия протокол, C57BL/6 мишки бяха администрирани с AA (3 mg/kg) интраперитонеално два пъти седмично в продължение на 4 седмици, последвано от време на ремоделиране в продължение на 4 седмици; При тези мишки са наблюдавани хронични бъбречни лезии, като тубулоинтерстициална фиброза и бъбречно функционално увреждане [9]. Следователно, въз основа на резултатите от тези предварителни проучвания, ние приехме четвъртия протокол за провеждане на експериментите в настоящото изследване.
4.2. Измерване на BPСистоличното BP и сърдечната честота бяха измерени с помощта на описания по-рано метод на маншета на опашката (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Токио, Япония)[24,25]. Всички измервания бяха извършени между 9:00 и 14:00. Бяха извършени най-малко 10 измервания във всяка мишка и средната стойност беше използвана за анализ.
4.3. Количествен PCR анализ с обратна транскрипция в реално време Общата РНК се екстрахира от бъбречни тъкани с помощта на ISOGEN (Nippon Gene, Токио, Япония) и комплементарна ДНК (cDNA) се синтезира с помощта на SuperScript IⅢFirst-Strand System (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Количествен PCR анализ на обратна транскрипция в реално време беше извършен с помощта на CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, САЩ) и продуктите на обратната транскрипция бяха инкубирани с TaqMan PCR Master Mix и персонализиран TaqMan сонда (Applied Biosystems, Waltham, MA, САЩ), както е описано по-рано [26]. Използвани са сонди TaqMan срещу следните гени: колаген I(Mm00801666_g1), колаген II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1),p53(Mm00441964 g1),p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1) и Nox2 (Mm00627011_m1).mRNA нивата бяха нормализирани до тези на 18S рибозомна РНК.
4.4. Уестърн блот анализ Експресията на протеин се анализира чрез Western blot анализ на тъканните хомогенати, като се използва описан по-рано метод [27,28]. Общи протеинови екстракти се приготвят от тъканите, като се използва буфер за проби, съдържащ натриев додецил сулфат. Концентрацията на протеин на всяка проба се измерва с помощта на комплекта за тестване на протеини, съвместим с детергенти (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Калифорния, САЩ) и NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, САЩ), с говежди серумен албумин като стандартен. Равни количества протеинови екстракти от тъканните проби бяха фракционирани върху 5-20 процента полиакриламидни гелове (ATTO Corp., Токио, Япония). След това отделените протеини се прехвърлят към поливинилиден дифлуоридни мембрани, като се използва полусуха система за трансфер (ATTO Corp., Токио, Япония). Мембраните се блокират за 1 час при стайна температура с фосфатно буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 5 процента обезмаслено мляко на прах. Мембраните се инкубират с първични антитела срещу Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), NAMPT(sc-67020 1:5000; Abcam), SIRT1(07-131 1:1000, MilliporeSigma , Бърлингтън, Масачузетс, САЩ), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Япония) и глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Мембраните се промиват и се инкубират с вторични антитела в продължение на 60 минути при стайна температура. Местата за реакции антитяло-антиген се визуализират с помощта на подобрен хемилуминесцентен субстрат (Merck, Kenilworth, NJ, USA). GAPDH се използва като контрола на натоварването. Изображенията бяха анализирани количествено с помощта на ChemiDoc Touch (Bio-Rad Laboratories, Херкулес, Калифорния, САЩ).
4.5. Хистологичен анализ се извършва, както е описано по-горе [29]. Бъбречните тъкани от мишки се фиксират с 4% параформалдехид и след това се поставят в парафин. Срезове (с дебелина 4 um) се оцветяват с PAS и MT петна. За да се оцени гломерулната област, 50 гломерули на мишка бяха измерени и осреднени. Всички изображения са получени с помощта на микроскоп BZ-9000 (Keyence Corp., Осака, Япония).
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ДИАЛИЗА
4.6. SA- -оцветяване Бъбречни тъкани от мишки бяха бързо замразени и монтирани в съединение с оптимална температура на рязане （Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Токио, Япония）. Срезове（4 μm дебелина） бяха подготвени с помощта на криостат (HM550-VPD; Thermo Fisher Scientific) и монтирани върху предметни стъкла. SA- -gal активността се измерва с помощта на комплект за откриване на стареене (Bio Vision Inc., Милпитас, Калифорния, САЩ) съгласно протоколите на производителя. Пробите се разглеждат в светло поле при ×100 увеличение с помощта на BZ-9000микроскоп (Keyence Corp.). 4.7.Електронна микроскопияЕлектронномикроскопският анализ се извършва, както е описано по-горе [30]. Мишките се анестезират с изофлуран и се перфузират през дясната аортна дъга с хепаринизиран (5 U/mL) физиологичен разтвор и 2,5 процента глутаралдехид в 0,1 mol/L фосфатен буфер при рН 7,4. Образците за трансмисионна електронна микроскопия се потапят в 1% осмиев тетроксид за 2 часа, серийно се дехидратират в етанол и се поставят в смес от Epon. Ултратънките срезове се оцветяват с уранил ацетат и оловен цитрат и се изследват с помощта на предавателен електронен микроскоп Hitachi H-7500, работещ при 80 kV (Hitachi, Ltd., Токио, Япония). Секциите бяха наблюдавани при ×5000 увеличение и фотографирани с помощта на камера със свързано устройство.
4.8.Биохимичен анализКръвни проби бяха взети чрез сърдечна пункция в наяло състояние. Пробите от цяла кръв се центрофугират при 3000 rpm (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Токио, Япония) в продължение на 10 минути при 4 градуса за отделяне на плазмата. Получените плазмени проби се съхраняват при -80 градуса. Плазменият креатинин, UN и нивата на креатинин в урината бяха измерени с помощта на автоанализатор Hitachi 7180 (Hitachi, Ltd., Токио, Япония).
4.9. Статистически анализ Статистическите анализи бяха извършени с помощта на софтуер GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ). Данните са представени като средна стойност ± SEM. Несдвоеният f-тест на Стюдънт беше използван за сравняване на разликите между групите за контрол на превозното средство и АА.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. ИзводиПриложението на АА причинявабъбрекстареене, заедно с тубулоинтерстициална фиброза и бъбречна атрофия. Резултатите предполагат, че бъбречната фиброза е тясно свързана с бъбречното стареене и че AAN може да бъде полезен катобъбрек-специфичен модел на стареене.