Инхибирането на ариловия въглеводороден рецептор възстановява медиираната от индоксил сулфат ендотелна дисфункция в аортни пръстени на плъх Ⅱ
Dec 18, 2023
3. Дискусия
Повишеното производство на CYP1A1 и ROS, индуцирано от активирането на AhR, играе важна роля в увреждането на ендотелиум-зависимата вазодилатация [24, 25]. Резултатите от настоящото проучване предполагат, че блокадата на AhR с CH223191 облекчава медиираната от IS прооксидативна генна експресия на CYP1A1 иПроизводство на ROSв аортата и запазена експресия на eNOS и ендотел-зависим вазодилататорен отговор към ACh. Нарушаване на зависимата от ендотелиума вазодилатация след експозиция на IS е наблюдавано преди в клинични условия приБолни от ХБНосвен това, понижаването на нивата на IS в кръвообращението с AST-120 подобрява шапа при пациенти с ХБН [8] и подобрява ендотелния отговор в микроваскулатурата в краен стадийбъбречно заболяванепациенти, използващи йонофореза [26]. По същия начин в животински модели наХБН, лечението с AST-120 възстанови ендотелиум-зависимата релаксация в аортните пръстени [11]. Заедно тези констатации показват, че IS участва в увреждането на ендотелно-зависимата функция в микроваскуларните и проводните съдове. Потенциално ограничение на това проучване е, че експериментите са проведени в отсъствието на плазмени протеини като албумин, следователно концентрацията на свободен IS, използвана за тези остри изследвания, може да бъде по-висока от наблюдаваната приБолни от ХБН, но целта на настоящото проучване беше да се изследват механизмите на индуцираната от IS съдова функция
ВЗЕМЕТЕ НАТУРАЛЕН ОРГАНИЧЕН ЕКСТРАКТ ОТ ЦИСТАНША С 25% ЕХИНАКОЗИД И 9% АКТЕОЗИД ПРИ БЪБРЕЧНИ ИНФЕКЦИИ
Съдовият ендотелрегулира съдатонус в кондуитните и съпротивителните артерии чрез няколко фактора с азотен оксид (NO), за който се смята, че е основният механизъм, засегнат от уремия [8,10,11,26–28]. Предишни проучвания показват, че намалената ендотелна синтаза на азотен оксид (eNOS) и производството на NO в IS-стимулирани ендотелни клетки е свързана с повишена ROS чрез активиране на NADPH оксидаза, както и инхибиране на антиоксидантни системи [8,10,14,15]. Освен това,ХБНплъхове, третирани с AST-120, съобщават за възстановяване на експресията на NO и eNOS и по-ниски серумни нива на IS [29]. В допълнение, генетичната делеция на AhR намалява скоростта на пулсовата вълна в сравнение с мишки от див тип, което показва повишена еластичност на съдовете, което е придружено от повишаване на съдържанието на NO и активността на eNOS [30]. Резултатите от тези предишни проучвания са в съгласие с тези, наблюдавани тук, където се наблюдава повишаване на експресията на ендотелен NOX4, нитротирозин и супероксид и съпътстващо намаляване на eNOS след IS стимулация. Освен това тези промени в ендотела бяха предотвратени в присъствието на CH223191. Предишни проучвания са изследвали ендотелиум-независима релаксация в аортата в присъствието на IS, използвайки NO донора натриев нитропрусид; въпреки това не се наблюдава промяна в отговора дори след четири дни инкубация с 1 mM IS в сравнение с контролните условия [11], следователно тази релаксация не е изследвана в настоящото проучване.
Съобщава се, че активирането на AhR и неговия път надолу по веригата играе роля в ендотелиум-зависима съдова дисфункция, хипертония и сърдечна хипертрофия, предизвикваща експресия на CYP1A1 и увеличаваща ROS във васкулатурата и сърцето [24,25]. Проучвания при CYP1A1 нокаут мишки съобщават, че активирането на AhR предотвратява увеличаването на производството на супероксид в тези тъкани и възстановява ендотелната релаксация [25]. Освен това, мишки с нокаут на AhR или фармакологично инхибиране на рецептора с -нафтофлавон (-NF), също частичен агонист на AhR, при диабетна нефропатия води до намален оксидативен стрес [31]. В съответствие с тези наблюдения, проучванията на активирането на AhR на ендотелните клетки на човешката пъпна вена (HUVECs) по подобен начин демонстрират повишаване на индуцирания от IS оксидативен стрес със съпътстващо намаляване на NO и повишена експресия на CYP1A1, които са били инхибирани от инхибиране на AhR или предотвратени от навлизане в клетката чрез инхибиране на органичния анионен транспортер пробенецид [8,15].
Повишеният оксидативен стрес може да бъде причинен от дисбаланс между про- и анти-оксидативни състояния. При изследване на индуцираното от AhR Nrf2-индуцирано активиране на ARE не открихме промяна в експресията на антиоксидантни ензими. Преди това Bolati et al. са показали, че повишеният IS регулира надолу експресията на Nrf2 ген в HK2 клетки, освен това при плъх модел на CKD с повишен серумен IS, намалената експресия на Nrf2 и NQO1 протеин е отслабена след лечение с AST-120 [32]. Нашите резултати предполагат, че фаза II на геномния път може все още да не е активирана, като се има предвид острата 4-часова експозиция на
IS се използва в това проучване. Бъдещата оценка на тези антиоксидантни механизми е оправдана, като се използва по-дълъг времеви курс на индуцирано от IS активиране на AhR.
Индол-3 оцетната киселина (IAA) е друг агонист на AhR и PBUT, който прогресивно се повишава вциркулация на пациенти с ХБНи предсказване на смъртността и основните неблагоприятни сърдечно-съдови събития, серумните нива на тази молекула са корелирани с маркери за възпаление и оксидация [33]. В допълнение, IAA стимулирането на HUVECs доведе до повишена експресия на гена на CYP1A1 и циклооксигеназа-2 (COX-2) и повишено производство на протеин COX-2 и ROS. В присъствието на CH223191, тези промени във възпалението и оксидативния стрес бяха значително намалени или премахнати [33].
Известно е, че предизвиканите от IS възпалителни реакции водят до експресия на адхезионни молекули, възпалителни цитокини и хемокини [11,15,34], което допринася за патогенезата на съдова дисфункция. Съобщава се, че CH223191 инхибира експресията на IS-индуциран моноцит хемо-привличащ протеин-1 (MCP-1) в HUVECs [15], като по този начин намалява съдовото възпаление. В допълнение, siAhR-трансфектирани HUVECs потискат IS-усилено съдово възпаление (медиирано от TNF), левкоцитна адхезия и експресия на ген на E-селектин [34]. Освен това, експозицията на IS (1 mM) на аортни пръстени, изолирани от здрави животни за до четири дни, не само намалява ендотелиум-зависимата релаксация, но също така намалява CD31 оцветяването и увеличава молекулата на адхезията на васкуларните клетки -1 (VCAM{{18) }}) и експресия на вътреклетъчна адхезионна молекула-1 (ICAM-1) в аортата [11]. По същия начин, аортите, събрани от CKD мишки на десет седмици, показват намалена ендотелиум-зависима релаксация, която е допълнително намалена, когато се инкубира с IS. Тези промени бяха придружени от намаляване на оцветяването с CD31 и повишено оцветяване с ICAM-1 и VCAM-1. Освен това лечението на животни с ХБЗ с AST-120 подобрява ендотелиум-зависимата релаксация и намалява експресията на адхезионния маркер към контролните нива [11]. Нашите резултати, изследващи краткосрочния ефект на IS със и без инхибиране на AhR върху експресията на VCAM-1, са в съответствие с предишните открития, описани по-горе. Интересно е, че на 4 часа след стимулиране на IS експресията на TNF ген изглежда нараства, откритие, което преди това демонстрирахме на 18 часа в човешки аортни ендотелни клетки, THP-1 клетки, сърдечни миоцити и фибробласти на плъхове и бъбреците на плъхове мезангиални клетки [35–37]. Други съобщават по подобен начин за повишена експресия на TNF в клетъчни линии на моноцити и макрофаги [38,39]. Смята се, че при макрофагите това включва кръстосано взаимодействие между AhR, ядрен фактор κB (централен медиатор при възпаление) и супресор на цитокиновото сигнализиране 2 [39]. Въпреки това, директният инхибиторен ефект на CH223191 върху IS-индуцираната TNF генна експресия във васкулатурата, доколкото ни е известно, не е докладван досега и това може да бъде нов механизъм за бъдещо изследване на IS-индуцирано съдово възпаление.
AhR се експресира повсеместно [40], което предполага, че неговото инхибиране може да играе роля в намаляването на нежеланите ефекти в много тъкани, свързани с ХБН. По-рано показахме, че IS индуцира сърдечен ибъбречен колагенсинтез в сърдечни фибробласти и бъбречни мезангиални клетки, както и хипертрофия на миоцити в сърдечни миоцити и възпалителни реакции в THP-1 клетки [35]. Освен това, при модели на ХБН и инфаркт на миокарда, при които серумният IS и сърдечната и бъбречната фиброза са повишени, е показано, че лечението с AST-120 намалява тези ефекти [41–43]. Ichii и др. (2014) демонстрира, че хроничното прилагане на IS в продължение на осем седмици е довело до прогресивно бъбречно и съдово заболяване, наблюдавано чрез повишена фиброза, тубулна атрофия, съотношение албумин/креатинин в урината, както и увреждане на подоцитите със съпътстващо повишена експресия на CYP1A1, което е показателно за активиране на AhR [44]. ]. В диабетния бъбрек се смята, че AhR играе роля във фиброзата, възпалението и оксидативния стрес, увеличавайки експресията на трихромно оцветяване, гладкомускулен актин, фибронектин, серумен простагландин E2 (PGE2), серумни крайни продукти на напреднала гликация, COX{{ 12}}, инфилтрация на макрофаги F4/80, активност на NOX и маркер за оксидативно увреждане 8-хидроксидеоксигуанозин. Повишената експресия на тези маркери беше предотвратена при диабетни AhR нокаут мишки и диабетни мишки от див тип, третирани с AhR антагонист -NF [31]. В допълнение, in vitro проучвания от Lee et al. (2016) показаха, че при стимулиране на мезангиални клетки на плъх и мишка и тубулни клетки на човешки бъбрек с N-ε-карбоксиметил-лизин (CML), основен краен продукт на напреднала гликация, се повишава експресията на AhR, колаген IV, растежен фактор на съединителната тъкан , фибронектин и PGE2, тази експресия е предотвратена в клетки, трансфектирани с shRNA-AhR, или фармакологично третирани с -NF [31].
Ясно е, че AhR играе важна роля в патологията на сърдечно-съдовата ибъбречно заболяванев условията на ХБН, предлагайки нова възможност за терапевтична интервенция. Тъй като резултатите от проучванията EPPIC съобщават за неутрален резултат с AST-120 [23], са необходими други стратегии за смекчаване на вредните ефекти на PBUT при ХБН. Като се има предвид изобилието от данни, показващи ползата от инхибирането на AhR, in vivo, in vitro или ex vivo, независимо дали са генетични или фармакологични, ще е необходимо in vivo доказателство за принципно проучване, изследващо CH223191 в клинично значим модел на ХБН, който показва ефикасност, за напреднете този клас лекарства към следващия етап.
В заключение, настоящото проучване демонстрира, че IS-медиираното увреждане на ендотелиално-зависимата вазодилатация е свързано с индуциран оксидативен стрес, включващ повишаване на експресията на CYP1A1. Обръщането на тези ефекти чрез инхибиране на AhR с CH223191 може да осигури терапевтична полза за поддържане на ендотелната функция в популацията на ХБН. Потенциално антагонистите на AhR могат да се използват като допълнителна терапия в допълнение към стандартното лечение при пациенти с ХБН и да намалят прогресирането на риска от ССЗ при тази популация.
4. Материали и методи
4.1. Съдова реактивност
По отношение на ефекта на IS в отсъствието и присъствието на антагониста на AhR, CH223191 беше оценен заендотелна функция. Накратко, 10–14 седмични мъжки плъхове Sprague-Dawley бяха анестезирани с Lethbarb (Troy Laboratories, Австралия) и низходящата торакална аорта беше събрана, както е описано по-горе [36]. Аортите бяха почистени и разрязани на четири 5 mm пръстена и внимателно поставени между 2 хоризонтални опори от неръждаема стомана с единия край, свързан към микрометър за регулиране на напрежението. Тъканите се потапят в вани с кислородна тъкан, съдържащи буфер на Krebs-Henseleit (119 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,17 mM MgSO4.7H2O, 25 mM NaHCO3, 1,18 mM KH2PO4, 11 mM D-глюкоза, 0.03 mM EDTA , 2.0 mM CaCl2) [11] и произволно разпределени към следните условия: (1) Контрола; (2) IS (300 цМ); (3) IS + CH223191 (1 цМ); (4) IS + CH223191 (10 цМ). Тъканите се стабилизират под 2 g изходно напрежение и се промиват 5 пъти с буфер на Krebs на всеки 5 минути. Жизнеспособността и контрактилните отговори бяха оценени с (80 mmol/L) и оставени да достигнат максимална контракция преди 3 × 5 минути период на измиване с буфер.
Тъканите, поставени в буфер на Krebs-Henseleit, се инкубират предварително с носител (0.1% DMSO за условия 1 и 2) или AhR антагонист CH223191 (1 или 10 µM за условия 3 и 4, съответно) в продължение на 2 часа, последвано от 1 h инкубиране с IS (300 µM, условия 2-4, контролното състояние получава 120 µL дестилирана вода). След това аортните пръстени бяха предварително стеснени с фенилефрин (PE, 30 µM), където при постигане на максимална констрикция зависимата от ендотела съдова функция беше оценена чрез крива на релаксация доза-отговор към ацетилхолин (ACh; 1 nM–30 µM). Промяната в напрежението беше получена чрез изометрични преобразуватели (FT03C, Grass Instruments, Quincy, MA, САЩ), усилена (Unicor Instruments, Box Hill, Vic, Австралия) и записана с помощта на хардуер за събиране на данни (PowerLab 4sp, ADInstruments, Castle Hill , NSW, Австралия) и софтуер за диаграми (ADInstruments v5.6). Получената релаксация с всяка доза ACh се изразява като процентно намаление на максималната контракция, получена с фенилефрин за всяко състояние. Експериментите с животни бяха одобрени от Комитета по етика на животните на болницата St. Vincent, AEC 006/17.
4.2. Изследвания на генната експресия
Торакалните аортни пръстени от отделни животни се изолират, както е описано по-горе, и се инкубират с Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), допълнена с антибиотици (1%) в 5% CO2 при 37 ◦C. При условия 1–4, описани по-горе, аортните пръстени се инкубират с CH223191 за 2 часа, последвано от добавяне на IS за 4 часа. РНК се екстрахира с помощта на метода за екстракция на Trizol съгласно инструкциите на производителя, последвано от третиране с ДНКаза и обратна транскрипция. PCR беше извършен с помощта на SYBR green и специфични за последователността праймери за плъши CYP1A1, Nrf2, NQO1, GSTA1/2, TNF и VCAM-1 (вижте допълнителна таблица S1 за последователности на праймери), като се използва QuantStudio 7- Flex Real-Time PCR система (Applied Biosystems). Анализът на относителната промяна в експресията на mRNA на CYP1A1 беше извършен с помощта на сравнителния ∆∆Ct метод, използвайки домакинския ген 18S.
4.3. Имунохистохимия
В края на експериментите за съдова реактивност, аортните пръстени бяха незабавно фиксирани в 10% неутрален буфериран формалин за една нощ, обработени в автоматичен тъканен процесор и вградени в парафин на следващия ден за имунохистохимия. LV тъканни срезове (4 µm) от всеки експеримент бяха оцветени за RECA-1 (BioRad #MCA970GA, 1/200 разреждане), eNOS (BD Biosciences #610296, 1/200 разреждане), NOX4 (Abcam #133303, 1 /150 разреждане) и нитротирозин (Merck #06-284, 1/100 разреждане) и се открива с диаминобензимид, както е описано по-горе [45]. Оцветените слайдове бяха сканирани цифрово с помощта на скенера Aperio Scanscope със софтуер Scanscope Console (v8, Aperio Technologies, Vista, Калифорния, САЩ) и количествено определени за положително оцветяване на лумена като процент от общия периметър на лумена с помощта на софтуер Imagescope (v 11.1.2.760, Aperio Technologies ).
4.4. Оценка на реактивни кислородни видове
Реактивни кислородни видове(ROS) са открити в аортна тъкан, получена от функционалните изследвания. Тъканните срезове се оцветяват с дихидроетидий (DHE, 2 µM) в продължение на 30 минути при 37 ◦C [46]. Конфокален микроскоп (Nikon A1R, Nikon Instruments Inc., Melville NY, USA) беше използван за визуализиране на червено-флуоресцентно оцветяване с емисионен спектър от 610 nm при ×20 увеличение. Процентната площ на DHE оцветяване за се определя с помощта на ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA).
4.5. Статистически методи
Ефектите върху ендотелната функция бяха сравнени чрез анализ на дисперсията с двупосочни повторени измервания (ANOVA) с post-hoc сравнението на Tukey, за да се определи ефектът от процентното отпускане на всяка доза ACh. Стойностите на максимална релаксация (Rmax) и pEC50 за ACh бяха получени чрез нелинейна регресия, последвана от еднопосочна ANOVA с повторени измервания с post-hoc сравнение на Tukey. Това беше използвано за определяне на статистическата значимост на максималната релаксация (Rmax) и pEC50 стойностите за ACh. По подобен начин, генната експресия и имунохистохимичното и DHE оцветяване бяха сравнени чрез еднопосочна ANOVA с post-hoc сравнението на Tukey.
Допълнителни материали:Следната подкрепяща информация може да бъде изтеглена от: https: //www.mdpi.com/article/10.3390/toxins14020100/s1, Фигура S1: Ефект само на CH223191 върху съдовата реактивност в изолирани аортни пръстени на плъх; Фигура S2: Ефект на инхибирането на IS и AhR върху експресията на Nrf2 и антиоксидантен ген Таблица S1: Нуклеотидни последователности на праймери, използвани за количествено определяне на ген чрез PCR в реално време.
Авторски принос:Концептуализация, ARK; методика, КН и АРК; валидиране, CN, AJE и ARK; формален анализ, CN и ARK; разследване, CN; ресурси, АРК и ДЖК; обработка на данни, CN и ARK; писане-изготвяне на оригинална чернова, CN; писане-преглед и редакция, CN, AJE, DJK и ARK; визуализация, КН и АРК; надзор, AJE и ARK; администриране на проекти, AJE и DJK; придобиване на финансиране, DJK Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.
Препратки
1. Савира, Ф.; Адеми, З.; Wang, BH; Компа, AR; Оуен, AJ; Liew, D.; Zomer, E. Предотвратимото натоварване на производителността на бъбрецитеЗаболяване в Австралия.J. Am. Soc. Нефрол.2021, 32, 938–949. [CrossRef]
2. Елшахат, С.; Cockwell, P.; Максуел, AP; Грифин, М.; О'Брайън, Т.; O'Neill, C. Влиянието на хроничното бъбречно заболяване върху развититедържави от гледна точка на здравната икономика: систематичен преглед на обхвата.ПЛОС ЕДИН2020, 15, e0230512. [CrossRef]
3. Манджунат, Г.; Tighiouart, H.; Ибрахим, Х.; MacLeod, B.; Салем, DN; Грифит, JL; Coresh, J.; Леви, AS; Sarnak, MJ Ниво набъбречната функция като рисков фактор за атеросклеротични сърдечно-съдови резултати в общността.J. Am. Coll. Кардиол.2003, 41, 47–55. [CrossRef]
4. Барето, FC; Барето, ДВ; Liabeuf, S.; Meert, N.; Glorieux, G.; Теммар, М.; Choukroun, G.; Vanholder, R.; Маси, ZA; европейскиРаботна група за уремичен токсин. Серумният индоксил сулфат се свързва със съдови заболявания и смъртност при хронично бъбречно заболяванепациенти.Clin. J. Am. Soc. Нефрол.2009, 4, 1551–1558. [CrossRef] [PubMed]
5. Имазу, М.; Фукуда, Х.; Канзаки, Х.; Амаки, М.; Хасегава, Т.; Takahama, H.; Хицумото, Т.; Цукамото, О.; Морита, Т.; Ито, С.;et al. Плазмените нива на индоксил сулфат предсказват сърдечно-съдови събития при пациенти с лека хронична сърдечна недостатъчност.Sci. Представител2020, 10, 16528. [CrossRef]
6. Ди Луло, Л.; Хаус, А.; Горини, А.; Сантобони, А.; Русо, Д.; Ronco, C. Хронично бъбречно заболяване и сърдечно-съдови усложнения.Сърдечна недостатъчност. Rev.2015, 20, 259–272. [CrossRef] [PubMed]
7. Jourde-Chiche, N.; Dou, L.; Cerini, C.; Дигнат-Джордж, Ф.; Brunet, P. Съдова некомпетентност при пациенти на диализа - свързани с протеиниуремични токсини и ендотелна дисфункция.Семин. Набиране.2011, 24, 327–337. [CrossRef]
8. Ю, М.; Ким, YJ; Kang, DH Индоксил сулфат-индуцирана ендотелна дисфункция при пациенти с хронично бъбречно заболяване чрезиндукция на оксидативен стрес.Clin. J. Am. Soc. Нефрол.2011, 6, 30–39. [CrossRef] [PubMed]
9. Ooi, QL; Теглене, FK; Дева, Р.; Псевдоним, MA; Кавазаки, Р.; Уонг, TY; Мохамад, Н.; Колвил, Д.; Hutchinson, A.; Savige, J. Theмикроваскулатура при хронично бъбречно заболяване.Clin. J. Am. Soc. Нефрол.2011, 6, 1872–1878. [CrossRef] [PubMed]
10. Чу, С.; Мао, X.; Guo, H.; Wang, L.; Li, Z.; Джан, Й.; Wang, Y.; Wang, H.; Джан, X.; Peng, W. Индоксил сулфат потенцираендотелна дисфункция чрез реципрочна роля за реактивни кислородни видове и RhoA/ROCK сигнализиране при 5/6 нефректомирани плъхове.Свободен Радик. Рез.2017, 51, 237–252. [CrossRef]
Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:
Имейл:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/телефон:+86 15292862950
Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
