Атенюиращи ефекти на Диекол върху хипертонична нефропатия при спонтанно хипертонични плъхове

Ang II индуцира вазоконстрикция и вследствие на това предизвиква хипертония [30]. При хипертония RAAS се активира системно, а upregulation на RAAS се придружава в няколко органа, катобъбрек[31,32]. Хиперактивацията на интрареналния RAAS е важен механизъм на хипертония и хроничнабъбречно заболяване[31,32]. Както TGFβ1, така и Ang II индуцират активирането на интрареналния RAAS и засилват изразите на ангиотензиноген, ренин, АСЕ и AT1R, които индуцират EMT [33]. В нашето проучване систоличният BP на СРБ е значително понижен от прилагането или на ИКЕ, или на ДК. Серумното ниво на Ang II на СРБ е значително понижено чрез прилагането или на ИКЕ, или на DK. Изразяването на AT1R в кората и медулата на СРБ е значително намалено от прилагането или на ИКЕ, или на DK.

Upregulation на RAAS, като увеличения израз на AT1R, активира надолу сигналния път на TGFβ1 [34]. Активиран от RAAS, TGFβ1 индуцира EMT чрез зависимите от SMAD и SMAD-независими пътища [33]. Като зависим от SMAD път за сигнализация, TGFβ1 сигнализацията се превежда чрез TGFβRII и TGFβRI и води до активиране на SMAD2/3. [10]. SMAD4 се свързва със SMAD2/3 и насърчава транслокацията на комплекса SMAD в ядрото [10]. Транслоцирани SMADs upregulate изразите на EMT гени, като Охлюв, Обрат, и ZEB [34]. В нашето проучване, изразяването на AT1R е значително по-висока в кората и медулата на СРБ от тази на WKY плъхове, и е намален от прилагането или на ECE или DK. Изразяването на TGFβ и SMAD2/3 в кората и медулата на СРБ е намалено чрез прилагането или на ИКЕ, или на DK.

CISTANCHE ще подобри бъбречната/бъбречна инфекция

ЕМТ се характеризира със загуба на епителен маркер, като E-кадерин, и постигането на мезенхимни маркери, като α-SMA, виментин, и фибронектин [35]. Електронният кадхерин е най-изразеният кадхерин в епителните клетки и по този начин често се използва като епителен маркер [36]. α-SMA е фенотипен маркер на миофибробластните клетки и изразяването му е характеристика на напредналите етапи на EMT [37]. α-SMA-изразяващи миофибробласти, които се подлагат на ЕМТ, предизвикват синтеза на прекомерно ECM и необичайно ремоделиране на ЕЦМ иБъбречнафиброза [37]. Хипертоничната нефропатия предизвиква гломерулосклероза и интерстициална фиброза, което предизвиква намаляване набъбречна функцияи значима протеинурия [6]. В нашето проучване изразяването на виментин и α-SMA в медулата и кората на СРБ е увеличено и е намалено от прилагането или на ИКЕ, или на DK. Количеството фиброзна област в медулата и кората на СРБ е увеличено, и то е намалено чрез прилагането или на ИКЕ, или на DK. Индексът на гломерулна склероза на СРБ е увеличен, и той е намален от прилагането или на ИКЕ или DK.

Обемът на урината на СРБ прогресивно намалява в сравнение с този на WKY плъховете на същата възраст [38]. Известно е, че толкова по-голяма е екскрецията на урината натрий, толкова по-малко е екскрецията на уринарния калий. Освен това, в проучванията при хора, съотношението на урината Na/K е свързано с повишаването на BP и бързото увреждане набъбречна функция[39]. В нашето проучване обемът на урината на СРБ е по-нисък от този на WKY плъховете, въпреки че количеството на приема на вода не е било различно между плъховете SHRs и WKY. Съотношението на урината Na/K на ShRs е значително различно сред WKY плъхове, SHRs, и ECE- или DK-лекувани групи. Съотношението на урината Na/K е използвано като маркер за хранителен прием на натрий и калий в човешки проучвания [39]. BP се увеличава с увеличаването на приема на натрий. Въпреки това, повишен прием на калий намалява BP чрез увеличаване на отделянето на натрий в урината [40]. Следователно, съотношението на урината Na/K е свързано с BP при хора [40]. В нашето проучване всички животни не са били хранени с високо-натриева диета, което обяснява защо съотношението на урината Na/K сред групите не показва никаква значителна разлика. Хипертонията има тенденция към повишаване на протеинурия [37]. Известно е, че съотношението на урината албумин към креатинин е свързано с намаляване на скоростта на гломерулна филтрация [41]. Предишни проучвания показват, че развитието на микроалбуминурия при СРБ е причинено от преобладаващо тръбно нараняване, което предизвиква загубата на урина на протеини с ниско молекулно тегло [42,43]. В нашето проучване съотношението на урината албумин към креатинин на СРБ е по-високо от това на WKY плъховете, и е намалено чрез прилагането или на ECE, или на DK

Предишни проучвания показват, че няколко полифеноли имат инхибиращ ефект върху Активността на АСЕ [14–17]. Въпреки това, тези изследвания само докладвани АСЕ инхибиторна активност като стойност IC50, което е 50% инхибиране концентрация на положителен контрол, и те не показват антихипертензивен ефект или предпазващ ефект срещу хипертонична нефропатия при животните. Едно проучване показва, че ИКЕ намалява BP в 2-бъбрекГолдблат хипертонични плъхове с 1 клип [44]. Пирогалол-хлороглуцинол-6,6-биекхол намалява BP във високомаслената диета индуцирана хипертония животински модел чрез модулиране на съдова дисфункция [45]. Въпреки това, тези проучвания показват само намалява bP и не оценява дали ECE показва някакъв ефект на атенюиране хипертонична нефропатия. Нашето проучване показва, че ECE и DK намаляват изразяването на AT1R/TGFβ/SMAD2/3 вбъбреки понижава серумното ниво на Ang II. Освен това ИКЕ и ДК намаляват ЕМТ,Бъбречнафиброза и гломерулна склероза. Изглежда, че ECE и DK може да са от полза за смекчаваща хипертонична нефропатия

4. Материали и методи

4.1. Подготовка на ИКЕ и изолация на ДК

ИКЕ са получени от Аква Грийн Технолоджи Ко ООД (Чеджу, Корея). Кавата E. е обилно измита с чиста вода и въздушно изсушена при стайна температура в продължение на 48 часа. То е било смляно, а 50% е добавен етанол, последван от отопление при 85 ♣C за 12 ч. ИКЕ са филтрирани и след това, когато са концентрирани, стерилизирани чрез нагряване при висока температура за 40 – 60 мин и след това се изсушават със спрей. Директорът, който е един от представителните флеротанини на Е. кава, след това е изолиран. За кратко се извършва центробежна преградна хроматография с помощта на двуфазна разтворителна система, която смесва чиста вода, етил ацетат, n-хексан и смес от метанол (съотношение 7:7:2:3). Органичната стационарна фаза е изпълнена в колоната и мобилната фаза е изпълнена в колоната, следвайки низходящия ред на процент на колегите (2 mL в минута) и е използвана за разделяне. Следвахме методите на д-р Сон и др. (2019) [45].

CISTANCHE ще подобри бъбречната/бъбречна недостатъчност

4.2. Хипертония Животински модел

МъжкиТЕ СРЗ (на 8 седмици) и мъжките WKY плъхове (на 8 седмици) са купени от Orient Bio (Sungnam, Korea) и се държат при постоянна температура от приблизително 24 C, относителна влажност от 50–55%, и лек/тъмен цикъл от 12 ч/12 ч. Сублимацията на плъховете е проведена в продължение на 1 седмица. Плъховете са били случайно разделени на шест групи (пет плъха на група): i) WKY група, в която плъховете са били перорално прилагани с питейна вода в продължение на 4 седмици; ii Група за ВПЧ, в която плъховете са били перорално прилагани с питейна вода в продължение на 4 седмици; (iii–v) SHR група, при която плъховете са били перорално приложени с ИКЕ от (iii) 50 mg/kg/ден, (iv) 100 mg/kg/ден, и (v) 150 mg/kg/ден в продължение на 4 седмици;  vi) SHR група, при която плъховете са прилагани перорално с 2,5 mg/kg/ден DK в продължение на 4 седмици. След 4 седмици консумацията на вода, обемът на урината и химическият анализ на урината са валидирани с метаболитна клетка за 24 ч. След приключване на метаболитния анализ, всички плъхове са пожертвали според етичните принципи на Комитета по институционална грижа за животните и употреба на Университета Гашон (номер на одобрение: LCDI-2019-0121).

4.3. Имунохистохимия

Бъбречна тъканпарафинови блокове са били сечени на 8 μm, поставени върху желатин-покритие пързалки, и изсушени на 37 ‡C в продължение на 3 дни. Theбъбректъканните пързалки са депарафинизирани и след това инкубирани с 0,3% водороден прекис (Сигма-Олдрих, МО, САЩ) за 10 мин. След това, слайдовете са изплакнати три пъти с фосфат-буфериран физиологичен разтвор (PBS), и инкубирани с животински серум за инхибиране на антитяло неспецифични свързване. Освен това, те са инкубирани с първични антитела (анти-AT1R, анти-Е-кадхерин, анти-α-SMA, и анти-виментин) и изплакват с PBS три пъти. След това тъканните пързалки са инкубирани с биотинилираните вторични антитела от комплекта ABC (Векторни лаборатории, Burlingame, CA,USA), инкубирани за 3 h с блокиращ разтвор, и се изплакват с PBS три пъти. Тъканните пързалки са разработени с 3,3-диаминобензидин като субстрат за 3 мин, монтиран с разтвор на DPX на основата на ксилен (Сигма-Олдрих), и визуализирани чрез лека микроскопия (Olympus Optical Co., Токио, Япония).

4.4. Извличане на РНК и количествена полимераза верижна реакция в реално време (qRT-PCR)

РНК от плъхабъбректъканите е изолиран с помощта на реагента RNAiso Plus (TAKARA, Япония) съгласно инструкциите на производителя. Theбъбректъканите първо са разделени на две части, а именно, частта на кората и частта с медулата. Бъбречните тъкани бяха фино нарязани и натрошени на прах, И праховете бяха ресуспендирани с 1 mL реагент RNAiso Plus, смесен с 0,1 mL чист гладе хлороформ (Amresco, Solon, OH, САЩ), а след това центрофугиран на 13 000× g за 20 мин при 4 ∗C. След центрофугиране супернатантът се смесва с 0,25 mL чист изопропилов алкохол glade, а извлечените РНК пелети се измиват със 70% алкохол и се центрофугират при 7500× g в продължение на 5 мин при 4 ‡C. Сушените пелети са разтворени в 10–30 μl диетилпирокарбонат обработена чиста вода, а РНК е количествено определена и проверена с помощта на NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, САЩ). Допълваща ДНК (cDNA) е приготвена от РНК с помощта на комплект за синтез на CDNA (PrimeScript™, TAKARA). Количествена полимераза верижна реакция в реално време (qRT-PCR) определя нивата на РНК отбъбрекТъкани. Форуърдните и обратните грундове бяха смесени с дестилирана вода, а след това 10 μl смеси бяха поставени в 384-добре qRT-PCR плоча. CDNA и SYBR зелено (TAKARA) впоследствие са добавени и след това валидирани с помощта на qRT-PCR машина (Bio-Rad, Hercules, CA, САЩ). Гените, които представляват интерес, са изброени в допълнителна таблица S1. Следвахме методите на д-р Сон и др.

4.5. Ензимно свързан имуносорбентен асай (ELISA)

За да се потвърди серумното ниво Ang II, в серумните сепараторни тръби (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, САЩ) е добавен аликвот от изтеглената кръв (1,5 до 1,7 mL) и след това се центрофугира на 2000× g за 20 мин при стайна температура. След това разделеният серум е преместен в нова тръба и се съхранява в дълбок фризер. Комплектът Ang II ELISA (MyBioSource, San Diego, CA, САЩ) е използван за анализ на наличието на серум според инструкциите на производителя. Ang II е измерен в рамките на 1 седмица след събиране на кръв от животните.

4.6. Хистологичен анализ

4.6.1. Трихромно (МТ) оцветяване на Масон

Трихромното (МТ) петно на Masson валидира фиброзата набъбрек.Блокове от вградени в парафинбъбректъканта са сечени на дебелина 8 μm, поставени върху пързалка за покритие, и се изсушават на 37 C в продължение на 3 дни. Тъканните пързалки бяха депарафинирани с ксилен и алкохол и бяха отново фиксирани с разтвора на Bouin за 24 ч и се изплакнаха с течаща чешмяна вода за 3 мин. Пързалките са потопени с разтвора на Weigert с железен хематоксилин за 10 мин и Разтвор на Бибрих скарлет-киселина фуксин за 15 мин и след това се диференцира с разтвор на фосфомолибдична–фосфотунгстична киселина за 10 мин. Накрая, слайдовете са прехвърлени към анилин син разтвор за 3 мин и след това се измиват с вода. Оцветените пързалки са монтирани с DPX разтвор на основата на ксилен (Sigma-Aldrich) и визуализирани чрез лека микроскопия (Olympus). Колагенните влакна изглежда са сини на цвят в областта на фиброзата, докатоБъбречнаепител изглежда е червен на цвят. Зоните за фиброза, оцветени в МТ, бяха измерени с помощта на софтуера ImageJ. Оригинални изображения на MT-оцветен бъбрек са превърнати в RGB изображения, а след това тези изображения са деконволвирани с помощта на софтуера ImageJ с помощта на приставката за деконволюция на цветовете.

4.6.2. Периодична киселина–Шиф (PAS) Оцветяване

Едно периодично киселинно–Шиф (PAS) оцветяване валидира гломерулното увреждане набъбрек. Блокове от вградени в парафинбъбректъканта са сечени на дебелина 8 μm, поставени върху пързалка за покритие, и се изсушават на 37 C в продължение на 3 дни. Тъканните пързалки бяха депарафинирани с ксилен и алкохол, хидратирани с вода, окислявани с 0,5% разтвор на периодична киселина за 5 мин, и измити с вода. Пързалките са потопени с реагента Шиф за 15 мин и след това се измиват с хладка чешмяна вода за 5 мин. Накрая, слайдовете са прехвърлени към хематоксилин разтвор на Майер за 1 мин и след това се измиват с вода. Оцветените пързалки са монтирани с DPX разтвор на основата на ксилен (Sigma-Aldrich) и визуализирани чрез лека микроскопия (Olympus).

Гломерули са избрани на случаен принцип, а гломерулното увреждане е оценено с помощта на полуколичествен метод за точкуване (степени 0–4) с помощта на PAS-оцветенибъбректъканни пързалки.

(1) Степен 0: нормални гломерули;  (2) Степен 1: минимална склероза (склеротична област до 25%);  (3) Степен 2: умерена склероза (склеротична област 25% до 50%);  (4) Степен 3: умерена–тежка склероза (склеротична област 50% до 75%);  (5) Степен 4: тежка склероза (склеротична област 75% до 100%);  Гломерулосклеротичният индекс (GSI) е изчислен с помощта на следното уравнение: (4 × n4) + (3 × n3) + (2 × n2) + (1 × n1) / n4 + n3 + n2 + n1 + n0, където n (x) е броят наБъбречнагломерулна склероза във всяка степен [46]. Този анализ е извършен в групите на лечение от маскиран наблюдател.

4.7. Систолично кръвно налягане, Диастолно кръвно налягане, и средни артериално кръвно налягане измервания

Систоличната BP, диастолична BP, и средната артериална BP са измерени с помощта на ненинвазивна CODA опашка-маншет система (Кент Научен корпус., Торингтън, CT, САЩ). Сублимацията на плъховете е проведена за 20 мин за 5 дни, а БП е измерена в последния ден.

4.8. In Vitro Моделиране използване на TCMK-1 клетки

TCMK-1 клетки, мишка проксимална тубулна клетъчна линия, са закупени от American Type Culture Collection (Вашингтон, DC, САЩ). Високо глюкоза Dulbecco модифициран орел среда (Gibco; Grand Island, NY, САЩ), 10% плода говежди серум (FBS) и 1% пеницилин-стрептомицин са били използвани като култура среди. За валидиране на инхибиторните ефекти на ECE и DK в лекуваните с ангиотензин II TCMK-1 клетки, Лекувахме ECE (5, 25, 50 μg/mL) и DK (1,8 μg/mL) със 100 nmol/L ангиотензин II (Сигма-Олдрих, Сейнт Луис, МО, САЩ) за 12 часа. Телмисартан (1 μmol/L, Sigma-Aldrich) е използван за AT1 рецепторен антагонист и се лекува предварително преди ангиотензин II за 3 h [47].

CISTANCHE ще подобри бъбречната/бъбречната болка

4.9. Приготвяне на протеин и западно блутинг

За изолиране на протеин от ангиотензин II-третирани TCMK-1 клетки, клетките са били остъргани с помощта на RIPA лизис буфер с фосфатаза и протеиназа инхибитор (EzRIPA; ATTO; Токио, Япония) и инкубирани на лед за 20 мин. След центрофугиране при 13 000× g в продължение на 20 мин, при 4 C чистите супернатанти са преместени в нова тръба и концентрацията на супернатанти е анализирана с комплект за оценка на бицинхонинова киселина (комплект BCA; Термо Фишър Научен, Inc.; Уолтам, MA, САЩ). За да се валидира протеин експресията от TCMK-1 клетки, е проведено блутиране. Равно количество лизат протеини (30 μg/lane) е отделено с 10% натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел с помощта на електрофореза. След това, течащи протеини са прехвърлени на поливинилиден флуоридни мембрани, които са инкубирани с разредени първични антитела (Anti-β-актин, AGTR1, TGF-β, SMAD2/3 и pSMAD2/3) при 4 C. Инкубираните мембрани с антитела са обилно измити с помощта на трис-буфериран физиологичен разтвор с 0,1% Tween 20 и инкубирани с вторични антитела за 2 h при стайна температура. Всички мембрани са разработени чрез засилено chemiluminescence (LAS-4000s; GE Здравеопазване, Чикаго, IL, САЩ). Информацията за антителата, използвана в това проучване, може да бъде намерена в таблица S2.

4.10. Статистически анализ

Резултатите са представени като средни ± SD, а p-стойностите на<0.05 mean="" it="" is="" statistically="" significant.="" the="" kruskal–wallis="" test="" was="" used="" to="" validate="" the="" differences="" among="" the="" groups,="" and="" the="" mann–whitney="" u="" test="" was="" used="" in="" the="" spss="" ver.="" 22="" software="" (ibm="" corporation;="" ny,="" armonk,="" usa)="" completed="" post="" hoc="" comparisons.="" means="" denoted="" by="" a="" different="" letter="" indicate="" significant="" differences="" between="">

5. Заключения

В заключение, AT1R е upregulated в СРБ, а сигналният път увеличава TGFβ и SMAD2 или 3, което индуцира EMT. Или ECE, или DK надолу регулира пътя на сигнала и намалява EMT. Поради това ECE или DK намаляват мезенхимните клетъчни маркери като изразяването на виментин и α-SMA, фиброзната тъкан набъбрек, и съотношението на урината албумин/креатинин и атенюира EMT. Освен товаБъбречнафиброза доведе до възстановяване набъбречна функция(Фигура 7).