Отслабване на експериментален автоимунен увеит при плъхове Lewis от бетаин

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Експериментален автоимунен увеит (EAU) е животински модел на човешки автоимунен увеит, който се характеризира с инфилтрация на автоимунни Т-клетки с едновременно повишаване на провъзпалителните цитокини и реактивни кислородни видове. Това проучване имаше за цел да оцени дали бетаинът регулира прогресията на EAU при плъхове Lewis. EAU се индуцира чрез имунизация с интерфоторецепторния ретиноид-свързващ протеин (IRBP) и орално приложение или на носител, или на бетаин (100 mg/kg) в продължение на 9 последователни дни. Далаците, кръвта и ретината са взети проби от експерименталните плъхове по време на умъртвяването и са използвани за анализ на Т клетъчна пролиферация, серологичен анализ, полимеразна верижна реакция в реално време и имунохистохимия. Анализът на Т-клетъчната пролиферация разкрива, че бетаинът има малък ефект върху пролиферацията на далачните Т-клетки срещу IRBP антигена в in vitro анализ на ден 9 след имунизацията. Серологичният анализ показва, че нивото на серумната супероксид дисмутаза се повишава в групата, лекувана с бетаин, в сравнение с тази в групата, лекувана с носител.екстракт от Cistanche tubulosaПротивовъзпалителният ефект на бетаина се потвърждава от понижаването на провъзпалителните молекули, включително адхезионна молекула I на васкуларни клетки и интерлевкин-1 в ретината на плъхове с EAU. Хистопатологичните находки съвпадат с тези от имунохистохимията на йонизирана калций-свързваща адапторна молекула l, което допълнително потвърждава, че възпалението в ретината и цилиарните тела е значително потиснато в групата, лекувана с бетаин, в сравнение с групата, третирана с носител. Резултатите от настоящото проучване предполагат, че бетаинът участва в смекчаването на EAU чрез антиокислителни и противовъзпалителни дейности.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Ключови думи:Противовъзпалително, Антиокислително, Бетаин, Експериментален автоимунен увеит, Ретина

Въведение

Насочването на автореактивни Т клетки и инфилтрация на възпалителни клетки, като моноцити, предизвикват увеит и ретинит в EAU [6]. Ретината е увредена от възпаление с активиране на глиални клетки, които са подложени на оксидативен стрес [7].

Бетаинът, наричан още триметилглицин (CH: NO:), е алкалоид и нетоксично естествено вещество от Fructus Lycia и представително антиоксидантно вещество [8]. Бетаинът подобрява свързаното с възрастта възпаление при плъхове чрез участието на ядрен фактор-kB чрез индуцираща ядрен фактор киназа/I капа В киназа и митоген-активирани протеин кинази [9], сърдечно-съдови заболявания при хора чрез потискане на възпалителни цитокини, включително интерлевкин (IL){{ 6}} и фактор на туморна некроза-a(TNF-a)[10], и индуцирана от декстран сулфат натрий туморогенеза на дебелото черво [11].прегледи на cistanche tubulosa,В допълнение, бетаинът предотвратява патологична ангиогенеза/неоваскуларизация при плъхове с диабетен ретинит [12] и защитава ганглийните клетки на ретината, за да увеличи зрителната острота при животински модел на глаукома [13]. Въпреки това, малко се знае за точните механизми, които са в основата на ефектите на бетаин при увеит.

В това проучване е оценена ефикасността на бетаина за облекчаване на EAU. Изследвахме противовъзпалителния ефект на бетаин в EAU въз основа на хистопатологично изследване и измервания на цитокини. Освен това, специфичният механизъм на бетаин като антиоксидант е оценен при плъхове с EAU.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Животни

И двата пола плъхове Lewis (на възраст 7~9 седмици; Orient Bio Inc, Gyeonggi-do, Корея) бяха настанени в нашето съоръжение при лабораторни условия (12-h цикъл светлина/тъмнина, температура 23±2 градуса). Всички експериментални процедури бяха извършени в съответствие с Насоките за грижа и използване на лабораторни животни на Националния университет Джеджу (номер на разрешение: 2020-0012). Всички протоколи за животни са в съответствие с международните закони и политиките на NIH, включително грижата и използването на лабораторни животни (публикация на NIH № 85-23, 1985 г., ревизирана 1996 г.).

Индукция на EAU

Плъховете бяха имунизирани с 200 ul смесена емулсия, съставена от равен обем говежди интерфоторецепторен ретиноид-свързващ протеин (IRBP) (I mg/ml; PTARSVGAADGSS-WEGVGVVPDV, Komabiotech, Сеул, Република Корея) и пълен адювант на Freund (CFA )допълнени с mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories Inc., Детройт, Мичиган, САЩ) върху стъпалата на задните им крайници.

Експериментални групи

За да се оценят ефектите на бетаин (Фигура 1A) върху EAU, четири експериментални групи бяха определени, както следва: нормална контрола (n=8); CFA контрол (n=8);EAU плюс носител (n=8);и EAU плюс бетаин(n=8). Дозата в лечението за тестване на терапевтичния ефект на бетаин(1 0 mg/kg телесно тегло/ден, B2629, Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) е избран въз основа на предишно проучване [14]. Плъховете са третирани орално с бетаин от ден 0 след имунизацията до ден 9 след имунизацията.

Подготовка на тъканите

Плъховете бяха умъртвени под дълбока анестезия чрез вдишване на CO2 газ на 9-ия ден след имунизацията.cistanche ВеликобританияТъканите за хистопатологичното изследване се поставят в парафинов восък и се разделят

с микротом (RM 2135; Leica, Nussloch, Германия) до дебелина 5 um и оцветени с хематоксилин и еозин. Кръвта и ретината се съхраняват при -80 степен за анализ на серума и анализ на полимеразна верижна реакция (PCR) в реално време.

Анализ на Т клетъчна пролиферация

Мононуклеарните клетки на далака от животните във всяка група бяха дисоциирани и суспендирани, както е описано в нашето предишно проучване [15]. След това към ямките се добавят 10 ug/ml IRBP (крайна концентрация). След 48 часа стимулация с IRBP, клетките се инкубират в 1 μCi от 'Н-метил тимидин (специфична активност 42 Ci/mmol); Амершам, Арлингтън Хайтс, Илинойс, САЩ) за 18 часа. След това клетките бяха събрани за измерване на включването на тимидин.

Cistanche може да спре стареенето

Серологичен анализ

Плъховете бяха умъртвени на датата на вземане на проби и кръвта беше събрана през сърцето. Пробите от цяла кръв бяха разделени на серум и кръвни клетки с помощта на центрофуга (VS-5500CFN; Vision Scientific, Daejeon, Република Корея). Активността на супероксид дисмутаза (SOD) в серума беше оценена с помощта на комплект SOD (ab65354; Abcam, Cambridge, UK).

Имунохистохимия

Имунохистохимията беше извършена, като се използва същият протокол като този, описан в предишното ни проучване [16]. Първичните антитела, включително йонизирана калций-свързваща адаптерна молекула (Ibal) (1:1, 000; 019-19741, Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Осака, Япония), CD68(ED1;1:800;MCA341,Serotec,Kidlington,UK) и глутамин синтетаза(GS)(1:5,000;MAB302,Chemicon In -international, Temecula, Калифорния, САЩ) бяха използвани като маркер съответно за микроглия, макрофаг и клетка на Мюлер.

PCR в реално време

Общата РНК в очните ябълки във всички групи (n=5 на група) се изолира с TRIzol RNA Isolation Reagent (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния, САЩ) и cDNA се приготвя с помощта на CellScript M All-in -Една 5X първа стандартна основна смес за синтез на cDNA (CellSafe, Gyeonggi-do, Република Корея). Информацията за праймера е посочена в Таблица 1. PCR се извършва с MIC циклиращ апарат (BMS, Куинсланд, Австралия), като се използва 2x SYBR Green (PhileKorea, Сеул, Република Корея) и следната програма: 55 цикъла на денатурация (5 s, 95 степен), отгряване (20 s, 60 градуса) и удължаване (10s, 72 градуса).

Western blot анализ

Анализът на Western blot беше извършен по същия протокол като този, описан в нашето предишно проучване [16].cistanche wirkungПървичните антитела, включително Kelch-подобен ECH-асоцииран протеин 1 (Keap1)(1:1,000;abl19403,abcam, MA,САЩ), и фактор 2(Nrf2), свързан с ядрен фактор еритроиден-2- )(1:1,000;sc-722,Санта Круз,Калифорния,САЩ).

Статистически анализ

Всички измервания се отчитат като средна стойност от три независими експеримента. Всички стойности са представени като средна стандартна грешка на средната стойност (SEM). Резултатите бяха анализирани с помощта на еднопосочен анализ на дисперсията, последван от posthoc теста на Student-Newman-Keuls за множество сравнения. p-стойност<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" significance.="" immunostaining="" was="" analyzed="" semi-quantitatively="" based="" on="" the="" positive="" areas="" in="" the="" photographs="" using="" imagej="" software="" (national="" institutes="" of="" health,="" bethesda,="" md,="" usa).eau="" was="" histopathologically="" evaluated="" using="" a="" method="" modified="" from="" a="" previous="" study="" [17].="" antibody-positive="" areas="" were="" measured="" as="" follows:(1)three="" different="" sections="" from="" each="" rat="" (n="3" animals="" per="" group)="" were="" used;="" then,="" (2)="" the="" percentage="" of="" the="" stained="" area="" [(positive="" area/total="" area)x100(%)]="" was="" calculated.="" the="" total="" area="" included="" all="" layers="" of="" the="" retina.="" these="" results="" are="" presented="" as="" the="">

РЕЗУЛТАТИ

Betaine had no immunomodulatory function in EAU The T cell proliferation assay was performed to determine whether betaine affected the proliferation of IRBP-specific T cells (Fig.1B). No significant changes were observed between the EAU-induced groups in medium only and those that were IRBP-stim-ulated (medium only, p>0.05 vs.EAU+Vehicle; IRBP stimulation, p>0.05 срещу ЕАУ плюс превозно средство). Тези данни показват, че бетаинът не е свързан с IRBP-специфични Т клетки или тяхната автореактивност.

Бетаинът повишава серумните нива на SOD в EAU

Ние оценихме окислителното увреждане в серума, използвайки SOD като маркер за окислителна модификация. Не се наблюдава значителна разлика между нормалните и CFA групите. Активността на SOD намалява значително в групата EAU плюс Vehicle, в сравнение с нивата в групите с нормална контрола и CFA. Третирането с бетаин значително възстановява нивото на SOD активност до това на нормалната контрола и CFA групите (фиг. 2). Този резултат показва, че лечението с бетаин потиска оксидативния стрес при плъхове с EAU.

Бетаинът намалява инфилтрацията на Ibal-положителни клетки в цилиарните тела и ретината на EAU-индуцирани плъхове

Цилиарното тяло е основното място на възпалителна клетъчна инфилтрация поради изобилието от кръвоносни съдове [18]. Само няколко клетки от кръгъл тип бяха открити в цилиарните тела в нормалните и CFA групи (фиг. 3A, 3B), докато инфилтрацията на някои клетки от кръгъл тип беше потвърдена в EAU-индуцираните групи (стрелки на фиг. 3C ,3D). Нормалните (фиг. 3E) и CFA (фиг. 3F) групи последователно показват подобни резултати на тези, наблюдавани за имунореактивност на Ibal. Ibal-позитивната имунореактивност се увеличава в групите EAU плюс носител и EAU плюс бетаин (стрелки на фиг. 3G, 3H). Въпреки това, броят на Ibal-позитивните клетки намалява значително в групата на EAU плюс бетаин в сравнение с групата на EAU плюс носител (фиг. 3I). Ние също анализирахме локализацията на EDI като допълнителен подход за оценка на точното местоположение на възпалителната клетъчна инфилтрация в цилиарното тяло. ED1-положителните клетки рядко се откриват в нормалните (Фиг. 3G) и CFA (Фиг. 3K ) групи. Обратно, многобройни ED{19}}положителни клетки бяха открити в групите EAU плюс Vehicle и EAU плюс бетаин (двойни върхове на стрелки на Фиг.3L,3M).цитрусови биофлавоноидиПолуколичествен анализ на броя на ED1-положителните клетки потвърди, че лечението с бетаин потиска инфилтрацията на възпалителни клетки в цилиарните тела на EAU-индуцирани плъхове.

След това изследвахме хистопатологични промени в ретината (фиг. 4). Няколко възпалителни клетки бяха открити в ретината с EAU, но не и в нормалната и CFA ретината на плъх (Фиг.4A~4D). Лезиите бяха оценени хистопатологично според тежестта на EAU [17], разкривайки облекчаване на възпалението на ретината (Фигура 4E). Микроглиална и клетъчна активация на Мюлер, показващи възпаление на ретината, бяха потвърдени въз основа на глобална (Фиг.4F~4I) и GS имунореактивност (Фиг.4K~4N), съответно. Локализацията на Ibal в микроглията е много рядка в нормалните и CFA групите (съответно върхове на стрелки на фиг. 4F, 4G). Активирането на микроглия се инхибира при EAU плъхове (стрелки на Фиг. 4H) чрез лечение с бетаин (Фиг. 4I, 4J). GS-позитивният резултат от имунореактивност е подобен на този на глобалната в ретината (Фигура 4K~4N). Активираните клетки на Мюлер в групата EAU плюс Vehicle имат по-ниски нива на GS-имунореактивност (Фиг. 40).

Бетаинът потиска адхезионната молекула и провъзпалителните медиатори в EAU

След това изследвахме експресията на адхезионна молекула, използвайки PCR в реално време (фиг. 5А). Наблюдава се рязко намаляване на нивото на мРНК на молекулата на адхезията на васкуларните клетки 1(VCAM1) в групата на EAU плюс бетаин (p<0.05 vs.eau+vehicle).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,interleukin-1β(il-1β),="" tumor="" necrosis="" factor-alpha="" (tnf-a),="" inducible="" nitric="" oxide="" synthase(inos),="" and="" cyclooxygenase="" at-2(cox-2)as="" pro-inflammatory="" mediators,="" were="" assessed="" to="" confirm="" the="" inflammatory="" condition="" (fig.="" 5b).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,="" il-1β,="" tnf-a,="" cox-2="" were="" significantly="" downregulated="" in="" the="" eau+betaine="" group="" compared="" with="" that="" of="" vehicle-treated="" eau="" group="" (fig.5b).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" betaine="" treatment="" suppressed="" the="" upregulation="" of="" pro-inflammatory="">

Бетаинът повишава антиоксидантните ензими каталаза (CAT) и SODinEAU

Изследването на нивата на окислително увреждане в серума ни подтикна да изследваме статуса на антиоксидантния отговор на антиоксидантните ензими, включително CAT, SOD1, SOD2 и SOD3 (фиг. 5C). Наблюдавахме значително повишени нива на експресия на CAT, SOD1, SOD2 и SOD3 в очните ябълки на групата EAU плюс бетаин в сравнение с групата EAU плюс Vehicle.

Бетаинът активира пътя Keapl-Nrf2

За да се подкрепи антиоксидантният ефект на бетаина, беше изследван пътят на Keapl-Nrf2 (фиг. 6). Протеиновите нива на Keapl (0.75±0.05 пъти промени, p<0.05,fig.6a)and nrf2(0.79±0.04fold=""><0.05,fig.6b)in eau+vehicle="" group="" were="">

в сравнение с нормалния контрол. От друга страна, Keapl и Nrf2 показаха или 1,46±0.00 кратни промени, или 1,13±0.34 кратни промени спрямо тези на групата EAU плюс Vehide (p<0.01 and=""><0.001,>

ДИСКУСИЯ

Това е първото проучване, съобщаващо, че бетаинът смекчава прогресията на EAU патогенезата чрез противовъзпалителни и антиоксидантни ефекти, но не и чрез потискане на пролиферацията на Т клетките (Схематична илюстрация на Фиг.7).

Смята се, че регулаторният ефект на бетаин при автоимунни заболявания, както е доказано с помощта на EAU, прототип на автоимунно заболяване, се дължи на намаляването на оксидативния стрес и провъзпалителните медиатори, но не и на Т клетъчната пролиферация от бетаин [19]. По същия начин, настоящото проучване разкри, че бетаинът има малък ефект върху Т клетъчната пролиферация и цитокиновия профил в културалния супернатант в EAU модел, което предполага, че бетаинът не влияе върху имунния отговор на пролиферацията на автоимунни Т клетки в EAU. Увеята е целеви орган в EAU. Увеята и ретината са имунологично изолирани органи без лимфа [20]. Автоимунните Т клетки в EAU се нахлуват през клон на цилиарните и офталмичните артерии [21]. Оксидативният стрес е критичен сигнал за прогресирането на възпалителния отговор и повишените реактивни кислородни видове причиняват ендотелна дисфункция и тъканно увреждане [22]. Нарушените ендотелни клетки водят до насърчаване на преминаването на възпалителни клетки и възпалителни молекули [22]. Възпалителни медиатори и клетки в увеята се задействат в пигментните епителни клетки на ретината, които нарушават връзките между пръчковидни и конусовидни клетки и пигментирани епителни клетки, което води до отлепена ретина [23]. Цилиарното тяло е входно място за очно възпаление. Типичното възпаление на ретината участва в активирането на резидентна микроглия и инфилтрацията на възпалителни клетки поради разпадането на бариерата кръв-ретина [24]. При невропатологични състояния, включително мозъчни тумори [25], аксотомия [26] и вирусна инфекция [27], активираните макрофаги и микроглия бяха разграничени от Ibal. В допълнение, активираните резидентни микроглии участват в патологичните промени, настъпващи при дегенеративни заболявания на ретината, и освобождават възпалителни медиатори, които изострят болестния процес [28]. Тези резултати предполагат, че бетаинът упражнява противовъзпалителни ефекти в увеята и цилиарното тяло, основните цели на EAU, и може да намали оксидативния стрес в серума. Точният механизъм обаче предстои да бъде проучен.

Активираната микроглия е основният източник на провъзпалителни цитокини при дегенеративни състояния на ретината [29]. Провъзпалителните цитокини, включително IL и TNF, са силно свързани с очно възпаление [30] и ретинит [6,29]. Освен микроглията, клетките на Мюлер се активират при всички патологични събития, които се случват в ретината [31]. Активираните клетки на Мюлер участват в невровъзпалителния ефект в ретината чрез синтезиране и освобождаване на свързани с възпалението молекули [31]. Ние постулираме, че бетаинът смекчава възпалителния отговор при EAU-индуцирани плъхове чрез потискане на активирането на микроглията и клетките на Мюлер. Повишената регулация на VCAM1 е силно включена в инфилтрацията на възпалителни клетки [32]. VCAM1 се ускорява до CD4 Tlym-фагоцити чрез кръстосани разговори с късния антиген -4[3]. В допълнение, Serpina3n, ензим, който инициира възпаление [34], е открито в клетки на Мюлер, астроцити и пигментен епител на ретината на увредени от светлина ретини [35] и има значително променливи нива в ретината на Nrl'мишка с увредени конусовидни клетки [36]. Serpina3n се повишава в EAU плъхове с тежко възпаление на ретината, но намалява значително в EAU групата, лекувана с бетаин. Подобна констатация е докладвана за шизофрения с невровъзпаление [34], тъй като мишият Serpina3n е ортолог на човешкия Serpina3 [37]. Освен това се наблюдава увеличение на IL-1 при увреждане на ретината, предизвикано от високо съдържание на фруктоза [38]. Ние постулираме, че противовъзпалителният ефект на бетаина е свързан с понижаване на VCAM1, Serpina3n и IL-1 при EAU-индуцирани плъхове. Пътят Keep-Nrf2 се използва за наблюдение на оксидативния стрес [39]. Бетаинът е известен като антиоксидантна молекула, която е свързана с пътя Keapl-Nrf2 в модела на индуцирано от ацетаминофен остро чернодробно увреждане [40]. Освен това, профилирането на чернодробната генна експресия беше извършено след лечение с 3H-1,2-дитиол-3-тион, което има ролята на засилване на детоксикацията на канцерогените и защита срещу неоплазия [4]. Резултатът от това профилиране разкрива, че Keap1-Nrf2 регулира nrf2-зависимия 3H-1,2-дитиол-3-тион-индуцируем ген, включително AF033381, като бетаин хомоцистеин метил трансфераза, се повишава и участва в детоксикацията и антиоксиданта [41]. Възпалителният отговор в EAU се индуцира от инфилтрация на възпалителни клетки, като Т клетки и макрофаги [42], и производство на оксидативен стрес, особено във фоторецепторните митохондрии на ранен етап [43]. Според тези резултати лечението с бетаин е кандидат за облекчаване на предизвиканото от EAU увреждане на тъканите чрез модулиране на пътя Keap1-Nrf2, като ключов път за регулиране на оксидативния стрес.

Антиоксидантният ефект на бетаина е широко оценен в модели на увреждане, предизвикано от радикали [44]. В индуцираното от леводопа оксидативно увреждане на мозъка бетаинът е повишен до нивата на CAT и SOD, които са представителни антиоксидантни ензими [4]. SOD1, SOD2 и SOD3 се активират по различни механизми и са локализирани съответно в цитоплазмата, митохондриите и извънклетъчния матрикс [45]. Бетаинът, като антиоксидантна молекула, участва в намаляването на окислителното увреждане [46]. Намаленият оксидативен стрес беше разширен до разрешаване на възпалението, посочено от Ibal-положителни макрофаги/микроглия при много заболявания, включително болестта на Алцхаймер, болестта на Паркинсон и множествената склероза [47]. Лечението с бетаин беше регулирано нагоре до нивата на иРНК на маркера за оксидативен стрес, в сравнение с тези в групата EAU плюс Vehicle. Този резултат предполага, че лечението с бетаин намалява оксидативния стрес в кръвоносната система, без да пречи на Т клетъчната пролиферация в имунните органи на EAU модел на плъх.

Взети заедно, настоящото изследване предполага, че бетаинът може да смекчи възпалението в ретината и цилиарните тела на EAU-индуцирани плъхове, вероятно чрез антиокислителни и противовъзпалителни механизми.

Тази статия е извлечена от https://doi.org/10.5607/en21011