Опити за нови лекарства за бъбречни заболявания: графенов оксид като носител за доставяне на лекарства на метотрексат

Контакт:ali.ma@wecistanche.com

Хани Насер Абделхамид и др

Ползи за здравето на цистанче на прах при бъбречни заболявания, щракнете тук, за да получите пробата

Резюме:

Наноматериали, включително наночастици на основата на въглерод, се прилагат като носители за противоракови лекарства. Това кратко съобщение съобщава за синтеза, цитотоксичността и доставянето на лекарството на метотрексат, използвайки графенов оксид (GO) като носител. GO е синтезиран по метода на Hummer. Характеризира се с помощта на рентгенова дифракция (XRD), трансмисионен електронен микроскоп (TEM) и сканиращ електронен микроскоп (SEM). Анализът на данните потвърждава синтеза на GO с висока кристалност и морфология на ламели. GO показва висока цитосъвместимост спрямо човешките ендотелни клетки EA.hy926. GO е използван като носител за противораково лекарство; метотрексат. Доставянето на лекарството е тествано за хепатоцелуларен карцином клетки (HepG2 клетки), човешки ембрионбъбрекклетки (HEK293A клетки) и фибробласти от свинска кожа (PEF).

Ключови думи:въглероднаноматериали; доставка на лекарства; химиотерапия; метотрексат.

1. Въведение

Раковото заболяване се смята за сериозна заплаха за хората. Световната здравна организация (СЗО, 2018 г.) съобщи, че ракът причинява един на всеки шест смъртни случая. Според проучване през 2020 г. има 19 милиона случая, свързани с рак годишно [1], което причинява 8,8 милиона смъртни случая (което представлява 15,7 процента от смъртните случаи годишно) [2,3]. Няколко лекарства са докладвани като обещаващи противоракови терапевтици [4–11]. Въпреки това им липсва висока клетъчна интернализация, клетъчно проникване, бионаличност, селективност и повишена ефективност [5,6,12–19]. По този начин, няколко носителя, включително естествени полимери [20], полизахариди [13], магнитни носители [21] и извънклетъчни носители (EVs) [22], са докладвани за доставяне на лекарства. Те показват висока способност за зареждане с лекарства, контролирано освобождаване и повишена клетъчна интернализация. Нанотехнологиите имат напреднали биомедицински области, включително лечение на рак [23–29].

Графенът е нов алотроп (двуизмерен, 2D) навъглеродни наноматериалис един слой от sp2-хибридизирани въглеродни атоми [30–39]. Синтезът на графен беше удостоен с Нобелова награда за химия през 2010 г. На базата на графеннаноматериаликато графенов оксид (GO) имат напреднала биомедицина, включително доставка на лекарства [40,42]. Те могат да преминат в скеле [43,45], влакна [46] и хидрогелове [47]. Базираните на графен материали предлагат няколко предимства, включително способности за високо натоварване и освобождаване на лекарства [47]. Смесени противоракови лекарства като доксорубицин (DOX) и камптотецин (CPT) могат да бъдат заредени в GO [49]. Така те могат да доставят повече от едно лекарство едновременно. Лекарството може да бъде заредено в графен чрез ковалентна чрез омрежваща химия [50], електростатични и физически абсорбционни взаимодействия като π-π кооперативно взаимодействие [51]. Доставянето на лекарството може да се контролира чрез pH [50,52], ензимно [53], близка инфрачервена (NIR) светлина [54] и електрически контрол [55]. Повърхностната модификация осигурява високо освобождаване на лекарство [56]. Графенът може също да бъде модифициран с други наночастици, включително магнитни наночастици за фототермична обработка [57]. Базираните на графен материали предлагат многофункционалност [58–61]. Полярните групи правят материала силно хидрофилен. По този начин те са използвани като носител за доставяне на противоракови лекарства като DOX [62], кверцетин и гефитиниб [63], суматриптан сукцинат (SS) [64] и цитарабин (CYT) [65].

Тук е изследвано приложението на графенов оксид (GO) за доставяне на метотрексат (MTX). Беше последван методът на Hummer, за да се синтезира GO, последван от ултразвук, за да се осигури висока дисперсия. Кристалността и морфологията на GO се характеризират с помощта на рентгенова дифракция (XRD) и електронен микроскоп (предаване (TEM), сканиране (SEM)). Материалът се смесва с метотрексат. GO, зареден с метотрексат, беше тестван с помощта на клетки от хепатоцелуларен карцином (HepG2 клетки), човешки ембрионалнибъбрекклетки(HEK293A клетки) и фибробласти от свинска кожа (PEF).

2. Материали и методи

Графитните люспи са закупени от Alfa Aesir (Германия). 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT), сярна киселина и калиев перманганат (KMnO4) са закупени от Sigma-Aldrich (САЩ).

2.1. Синтез на GO.

GO се приготвя по метода на Hummer [32,66]. Естественият графит (1.0 g) се диспергира в смес от сярна киселина (15.0 mL) и азотна киселина (10.0 mL) в ледена баня. Калиев перманганат (3.0 g) се добавя постепенно към киселинната смес по време на разбъркване. След 12 часа се накапва водороден пероксид (15.0 mL). GO се събира и се промива с HCl и вода, за да се отстранят всякакви примеси. Разтворът на GO (1 mg/mL) се приготвя чрез ултразвук (140 W) за 2d при 60 градуса.

2.2. инструменти.

Рентгеновата дифракция (XRD) се записва с помощта на PANalytical X'Pert Pro дифрактометър (Cu K 1, λ от 1.54Å). Изображението с трансмисионна електронна микроскопия (TEM) беше заснето с помощта на инструмент JEM-2100 (JEOL, Япония). Изображението от сканираща електронна микроскопия (SEM) беше направено с помощта на инструмент JSM-7000 (JEOL). UV-Vis спектрите бяха записани с помощта на Thermo Scientific Evolution-300. Инфрачервените (FT-IR) спектри на Фурие бяха оценени в твърда форма с помощта на Shimadzu-470 чрез KBr дискова техника.

2.3. Тест за индиректна цитотоксичност.

Човешки EA.hy926 ендотелни клетки се култивират в модифицирана среда на Dulbecco Eagle (DMEM; Invitrogen, САЩ), допълнена с 10 процента фетален говежди серум (FBS; Hyclone, САЩ) и 1 процент пеницилин/стрептомицин (p/s, Gibco, САЩ) във влажен инкубатор при 37 градуса и 5 процента CO2. Клетките бяха събрани с помощта на метод, базиран на трипсин. Бяха подготвени екстракти от GO, за да се изследва всеки потенциален токсикологичен риск. Субстратът се стерилизира с помощта на газ етилен оксид и се смесва с DMEM без серум, допълнен с 1 процент p/s културална среда при условия на 37 градуса /120 r/min за 72 часа, съгласно стандартно съотношение от 0,2 g/mL от хранителна среда [67]. След това супернатантът се центрофугира и филтрира, за да се подготви накрая предварително кондиционираната среда.

Клетките се култивират при плътност от 5 × 104 клетки/ямка в 24-ямкови плаки за 24 часа, като се използва пълна хранителна среда. Средата се аспирира, след това се добавят 500 uL кондиционирана или контролна среда след комбиниране на 10 процента FBS. Като отрицателна контрола клетките се култивират с DMEM, докато в ямките с положителна контрола клетките се култивират в присъствието на 20 процента диметилсулфоксид (DMSO). Жизнеспособността на клетките беше качествено изследвана на ден 3 с помощта на комплект за анализ Live/Dead (калцеин-АМ/хомодимер на етидиев бромид, Invitrogen), съгласно инструкциите на производителя, наблюдаван под флуоресцентен микроскоп (Olympus, Япония).

2.4. Зареждане с лекарства.

Противораковото лекарство се зарежда чрез добавяне на 1.0 mL метотрексат (100 µg/mL; Sigma Aldrich) към 4.0 mL GO в буферен разтвор (25 µg/mL) при разбъркване в продължение на 48 часа на тъмно при стайна температура.

2.5. Тест за доставка на лекарства.

Хепатоцелуларен карцином клетки (HepG2 клетки), човешки ембрионбъбрекклетки (HEK293A клетки) и фибробласти от свинска кожа (PEF) се култивират в DMEM, допълнен с 10 процента FBS в овлажнена 5 процента CO2 атмосфера в инкубатор при 37 градуса. Клетките бяха събрани от 90% конфлуентни плаки с клетъчни култури и бяха ресуспендирани в напълно свежа среда преди посяване. Клетките (3 × 104) се посяват в 24-плака с ямки. Клетките се култивират в продължение на 24 часа, промиват се два пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и след това се инкубират или с MTX-GO, или с MTX (20 µg/mL), или GO (20 µg/mL), съдържащ само DMEM среда при 37 градуса за 24 часа. Клетъчната жизнеспособност се оценява с помощта на МТТ анализ. Активните клетки редуцират жълто оцветения МТТ до лилаво оцветени формазанови кристали. Накратко, 50 μL разтвор на МТТ (5 mg/mL) се добавят към всяка ямка и се инкубират при 37 градуса за 4 часа. След изхвърляне на средата, съдържаща МТТ, 350 μL от клетките се култивират в присъствието на 20 процента DMSO. След 10 минути инкубация, аликвотни части от 100 μL от ямките се пипетират в друга 96-плака с ямки. Полученият цвят се определя количествено чрез записване на абсорбцията при дължина на вълната 570 nm със спектрофотометър.

3. Резултати и дискусия

3.1. Характеристика на материала.

GO се синтезира чрез окисление на графит, като се използва KMnO4 в кисел разтвор (Фигура 1) [39,68,69]. XRD диаграмата за GO показва силен дифракционен пик на Bragg при 10.9 градуса, съответстващ на индекса на Милър на (002) равнина (Фигура 2а). D-разстоянието за подготвения материал е 0,9 nm (Фигура 2а). Морфологията на GO беше оценена с помощта на TEM и SEM изображения (Фигура 3). Прозрачността на GO в TEM изображението разкрива, че GO се състои от няколко 2D слоя (Фигура 3а). SEM изображенията потвърждават морфологията на ламелите на GO (Фигура 3b). TEM и SEM изображенията разкриват, че GO има разпадаща се морфология (Фигура 3).

UV-Vis спектърът на GO показва максимални ивици на абсорбция при 250 nm и 355 nm, съответстващи на π → π* преход на ароматни C–C връзки и n → π* преход на C=C (Фигура 2b) [70] . Въз основа на химическата структура, MTX показва силен π–π* или σ–σ* преход в UV–Vis областта при максимална абсорбция от 368 nm и 274 nm (Фигура 2b). Крайната лента на абсорбция на MTX при 368 nm беше изместена до 361 nm след конюгиране с GO, което показва силното взаимодействие между GO и MTX.

Химичните функционални групи преди и след взаимодействията бяха характеризирани с помощта на FT-IR спектри (Фигура 2в). GO проявява вибрационни ленти при 3569 cm-1, 1707 cm-1, 1628 cm-1, 1412 cm-1 и 1029 cm-1, съответстващи на O− H разтягане, C=O разтягане на групите на карбоксилната киселина, ароматно C−C разтягане, O–H деформация и C–O (Фигура 2в). FT-IR спектърът на MTX показва характерните ленти при 1380 cm-1, 1644 cm-1 и 3400 cm-1, съответстващи на C−N, −NH2 и N−H, съответно (Фигура 2в). MTX-GO показва характерните черти и за двата материала. Въпреки това, вибрационните ленти на MTX основно изчезват, което показва силното взаимодействие с GO (Фигура 2в).

3.2. GO цитосъвместимост.

Флуоресцентните изображения на EA.hy926 клетки също бяха докладвани (Фигура 4). Изображенията показват висока клетъчна плътност, разкриваща високата биосъвместима природа на GO (Фигура 4).

3.3. Доставка на лекарства.

GO се използва за доставяне на метотрексат (Фигура 1). И двете страни на GO слоевете могат да адсорбират MTX чрез нековалентни взаимодействия, включително електростатично и π-π интеркалиране. Междуравнинното разстояние на GO слоевете е близо до 1 nm, което предлага MTX интеркалация между слоевете. По този начин GO може да се използва като носител за доставка на MTX. Зареждането на MTX върху GO беше постигнато чрез смесване на двата вида във воден разтвор с помощта на ултразвук. Освобождаването на лекарството беше оценено с помощта на HepG2, HEK293A и PEF клетки.

МТТ анализът показа, че голият GO не предизвиква значителен цитотоксичен ефект върху трите типа клетки; HepG2, HEK293A и PEF клетки (Фигура 5). Свободният MTX се поема от туморната клетъчна линия (HepG2 клетки) и нормалните клетки (HEK293A и PEF клетки) с почти сходна цитотоксичност към трите типа клетки без видима селективност. След конюгиране на MTX с GO като носител, MTX-GO показва значителна специфична цитотоксичност към туморната клетъчна линия (HepG2 клетки) в сравнение с нормалните клетки (HEK293A и PEF клетки). Резултатите могат да открият нови пътища за използване на базирани на GO материали за клинични и хирургични приложения [71–74].

4. Изводи

GO е синтезиран и приложен като носител за доставяне на метотрексат. Проявява висока биосъвместимост. Зареждането на лекарството е просто. Клетъчната жизнеспособност за HepG2, HEK293A и PEF клетки показва контролирано освобождаване. Тези открития отварят нови възможности за биомедицинските приложения на графеновия оксид като носител за доставяне на лекарства.

ФинансиранеТова изследване няма финансиране.

БлагодарностиТова изследване няма потвърждение.

Конфликт на интересиАвторите декларират липса на конфликт на интереси.

Препратки

1. Шаковели, М.; Schmidt, C.; Maher, ER; Frezza, C. Метаболитни драйвери при наследствени ракови синдроми.Годишен Преглед на Рак Биология 2020, 4, 77-97.

2. Уанг, Х.; Нагави, М.; Allen, C.; Бръснар, RM; Bhutta, ZA; et al.. Глобална, регионална и национална очаквана продължителност на живота, смъртност по всякаква причина и смъртност по конкретна причина за 249 причини за смърт, 1980–2015 г.: систематичен анализ за проучването на глобалното бреме на болестта 2015 г.The Ланцет 2016, 388, 1459- 1544,

3. Абделхамид, HN; Талиб, А.; Ву, Х.-Ф. Синтез на нанокомпозит от злато и въглеродни точки в един съд и приложението му за циточувствителност на метали за ракови клетки.Таланта 2017, 166, 357-363,

4. Абделхамид, HN; Довайдар, М.; Hällbrink, M.; Лангел, Ü. Пептиди, проникващи в клетките-MOFs: Ефикасна платформа за доставяне на гени.На разположение при SSRN 3435895 2019.

5. Абделхамид, HN; Довайдар, М.; Лангел, Ü. Карбонизиран хитозан, капсулиран в йерархични порести зеолитни имидазолатни рамки наночастици за доставка на ген.Микропореста Мезопореста Матер. 2020, 302, 110200

6. Абделхамид, HN; Довайдар, М.; Hällbrink, M.; Лангел, Ü. Доставяне на ген с помощта на клетъчно проникващи пептиди - зеолитни имидазолатни рамки.Микропореста Мезопореста Матер. 2020, 300, 110173,

7. Абделхамид, HN; El-Bery, HM; Metwally, AA; Елшазли, М.; Hathout, RM Синтез на CdS-модифицирани квантови точки на хитозан за доставяне на лекарства на Sesamol.въглехидрати. Polym. 2019, 214, 90–99.

8. Султан, С.; Абделхамид, HN; Zou, X.; Матю, AP CelloMOF: 3D печат с активирана наноцелулоза на метало-органични рамки.адв. Функц. Матер. 2019, 29, 1805372,

9. Довайдар, М.; Насер Абделхамид, Х.; Hällbrink, M.; Langel, Ü.; Zou, X. Chitosan подобрява доставянето на ген на олигонуклеотидни комплекси с магнитни наночастици – проникващ в клетката пептид.J. Biomater.Appl. 2018, 33, 392-401,

10. Довайдар, М.; Абделхамид, HN; Hällbrink, M.; Zou, X.; Лангел, Ü. Нанолистове от графенов оксид в комплекс с клетъчно проникване. пептиди за доставяне на олигонуклеотиди.Biochim. Biophys. Acta - Ген. Subj. 2017, 1861, 2334–2341

11. Довайдар, М.; Абделхамид, HN; Hällbrink, M.; Фрайман, К.; Kurrikoff, K.; Zou, X.; Лангел, Ü. Подпомогнато от магнитни наночастици самосглобяване на клетъчно проникващи пептидно-олигонуклеотидни комплекси за доставка на ген.Sci. Представител 2017, 7, 9159.

12. Peer, D.; Карп, JM; Хонг, С.; Фарохзад, OC; Маргалит, Р.; Langer, R. Nanocarriers като нововъзникваща платформа за терапия на рак.Природата Нанотехнологии 2007, 2, 751-760.

13. Баркли, TG; Ден, CM; Петровски, Н.; Garg, S. Преглед на функционалното доставяне на лекарства на базата на полизахаридни частици.въглехидрати. Polym. 2019, 221, 94- 112.

14. Abdelhamid, HN Биоинтерфейс между ZIF-8 и биомолекулите и техните приложения.Биоинтерфейс Рез. Приложение Chem. 2021, 11, 8283-8297.

15. Abdelhamid, HN Наноцитотоксичност при използване на матрична асистирана лазерна десорбционна йонизационна масова спектрометрия.Бъдеще Microbiol. 2020, 15, 385-387.

16. Раджендран, С.; Mukherjee, A.; Шукла, Р.; Abdelhamid, H. Предотвратяване на нанотоксичност и антибактериални приложения на наноматериали; Elsevier, 2020 г.;

17. Abdelhamid, HN Глава 9 - Общи методи за откриване и оценка на нанотоксичност. вНанотоксичност, Rajendran, S., Mukherjee, A., Nguyen, TA, Godugu, C., Shukla, RK, Eds. Elsevier: 2020 г.; 195-214.

18. Кесервани, Р.; Sharma, A.; Абделхамид, Х.Наночастици Лекарство Доставка системи; Keservani, RK, Sharma, AK, Eds.; CRC Press, 2019.

19. Абделхамид, HN; Ву, Х.-Ф. Наночастиците ускоряват доставянето на лекарства за ракови клетки. вНаночастици Лекарство Доставка системи; Keservani, RK, Sharma, AK, Eds.; Apple Academic Press: САЩ, 2019 г.; стр. 121–150 ISBN 978- 1-77188-695-6.

20. Георги, А.; Шах, Пенсилвания; Shrivastav, PS Естествени биоразградими полимери на основата на нано-формули за доставка на лекарства: преглед.Вътр. J. Pharm. 2019, 561, 244-264.

21. Liu, Y.-L.; Чен, Д.; Shang, P.; Ин, Д.-К. Преглед на магнитни системи за целево доставяне на лекарства.J. контрол. Освобождаване 2019, 302, 90– 104.

22. Gudbergsson, JM; Йонсон, К.; Simonsen, JB; Johnsen, KB Систематичен преглед на целеви извънклетъчни везикули за доставяне на лекарства – Съображения относно методологичната и биологичната хетерогенност.J. Контролиран Освобождаване 2019, 306, 108- 120,

23. Абделхамид, HN; Sharmoukh, W. Вътрешен MOFzyme, имитиращ каталаза, за чувствително откриване на водороден пероксид и железни йони.Microchem. J. 2021, 163, 105873,

24. Юсеф, MS; Абделхамид, HN; Идалго, М.; Фати, Р.; GómezGascón, L.; Dorado, J. Антимикробна активност на наночастици от сребърен въглерод върху бактериалната флора на бича сперма.Териогенология 2021, 161, 219- 227,

25. Абделхамид, HN; Махмуд, GA-E.; Sharmouk, W. Базиран на церий MOFzyme с мулти-ензимна активност за разрушаване и инхибиране на гъбичната реколонизация.Журнал на Материали Химия B 2020, 8, 7548-7556,

26. Зулфайри, М.; Абделхамид, HN; Sudewi, S.; Даялан, С.; Rasool, A.; Хабиб, А.; Huang, GG Въглеродни точки, получени от части от растения за биосензиране.Биосензори 2020, 10,