Бактериалните външни мембранни везикули индуцират транскрипционно изместване в Arabidopsis към активиране на имунната система, което води до потискане на растежа на патогени в Planta

Резюме

Грам-отрицателните бактерии образуват сферични мехурчета по клетъчната си периферия, които по-късно се отделят от бактериалната клетъчна стена, за да образуват извънклетъчни везикули. Доказано е, че тези наномащабни структури, известни като външни мембранни везикули (OMVs), насърчават инфекцията и заболяването и могат да индуцират типични имунни резултати както при бозайници, така и при растения гостоприемници. За да разберем по-добре широката транскрипционна промяна, която растенията претърпяват след излагане на OMV, ние третирахме разсад на Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) с OMV, пречистени от грам-отрицателната растителна патогенна бактерия Xanthomonas campestris pv. campestris и извършва RNA-seq анализ на OMV и фалшиво третирани растения на 2, 6 и 24 часа след предизвикване. Най-изразената транскрипционна промяна се наблюдава в първите две тествани времеви точки, както е отразено от броя на диференциално експресираните гени и средната промяна на пъти. OMV индуцират голяма транскрипционна промяна към активиране на имунната система, регулирайки нагоре множество имуно-свързани пътища, включително различни имунни рецептори. Сравняването на реакцията на Arabidopsis към OMVs и към пречистени елиситори разкри, че OMV индуцират подобен набор от гени и пътища като единични елиситори, но са открити пътища, активирани от OMV, а не от други елиситори. Предварителното третиране на растения Arabidopsis с OMV и последващото им заразяване с бактериален патоген доведе до значително намаляване на растежа на патогена. Мутациите в рецептора на фактора на удължаване на растенията (EFR), флагелиновия рецептор (FLS2) или ко-рецептора на нечувствителния към брасиностероиди 1-свързан киназа (BAK1) не повлияват значително имунния първичен ефект на OMV. Заедно тези резултати показват, че OMV индуцират широка транскрипционна промяна в Arabidopsis, водеща до регулиране на множество имунни пътища и че тази транскрипционна промяна може да улесни резистентността към бактериална инфекция.

КЛЮЧОВИ ДУМИ

Arabidopsis thaliana, бактериална инфекция, екстрацелуларни везикули, OMVs, външни мембранни везикули, растителен имунитет, RNA-seq, Xanthomonas campestris pv. campestris

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

1. ВЪВЕДЕНИЕ

Растенията непрекъснато се сблъскват с вредни микроби, които виреят в техните тъкани и възпрепятстват нормалния растеж. Ефективната защитна реакция зависи до голяма степен от бързото и точно откриване и идентифициране на нахлуващия микроб. За тази цел растенията използват широки системи за наблюдение, за да следят за инвазия на патогени (Cook et al., 2015). Спекулира се, че първата линия на системата за наблюдение на растенията или първият клетъчен интерфейс, където растенията и микробите взаимодействат, е междуклетъчното пространство, апопластът. Там разпознаването на нахлуващите микроби се медиира от мембранно свързани, извънклетъчно изложени рецептори за разпознаване на образи (PRR) (Boutrot & Zipfel, 2017; Couto & Zipfel, 2016). PRR разпознават микробни детерминанти, които са широко присъстващи и запазени сред много микроби и са известни като свързани с микроби или патогени молекулярни модели (MAMP) (Ranf et al., 2016). Тъй като микробите се подлагат на мутагенеза с бързи темпове, еволюционно полезните имунни рецептори са адаптирани да откриват силно запазени региони на ключови микробни компоненти, които не могат лесно да бъдат изхвърлени или мутирани поради сериозни разходи за годност. Например, бактериалният флагелин е решаващ елемент във физиологията на много микроби, включително патогени, и в момента е един от най-добре проучените MAMP (Felix et al., 1999; Zipfel et al., 2004). Възприемането на флагелин или синтетичния епитоп flg22 (състоящ се от силно запазени 22 аминокиселини в N-края на изграждащия блок на флагелума, флагелин), от родствения растителен имунен рецептор за флагелин сензор 2 (FLS2), води до голяма транскрипционна промяна , последвано от ефективен имунен отговор, който спира инфекцията (Chinchilla et al., 2007; Gómez-Gómez & Boller, 2000). Много известни MAMP са свързани с клетъчната стена на микроба. Например гъбичен хитин (Fesel & Zuccaro, 2016), бактериален пептидогликан (PG) (Erbs et al., 2008; Gust et al., 2007), бактериални липополизахариди (LPS) (Dow et al., 2000; Silipo et al. ., 2005), флагелин (Boutrot & Zipfel, 2017; Felix et al., 1999) и др. Въпреки това, не е съвсем ясно как тези компоненти, свързани с клетъчната стена, взаимодействат с техните родствени имунни рецептори в planta. Дали това се случва поради клетъчна смърт и/или разграждане на клетъчната стена, или чрез активно освобождаване на компоненти като флагела, е тема, която се нуждае от допълнително изследване (Bahar, 2020).

Пример за активно освобождаване на фрагменти от клетъчна стена от грам-отрицателни бактерии е отделянето на екстрацелуларни везикули (EVs), които се отделят от външната мембрана и се отделят в околната среда (Kulp & Kuehn 2010; Théry et al., 2018). ). Тези бактериални EVs обикновено се наричат ​​външни мембранни везикули (OMVs) и отсега нататък ще се придържаме към тази номенклатура (Schwechheimer & Kuehn, 2015). Процесът на освобождаване на OMV протича непрекъснато и при различни условия на околната среда, включително по време на колонизацията на гостоприемника (Gurung et al., 2011; Ionescu et al., 2014; Jin et al., 2011). В допълнение към интегралните молекули на външната мембрана, като протеини на външната мембрана (OM), LPS и липиди, OMV капсулират периплазмени течности, състоящи се от разнообразен набор от молекули като протеини, ензими, разграждащи клетъчната стена, полизахариди и нуклеинови киселини (Kuehn & Кести, 2005). Тъй като OMVs се освобождават по време на колонизацията на гостоприемника и тъй като техният товар се състои от MAMPs, е изкушаващо да се спекулира, че те действат като носители на имунни стимулатори, доставящи предизвикващите молекули в непосредствена близост до техните родствени имунни рецептори (Bahar, 2020; Katsir & Bahar, 2017). Наистина е доказано, че OMV индуцират имунната система както на бозайниците, така и на растенията, когато са представени на техните гостоприемници (Bahar et al., 2016; Ellis & Kuehn, 2010; Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). Докато в клетките на бозайниците LPS и протеиновите компоненти на OMVs действат като имунни стимулатори (Ellis et al., 2010), в растенията все още не е ясно кои OMV молекули са основните имунни стимулатори.

В допълнение към модулирането на имунния отговор на гостоприемника, OMV също беше показано, че носят вирулентни фактори и участват в множество процеси. Това включва клетъчно-клетъчна комуникация (Deatheragea & Cooksona, 2012; Mashburn & Whiteley, 2005; Raposo & Stahl, 2019), доставка на токсини до целевите клетки (Ellis & Kuehn, 2010; Kadurugamuwa & Beveridge, 1996), образуване на биофилм (Schooling & Beveridge, 2006), потискане на антимикробни съединения (Manning & Kuehn, 2011), отговор на стрес (MacDonald & Kuehn, 2013), хоризонтален генен трансфер (Fulsundar et al., 2014; Velimirov & Ranftler, 2018) и вирулентност (Ellis & Kuehn, 2010; Kunsmann и др., 2015). Докато повечето от тези примери идват от проучвания на бактериални патогени от бозайници, последните проучвания с растителни патогенни бактерии също подкрепят, че OMV насърчават бактериалната вирулентност и колонизацията на растенията. Йонеску и др. (Ionescu et al., 2014) показаха, че производството на OMV от растителния патоген Xylella fastidiosa по време на колонизацията на ксилемния съд инхибира бактериалното прикрепване към водопроводимите елементи на растението (ксилемата), нарушавайки баланса между сесилните и подвижните форми на патоген към подвижната форма. Смята се, че тази форма насърчава клетъчната дисперсия в ксилемата, което води до по-бърз спад на растението (Ionescu et al., 2014). Две други проучвания показват, че фактори на вирулентност, като тип II-секретирани липази/естераза и ксиланаза и тип III-секретирани ефектори, се секретират във връзка с OMVs (Chowdhury & Jagannadham, 2013; Sidhu et al., 2008; Solé et al. ., 2015), което предполага, че OMV може да играе важна роля в бактериалната вирулентност. Молекулярната сложност на OMVs, заедно с неговите двойни и вероятно противоположни функции в гостоприемника (предизвикване на имунитет и насърчаване на вирулентност), ни подтиква да проучим по-широкия транскрипционен отговор на растенията Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) към предизвикателството на OMV и да проверим дали тази транскрипционна промяна биха предизвикали резистентност или чувствителност към последваща бактериална инфекция.

2. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

2.1 Растителен материал и условия на растеж

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) див тип Col-0 линия, както и следните мутантни линии: bak- (Schlesinger et al., 2011) и falls ever (Nekrasov et al., 2009) бяха използвани в това изследване. Семената на Arabidopsis се стерилизират повърхностно и се засяват върху плочи с агар Murashige и Skoog (MS), както е описано (Bahar et al., 2016). Плаките се държат на тъмно при 4°C в продължение на 2–4 дни и след това се преместват при 22°C за покълване в продължение на 5–8 дни. Покълналите разсади с подобен размер се прехвърлят в 24-плаки с гнезда (два разсада на ямка), съдържащи 1 ml MS среда с 1% (w:v) захароза (Duchefa Biochemie) и се отглеждат още 8-10 дни при същите условия преди предизвикване с елиситор, както е описано по-долу. За първични анализи, семена от Arabidopsis див тип Col-0 линия и мутантни линии (falls ever и back-) бяха покълнати, както е описано по-горе и след това трансплантирани в саксии 7 × 7 × 6 cm (1 разсад/саксия), съдържащи смес soil Green #7611 (Евенари, Ашдод, Израел) и отглеждани при 9,5 часа фотопериод при 22–24˚C. Растенията бяха

2.2 Пречистване на везикули от бактериална външна мембрана

Запаси от глицерол на Xanthomonas campestris pv. campestris(Xcc) 33913 бяха набраздени върху плочки с хранителен агар (Difco, NA, Becton, Dickinson и Company) и отгледани в продължение на 2–5 дни при 28˚C. Единични колонии бяха събрани и използвани за инокулиране на 3-mL YEB (бульон с екстракт от дрожди) стартер, съдържащ 10 ug/ml цефалексин хидрат (Cp, Sigma-Aldrich). Стартерите се отглеждат в продължение на една нощ при 28°C с 185–200 rpm разклащане и след това се използват за инокулиране на 500 ml PSB (пептон захароза бульон) среда с антибиотици (както е описано по-горе) в 2-L колби при съотношение ~1:1000 (v:v). Културите се отглеждат, както е описано по-горе, до OD600 от 0,6–0,8 и след това бактериалните клетки се центрофугират и OMV се екстрахират от супернатанта, както е описано (Mordukhovich & Bahar, 2017). След това суровият OMV препарат се подлага на центрофугиране в градиент на Optiprep, за да се получат пречистени OMV, както е описано (Bahar et al., 2016; Mordukhovich & Bahar, 2017). Всяка партида OMV се пречиства от 1.5-L бактериална култура и накрая се ресуспендира в 1 ml PBS (рН 7,3). Пречистените OMV се използват незабавно или се съхраняват при 4 °C до 7 дни преди употреба. Разпределението на размера на OMV се измерва с помощта на устройство за динамично разсейване на светлината (Zetasizer Nano ZS, Malvern Panalytical, Worcestershire, UK) и има среден диаметър от 121.7 ± 55.43 nm (SD). Концентрацията на частиците беше измерена по подобен начин и е предоставена в описанието на всеки експеримент по-долу.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

2.3 Предизвикателство за разсад на Arabidopsis с OMV

За изследване на транскрипционния отговор на Arabidopsis на предизвикателство с OMV бяха използвани Col-0 разсад, отгледан в 24-плаки с ямки, както е описано по-горе. В деня преди предизвикването на OMV, MS средата беше изтеглена от блюдата и заменена с 250 ul стерилна dH2O, и блюдата бяха оставени на пейката за една нощ. Сутринта след това, 20 ul пречистени OMVs (30 ug на ml, съответстващи на 1,44 × 109 частици на ямка), или стерилен dH2O като макет, бяха добавени към всяка ямка. Разсадът се събира 2, 6 и 24 часа след предизвикването, изсушава се на хартия и се замразява бързо с течен азот в 2-mL епруветки Eppendorf Safe-Lock (Хамбург, Германия). Във всяка времева точка бяха събрани четири третирани с OMV и четири фалшиво третирани ямки, представляващи четири биологични реплики за всяко третиране във всяка времева точка.

2.4 Пречистване на РНК

РНК се екстрахира от разсад на Arabidopsis, като се използва реагент TRIzol (Invitrogen) съгласно инструкциите на производителя. РНК беше допълнително пречистена чрез използване на Turbo DNA-free Kit (Ambion, Thermo Fisher Scientific) и RNA Clean-Up and Concentration Kit (Norgen Biotek) съгласно инструкциите на производителя. Пречистените РНК проби бяха подложени на анализи на концентрация и качество с помощта на машина TapeStation 2200 (Agilent Technologies), RNA Screen Tape и RNA Screen

2.5 Конструиране и секвениране на РНК библиотека

За всяка обработка и времева точка бяха избрани за анализ две проби, показващи най-висока чистота. Библиотеките на TruSeq mRNA (Illumina) с улавяне на PolyA бяха приготвени от избраните РНК проби в Crown Institute of Genomics в Weizmann Institute of Science (Rehovot, Израел). Всяка проба беше маркирана и от пробите беше подготвен пул. След това този пул се зарежда в две NGS ленти и се изпълнява в машина за секвениране на Illumina HiSeq, при режим на работа с висок изход, единично четене (SR) 60 (v4).

2.6 Секвенирането се чете като първоначална обработка

The raw sequence reads were cleaned with Trimmomatic software v 0.36 (Bolger et al., 2014), removing low-quality reads and remaining adapter sequences. The clean reads were mapped to the reference Arabidopsis TAIR10 reference genome (Lamesch et al., 2012) using bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012) and quantification of gene expression was done using RSEM (Li & Dewey 2011). Principal component analysis and sample correlation matrix were calculated with the function cor() and pre-comp (), respectively, of the R base package version 3.6.1. DEGs were determined using the DESeq2 tool (Love et al., 2014). The FDR (false discovery rate) cutoff chosen was FDR < 0.05. The LogFC (Log of the fold change) cutoff for the up-regulated and the downregulated genes, was > 

2.7 Генни онтологии и генни описания 

Генните онтологии (GO) бяха извлечени с помощта на анотациите на GO на TAIR (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp). Генните описания, според генните модели, са получени чрез използване на търсенето на описание на гени на TAIR (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/genes/). Обогатяването на GO беше изчислено с помощта на уеб инструмента AgriGO (http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php), използвайки локуса на генома на Arabidopsis (TAIR10) като референция

2.8 Количествена PCR и RNA-seq валидация

За валидиране на RNA-seq данни, РНК проби от фалшиви и OMV-предизвикани разсад бяха използвани за cDNA синтез, последвано от количествена PCR (qPCR), използвайки ген-специфични праймери (Доп. Таблица S4), както е описано (Bahar et al. , 2016). Като цяло бяха тествани 17 DEG от набора от данни за RNA-seq, като се използваха четири биологични реплики на RNA от OMV- или фалшиво третирани разсад. Относителната експресия на тестваните гени беше сравнена с експресията на убиквитин, като се използва 7500 Fast PCR машина в реално време (Applied Biosystems), както е описано (Bahar et al., 2016).

2.9 Сравняване на транскрипционния отговор на Arabidopsis към MAMP и OMV 

Нашият OMV-индуциран набор от данни беше сравнен с наличните транскриптоми на Arabidopsis, заразени с flg22, (Denoux et al., 2008) elf26 (Zipfel et al., 2006), PGN (Willmann et al., 2011), OG (Davidsson et al. , 2017) и LPS (Livaja et al., 2008). За сравнение на данните беше извършено обогатяване на термините на GO и индуцираните GO бяха визуализирани чрез диаграми на Вен, както е описано по-горе.

2.10 Експерименти за праймиране на Arabidopsis

За тестване на първичния ефект на Xcc OMV върху Arabidopsis, заразен с Pseudomonas syringae pv. домат DC3000 (Pst), следвахме процедурата, описана от Zipfel et al. (2004). Накратко, листа от 6-8 седмични растения Arabidopsis, отгледани, както е описано по-горе, бяха инфилтрирани с 50-100 ul пречистени Xcc OMV (30 ug/ml, съответстващи на 3.6-7.2 × 109 частици на лист), 1 μM flg22 или вода с помощта на спринцовка без игла. За всяко третиране бяха използвани 5 листа/растение и три реплики на растения. Pst инокулумът се приготвя чрез култивиране на бактерията върху средни плаки на King's B (20 g/L пептон, 1,5 g/L MgSO4 x7H2O, 10 ml/L глицерол и 15 g/L агар) при 28˚C за 2-3 дни, и след това ресуспендиране на колонии с вода и регулиране на концентрацията на инокулума до 105 CFU/ml. Pst инокулумът се инфилтрира в праймирани листа 24 часа след праймирането, като се използва спринцовка без игла (приблизително 100 ul се инфилтрират във всеки лист). Бактериалният растеж се определя на 0 (1 час след инокулацията) и 2 дни след инокулацията (dpi) чрез събиране и претегляне на инокулираните листа, мацерирането им в 1 ml от 10 mM MgCl2 и поставяне на 10-кратни серийни разреждания върху King's Б агарни плочи. Броят на CFU на всяка плака се определя 2 дни по-късно и се изчислява на g лист.

ФИГУРА 1 Транскрипционен отговор на Arabidopsis към OMV на 2, 6 и 24 след предизвикване. Анализ на главния компонент (A) и проба на корелационна матрица (B) на транскрипционен отговор на разсад на Arabidopsis към OMV или макет на 2, 6 и 24 часа след предизвикване

2.11 In vitro анализи на бактериален растеж 

За да се оцени ефектът от пречистени Xcc OMV върху растежа на Pst in vitro, Pststarters се отглеждат в течна среда на King's B за 24 часа при 28˚C и след това се използват за инокулиране на три различни култури, съдържащи 12 ml среда на King's B всяка, в {{3 }}mL епруветки Falcon в съотношение 1:100. Бактериалните култури се допълват с 30 ug/ml OMV (1:50 или 1:100, съответстващи съответно на 1,44 × 109 или 7,2 × 108 частици на ml) или PBS като контрола и се инкубират в продължение на 20 часа при 28˚C. Бактериалният растеж се измерва с помощта на спектрофотометър (Amersham Biosciences) при оптична плътност (OD) от 600 nm за 22 часа.

3 РЕЗУЛТАТА

3.1 RNA-seq анализът разкрива голям набор от гени на Arabidopsis, диференциално експресирани в отговор на OMV предизвикателство

За да изследваме транскрипционната промяна в Arabidopsis след предизвикване на OMV, ние третирахме разсад на Arabidopsis с OMV, пречистени от бактериалния патоген Xanthomonas campestris pv. campestris 33913 (Xcc) и събрана растителна РНК на 2, 6 и 24 часа след предизвикване (hpc). РНК от OMV- и фалшиво третирани проби след това се секвенира и анализира, както е описано в Материали и методи. Основната корелация (Фигура 1А) и пробните анализи на корелационната матрица (Фигура 1В) показват, че биологичните реплики във всеки третиран клъстер са близо една до друга, индикация за общото сходство на транскрипционния отговор между биологичните реплики. Обработените с OMV проби при 2 и 6 hpc клъстер заедно, което показва, че лечението с OMV има по-голям ефект върху транскрипционния отговор, отколкото времето за вземане на проби (Фигура 1B). От друга страна, пробите, третирани с OMV, се групират заедно със съответното им фиктивно третиране при 24 hpc, което показва, че транскрипционната промяна, предизвикана от OMVs в този момент, е намаляла и е подобна на тази на фиктивно третирани растения.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Във всеки тестван момент от време, третираните с OMV разсад се сравняват с фиктивно третирани разсади и се екстрахират диференциално експресирани гени (DEGs). Във всички времеви точки, комбинирани, общо 984 и 175 гена бяха установени като значително (Промяна на логаритмично сгъване > 1 или ← 1, p стойност и FDR < 0.05) съответно нагоре или надолу, в отговор на OMV предизвикателство (Фигура 2A; Допълнителна таблица S1). Регистрационната промяна на кратността на генната експресия (LogFC) варира от максимум 9,08 (AT1G26410, 6 hpc), което съответства на над 500-кратна промяна, до -5.73 (AT3G17520, 24 hpc). Най-големият брой DEG беше открит при 2 и 6 hpc, където бяха идентифицирани съответно общо 647 и 876 DEG (комбинирано регулиране нагоре и надолу). При 24 hpc бяха открити 121 DEG. Повече от 50% от повишено регулираните гени на 2 и 6 часа след предизвикване с OMV бяха споделени между тях (Фигура 2B). За да изследваме промяната във временната генна експресия, ние извлякохме всички регулирани нагоре DEGs, които бяха открити във всички времеви точки (37 гена) и сравнихме тяхната сгъваема промяна във времето (Фигура 2C). Експресията на промяна на гънките на тези гени беше значително различна в различните времеви точки (еднопосочен ANOVA; F2, 108=8.1633, p=0.0005). Post hoc сравнение с помощта на теста на Tukey Kramer HSD показа, че LogFC при 2 (M=3.45, SD=1.72) и 6 hpc (M=3.87, SD=1.98) е значително по-висока, отколкото при 24 hpc (M=2.32, SD=1.31) (p=0.0145 и p=0 .0005, съответно) (Фигура 2D). Въпреки че средната експресия на LogFC при 6 hpc е по-висока, отколкото при 2 hpc, тя не е статистически различна (p=0.5413). Следователно, когато разглеждаме броя на DEG и общия ген LogFC в трите тествани времеви точки, можем да заключим, че най-значимата транскрипционна промяна е настъпила на 2 и 6 часа след OMV предизвикателство. За да се изследва валидността на резултатите от RNA-seq, експресията на 17 повишено регулирани гена беше определена с помощта на количествена PCR (qPCR) със специфични праймери. Четиринадесет от тестваните гени показват същия модел, както при анализа на RNA-seq и са значително повишени в сравнение с макетите. Три от тестваните гени имат по-висока относителна експресия, но не се различават значително от макетите по този метод (Доп. Фигура S1).

ФИГУРА 2 Диференциално експресирани гени на Arabidopsis в отговор на OMV предизвикателство. (A) Общ брой диференциално експресирани гени (DEGs) (регулирани нагоре или надолу, LogFC > 1 или ← 1, p-стойност и FDR < 0.05) при 2, 6 и 24 часа след предизвикателството. (B) Припокриване между DEG в различни времеви точки (ляво, регулирано нагоре; дясно, регулирано надолу). (C) По-регулираните гени, открити във всичките три времеви точки, бяха нанесени върху графика на експресия на LogFC, показваща генна експресия във времето. (D) LogFC средна стойност на всички DEG в различни моменти от време. Различните букви показват статистическа разлика при p < 0,05 чрез HSD теста на Tukey-Kramer

3.2 Arabidopsis реагира на OMV с транскрипционно изместване към активиране на имунната система

За да идентифицираме пътищата на Arabidopsis, значително засегнати от предизвикателството на OMV, използвахме уеб инструмента AgriGO (Du et al., 2010; Tian et al., 2017). Идентифицирахме съответно 333 и 55 значително (FDR <0,05) термина с регулирана нагоре и надолу генна онтология (GO), във всички времеви точки, комбинирани в отговор на предизвикателството на OMV. Близо 25% от регулираните нагоре GO са свързани с реакцията на растението на стимул (Фигура 3A). В рамките на категорията „отговор на стимул“, най-доминиращите термини на GO бяха свързани с отговор на стрес, биотичен стимул, химикали и ендогенен стимул (Фигура 3B; Допълнителна таблица S2). Инструментът AgriGO също идентифицира 103 значително повишени молекулярни функции, включително „трансферазна активност“, киназна активност“, „активност на транскрипционен фактор“, „свързване на йони и метални йони“, „свързване на въглехидрати“, „свързване на протеини“, „каталитична активност“ , „свързване на аденил нуклеотид“, „трансмембранна рецепторна активност“ и повече свързващи функции (Доп. Таблица S2). Клетъчното местоположение на значимите термини беше в различни отделения на клетката, включително ядрото, вакуолата и ендомембранната система, но най-вече беше свързано с клетъчната периферия и включваше „плазмена мембрана“, „извънклетъчна област“, ​​„клетъчна стена“ и 'апопласт' онтологии (Доп. Таблица S2). Значително понижените GO, от друга страна, включват термините „катаболен и метаболитен процес на токсини“, „отговор на вода и лишаване от вода“, „липиден транспорт и локализация“ и други (Доп. Таблица S2). GO, свързани с реакцията на биотичен стимул, не са обогатени с регулираните надолу гени. Значително понижените молекулярни функции включват много редокс термини като „оксидоредуктазна активност“, „свързване на хема“, „свързване на железни йони“, „свързване на липиди“, „свързване на кислород“ и още функции, свързани с кислорода (Доп. Таблица S2) . Регулираните надолу термини също бяха разположени в извънклетъчната област. За да определим към кои GO термини принадлежат DEG с най-висока експресия, ние филтрирахме оригиналния списък с DEG, като избрахме гени, които имат LogFC по-висок от 4 или по-малък от -4 (съответстващ на 16-кратна разлика) . Идентифицирахме 117 гена, които отговарят на тези критерии, от които 115 са регулирани нагоре и 2 регулирани надолу във всички времеви точки, комбинирани. Поради малкия брой надолу регулирани гени с LogFC по-малко от -4, не са идентифицирани значително потиснати GO. От друга страна, бяха идентифицирани 72 значително повишени GO, от които най-значимите са свързани с „отговор на външен биотичен стимул“, „отговор на други организми“, „клетъчен отговор на нивата на кислород“, „отбранителен отговор“ , „отговор на стрес“ и повече GO, свързани с имунитета (Фигура 3C).

ФИГУРА 3 Термини на генната онтология (GO) на Arabidopsis, обогатени в отговор на Xcc OMV предизвикателство. Кръгова диаграма, представяща разпределението на категориите в условията на повишено регулиране на биологичен процес (A) и реакция на стимул (B) GO. (C) Списък на гени на Arabidopsis с LogFC > 4 в отговор на OMV предизвикателство. Гените бяха филтрирани от пълния набор от данни на DEG и използвани за идентифициране на обогатени GO термини с помощта на уеб инструмента AgriGo. FDR прекъсване < 0.05

3.2 Предизвикателството с OMV доведе до повишена регулация на имунните рецептори

MAMP усещането и реакцията на растенията към MAMPs са до голяма степен медиирани от мембранно свързани PRRs, които медиират възприемането на патогена и ефективното смекчаване на инфекцията. PRRs обикновено се класифицират в две групи рецепторни кинази (RKs) и рецептор-подобни протеини (RLPs) (Boutrot & Zipfel, 2017). За да идентифицираме PRRs, които са били различно изразени в отговор на OMVs, ние сравнихме нашия DEG набор с предварително установени списъци на Arabidopsis RKs (Kemmerling et al., 2011; Mott et al., 2016) и RLPs (Wang et al., 2008). Идентифицирахме в нашия набор от данни съответно 33 и 10 регулирани нагоре RK и RLP във всички времеви точки (Таблица 1). Не бяха намерени RKs или RLPs в нашия списък от 175 регулирани надолу гени. Kemmerling и др. (2011) дефинира списък от 49 RKs, чиято експресия е значително индуцирана от MAMPs като flg22 и NLP (некроза и етилен-индуциращ пептид 1-подобен протеин), или лечение на патогени. Сравнихме този списък с регулираните нагоре RLK от нашия експеримент и открихме, че 45% от RK, дефинирани от Kemmerling et al. (2011) също са индуцирани в отговор на OMV. Сред тях заслужава да се отбележи FRK1, SOBIR1, SERK4, RLK/IKU2, PSKR1, HAESA, EFR, BIR и IOS1 (Таблица 1). Сред групата RK, FRK1 имаше най-високата експресия както при 2, така и при 6 hpc с LogFC съответно от 7,11 и 5,2, докато средният LogFC на всички RK беше 2,11 и 2,13 при 2 и 6 hpc, съответно. Докато мембранно свързаните RKs и RLPs медиират най-вече извънклетъчното усещане на нахлуващите микроби, нуклеотид-свързващият сайт–богат на левцин повторение (LRR) рецептори (NLRs) са вътреклетъчни имунни рецептори. Открихме 7 различни NLR гени, регулирани нагоре в отговор на OMV-предизвикателство при 2 и 6 hpc, нито един не беше открит при 24 hpc (NLR списъкът беше извлечен от TAIR, 102 гена) (Таблица 1).

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

3.3 OMV индуцират експресията на множество WRKY транскрипционни фактори

Установено е, че транскрипционните фактори на WRKY (TFs) играят роля в имунните отговори на растенията, участвайки както в отговорите на имунитета, предизвикан от MAMP (MTI), така и в отговорите на имунитет, предизвикан от ефектор (ETI) (Birkenbihl et al., 2018; Rushton et al., 2010 ). Предизвикателството на OMV доведе до повишена регулация на 20 различни WRKY TF (списък, извлечен от TAIR, 70 гена) само при 2 и 6 HPC (Таблица 1). WRKY TF отсъстваха от нашия набор от ниско регулирани гени. Друго семейство TFs, засегнати от предизвикателството OMV, са протеини, съдържащи домейн MYB (Tsuda & Somssich, 2015), за които е известно, че участват в множество процеси, включително биотични и абиотични стресове (Ambawat et al., 2013). Като цяло, 9 различни MYB TF (списък, извлечен от TAIR, 211 гена) са диференциално експресирани в отговор на OMV предизвикателство, 5 регулирани нагоре и 4 регулирани надолу (Таблица 1). Допълнителни класове диференциално експресирани TF, които са открити, са изброени в таблица 1.

3.4 Сравняване на транскрипционния отговор на Arabidopsis към OMV с отговор към пречистени MAMPs

За да научим за разликите в реакцията на Arabidopsis към пречистен елиситор спрямо груба и молекулярно сложна структура – ​​OMVs, ние сравнихме нашите RNA-seq данни със съществуващи транскриптомни данни за реакцията на Arabidopsis към известни MAMPs, включително flg22, (Denoux et al., 2008) elf26 (Zipfel et al., 2006), PGN (Willmann et al., 2011), OG (Davidsson et al., 2017) и LPS (Livaja et al., 2008). Обогатените GO бяха извлечени от гореспоменатите набори от данни, както е описано по-горе (Доп. Таблица S3) и сравнени с GO, обогатени след предизвикателството на OMV. Като цяло термините на Arabidopsis GO, индуцирани от OMV, са подобни на тези, индуцирани от единични, протеинови и непротеинови MAMPs, споделяйки 56, 51 и 47% от OMV-индуцирани GO с GO, индуцирани съответно от flg22, elf26 и PGN. От друга страна, по-ниско припокриване в индуцираните GOs се наблюдава при LPS и OGs, споделяйки съответно 24 и 33%, с OMV-индуцирани GOs (Фигура 4A). Трябва да се отбележи, че свързаният с патогенезата 1 (PR1) ген (At2g14610), отличителен белег на LPS-индуцирани имунни отговори (Silipo et al., 2005, 2008), отсъстваше от OMV-индуцирания списък на гените във всички тествани времеви точки. Установено е, че четиридесет и един GO са индуцирани от OMV, а не от някой от другите MAMP, тествани тук (Фигура 4B). Този списък включва GO, свързани с „апоптоза“, „отговор на лекарство“, „транспорт на лекарства и „транспорт на множество лекарства“ и „липазна активност“ (Допълнителна таблица S3, обозначена със звездички и удебелен шрифт).

3.5 OMV индуцират устойчивост на Arabidopsis към бактериална инфекция

Тук и по-рано (Bahar et al., 2016), ние предоставихме доказателства, демонстриращи, че имунната система на Arabidopsis е индуцирана от OMV предизвикателство. За да проверим дали тази OMV-медиирана имунна индукция се превръща в ефективен имунен отговор, ние използвахме тест за бактериален растеж на planta (Zipfel et al., 2004), при който растенията Arabidopsis са предварително третирани с OMVs, последвано от бактериална инокулация. Значително намаление с повече от 10-кратно Pseudomonas syringae pv. домат DC3000 (Pst) CFU/g лист се наблюдава както в OMV-, така и в flg22-предварително третирани растения в сравнение с фалшива предварителна обработка, два дни след инокулацията (Фигура 5А). In vitro растежът на Pst не се повлиява отрицателно от добавянето на OMVs към средата, което предполага, че намаленият растеж на Pst в planta е свързан с първичния ефект на OMV и не е пряк ефект на OMV върху бактериите (Доп. Фигура S2). За да тестваме дали индуцираната от OMV резистентност към Pst се медиира от FLS2, EFR или BAK1, ние повторихме този експеримент с Col-0, bak- мутант и двойната мутантна линия пада efr. И при двете мутантни линии предварителната обработка с OMV доведе до значително намаляване на Pst CFU/g лист в сравнение с фалшиво третирани растения (Фигура 5B-C). Както се очакваше, fls efr и bak-мутантните линии, третирани с flg22, имаха подобни Pst титри като нетретираните растения, тъй като е известно, че не реагират на flg22. За да сравним относителното намаление на титъра на патогена в Col-0 спрямо мутантните линии на имунния рецептор, падащи някога и bak в първичните растения, ние изчислихме разликата в титъра на Pst в OMV- и фалшиво третирани растения в три независими експеримента (Supp Фигура S3). Средното намаление на титъра на Pst в предварително третирани с OMV гръбначни растения е по-малко от това, наблюдавано при Col-0 растения (0,89 спрямо 1,14 Log CFU/gr намаление на листа за bak и Col-0, съответно, едно- начин ANOVA; F2, 4=4.3781, p=0.0523). Не видяхме подобно намаление с fls efr мутантната линия (1,26 срещу 1,32 Log CFU намаление съответно за fls efr и Col-0, еднопосочна ANOVA: F1,4=0.0352, p=0.5698) (Фигура 5D-E).

ТАБЛИЦА 1 OMV-индуцирани RKs/RLPs и имунно-свързани транскрипционни фактори в разсад на Arabidopsis

ТАБЛИЦА 1 (Продължение)

ТАБЛИЦА 1 (Продължение)

4. ДИСКУСИЯ

Бактериалните външни мембранни везикули (OMVs) са сложни наноструктури, произхождащи от бактериалната външна мембрана и са съставени от стотици протеини и други компоненти на клетъчната стена. По-рано беше показано, че растенията Arabidopsis реагират на OMV предизвикателство чрез активиране на типични имунни отговори като избухване на ROS, генна експресия на имунен маркер и средно алкализиране (Bahar et al., 2016). В това проучване изследвахме по-широкия транскрипционен отговор на Arabidopsis към бактериални OMV и неговия ефект върху последваща инфекция. Основното заключение от анализите на данните за RNA-seq, извършени в това проучване, е, че имунната система на Arabidopsis се подготвя след излагане на OMV на Xanthomonas campestris pv.campestris (Xcc). Това заключение е подкрепено от различни и допълващи се анализи. Първо, обогатяването на генна онтология (GO) в растения, изложени на Xcc OMV, ясно показва, че OMV се възприемат от Arabidopsis като стресори. Клетъчното местоположение на растителния отговор беше свързано предимно с клетъчната периферия, което предполага външно клетъчно възприемане на предизвикателния материал, OMVs. Това предоставя допълнителна подкрепа на идеята, че OMV и техните съставки се усещат от извънклетъчни рецептори, подобно на много известни MAMP. Второ, забелязахме, че голям набор от RK и RLP са регулирани нагоре в отговор на предизвикателството на OMV. Известно е, че много от тези рецептори медиират възприемането на патогени или преди това е показано, че се свързват с имунния отговор на растенията. FLG22-индуцирана рецептор-подобна киназа 1 (FRK1) е най-силно индуцираният рецептор. Това е интересно, тъй като не можахме да открием флагелин в нашия Xcc OMV протеомичен анализ (данните не са показани). Известно е, че FRK1 също се индуцира от други имунни стимулатори, но е интригуващо защо неговата експресия е толкова по-висока от останалите RKs, регулирани нагоре тук. Експресията на рецептора на фактора на удължаване (EFR), от друга страна, беше значително повишена само в 2-ия час и имаше LogFC от 1,12, въпреки че EF-Tu се намира в Xcc OMVs (Bahar et al., 2016 ). Ние също така открихме няколко NLR гени, регулирани нагоре в отговор на OMV предизвикателство, половината от които са анотирани като протеини за резистентност към болести, но тяхната функция в растителния имунитет не е описана. Въпреки че не предполагаме, че NLR са пряко включени в възприемането на OMV, те могат да бъдат индуцирани надолу по веригата на RK/RLPs, усещащи OMV молекули, както се наблюдава също в отговор на пречистени MAMP като flg22, elf18 и LPS (Denoux et al., 2008). ; Livaja et al., 2008; Zipfel et al., 2006). Трето, много свързани с имунитета транскрипционни фактори, WRKY, MYB и други, бяха значително повишени от OMV (Bjornson et al., 2021). В нашето проучване основната транскрипционна промяна в отговор на OMV настъпи в първите две времеви точки (2 и 6 hpc). Това беше илюстрирано както от значително по-голям брой диференциално експресирани гени (DEGs), така и от значително по-висока Log foldchange (LogFC) при 2 и 6 hpc. Независимо от това, от общо 121 DEG, открити при 24 hpc, почти половината (52) не бяха открити при 2 или 6 hpc. Това предполага, че половината от DEG при 24 hpc са късно регулирани гени, чиято експресия е регулирана нагоре или надолу по-късно от 6 hpc. Наистина, преди това бяха идентифицирани гени на Arabidopsis с различна динамика на експресия след предизвикване на елиситор (Bjornson et al., 2021).

ФИГУРА 4 Сравнение на термините на обогатената генна онтология (GO) в отговор на OMV и на единични пречистени MAMPs. Набори от данни за експресия на Arabidopsis в отговор на MAMP предизвикателството (elf26, flg22, OGs, PGN и LPS; вижте раздела Материали и методи за справки) бяха използвани за извличане на обогатени GO с помощта на уеб инструмента AgriGo. Обогатените GO комплекти на всеки MAMP бяха сравнени с обогатения GO списък в отговор на OMVs, използвайки Venny (A и Допълнителна таблица S3). Термините на GO, обогатени само в наборите от данни на OMV, са показани в (B), сортирани по тяхната FDR стойност.

В нашето проучване основната транскрипционна промяна в отговор на OMV настъпи в първите две времеви точки (2 и 6 hpc). Това беше илюстрирано както от значително по-голям брой диференциално експресирани гени (DEGs), така и от значително по-висока промяна на Log fold (LogFC) при 2 и 6 hpc. Независимо от това, от общо 121 DEG, открити при 24 hpc, почти половината (52) не бяха открити при 2 или 6 hpc. Това предполага, че половината от DEG при 24 hpc са късно регулирани гени, чиято експресия е регулирана нагоре или надолу по-късно от 6 hpc. Наистина, гените на Arabidopsis с различна динамика на експресия след предизвикване на предизвикателства бяха идентифицирани преди това (Bjornson et al., 2021). Бързият и предимно преходен модел на генна експресия, който видяхме тук, е в съответствие с други проучвания, които са тествали временния отговор на Arabidopsis към MAMPs. Например, Denoux et al. (2008) и Bjornson et al. (2021) са показали, че транскрипционната промяна в Arabidopsis в отговор на различни MAMP настъпва в рамките на минути до часове и в повечето случаи DEG се връщат към базовите нива ~ в рамките на 24 часа след предизвикване на растението. За разлика от взаимодействията между растение и патоген, където взаимодействието е динамично и продължава, когато се предизвиква с нежива проба, като пречистен MAMP или с OMVs, може да се очаква, че отговорът на растението, поне на транскрипционно ниво, би било преходно и не се поддържа в продължение на дни. Интензивни изследвания през последните три десетилетия разкриха множество растителни имунни рецептори, отговорни за разпознаването на микроби. Много от тези рецептори имат способността да откриват отделни микробни характеристики и се изучават подробно, за да се разбере по-добре възприемането на патогените, сигнализирането на имунната система и реакцията на моделни и културни растения. Растенията обаче са изложени едновременно на множество микробни характеристики от различни източници, което добавя сложност към имунното възприятие и реакция. Бяхме заинтересовани да изследваме разликите в транскрипционния отговор на Arabidopsis към единични пречистени MAMPs спрямо OMVs, които представляват по-естествена и сложна микробна структура, но степен на сложност, премахната от самия микроб. OMV носят фактори на вирулентност, разграждащи ензими, токсини и други биомолекули, които биха могли да имат функционална роля за бактериалния растеж в растенията и следователно беше интересно да се тества дали OMV предизвикателството индуцира уникални GO, които не са индуцирани от синтетични MAMP.

ФИГУРА 5 Предварителното третиране на листата на Arabidopsis с OMV индуцира резистентност към последваща бактериална инфекция. Col-0 растения (A) бяха предварително третирани с OMVs, вода (мокет) или flg22 като контроли и 24 часа по-късно инокулирани с 105 CFU/ml суспензия от Pst DC3000 с помощта на инфилтрация със спринцовка без игла . Pst DC3000 клетъчен титър в инокулираните листа се определя 48 часа след инокулацията чрез серийно разреждане. Arabidopsis Col-0 и fls efr (B), или bak (C) растения бяха тествани в подобен експеримент, както е описано в (A). Беше сравнено средното намаление на Log Pst DC3000 CFU/gr след предварителна обработка с OMV (в сравнение с нетретирани растения) в Col-0 и спадове efr (D) и Col-0 и обратно (E). Всяка лента представлява средното намаление на Log Pst DC3000 CFU/gr от три независими експеримента (данните от независимите експерименти са представени в допълнение Фиг. S3). Разликите не са статистически значими (t-тест на студент с две опашки. p стойностите са посочени над лентите на графиката). Експерименти A, B и C бяха проведени най-малко три пъти с подобни резултати (3 растения/реплики на третиране във всеки експеримент). Звездичките (**) показват значителна разлика в сравнение с макет (тест на Dunnet p <0,001)

За нашите транскриптомични сравнения ние събрахме данни от проучвания с подобни експериментални условия, т.е. в растения и в подобни времеви точки. Значително припокриване в обогатяването на GO се наблюдава в реакцията на Arabidopsis към OMV и към flg22, elf26 и PGN. Това не е неочаквано, тъй като е известно, че много от защитните пътища, активирани при отчитане на патогени, са сходни, независимо от конкретния елиситор или неговия източник (Bjornson et al., 2021; Zipfel et al., 2006). Въпреки това беше установено, че някои уникални GO се регулират нагоре от OMV, а не от другите MAMP, които изследвахме. Сред тях са GO, свързани с разграждането на клетъчната стена, като „липазна активност“ и „хидролазна активност, действаща върху гликозилови връзки“, което може да означава, че защитната система на растенията е насочена към разграждането на OMV. Интересното е, че три GO, свързани с транспорта на наркотици, също бяха установени като уникално повишени от предизвикателството на OMV. Това може да означава, че растенията са изправени пред токсични съединения, доставяни в техните клетки, може би чрез OMV-медиирано доставяне. За разлика от отговора на Arabidopsis към имуно-предизвикващи пептиди и PGN, ние наблюдавахме относително малко припокриване между отговора на Arabidopsis към OMVs OGs и LPS. Това малко припокриване, особено с LPS, е донякъде изненадващо, като се има предвид, че в клетките на бозайници LPS са добре признати като мощни участници в имунния отговор на гостоприемника, индуциран от OMV (Ellis et al., 2010). Освен това, фактът, че не можахме да открием регулиране нагоре на LPS имунната отличителна черта PR1 (Silipo et al., 2005), може да предполага, че LPS не е основен стимулатор на имунното взаимодействие на растенията с бактериални OMV. Това обаче предстои да бъде разгледано по-задълбочено. Показано е, че OMV допринасят за бактериална колонизация както на бозайници, така и на растения гостоприемници и в някои случаи за бактериална вирулентност. От друга страна, OMVs активират имунната система на гостоприемника, действайки като нож с две остриета, насърчавайки бактериалното оцеляване и вирулентност от една страна, и захранвайки системата за наблюдение на гостоприемника и активирайки имунитета на гостоприемника, от друга (McMillan & Kuehn, 2021). ). Нашите първични анализи показаха, че предизвикателството с OMV води до значително инхибиране на Pseudomonas syringae pv. растеж на домати DC3000 (Pst) в растението, подобно на първичния ефект, наблюдаван при синтетичните MAMP (Jung et al., 2009). Следователно, в този случай, предварителното прилагане на OMVs към инокулираната тъкан не насърчава бактериалната колонизация, а по-скоро подготвя растенията, за да индуцира ефективен имунен отговор, който инхибира растежа на патогена. Този резултат е в съответствие с нашите транскрипционни данни и с нашето предишно проучване, подкрепящо идеята, че OMV индуцират силен и ефективен имунен отговор в Arabidopsis. Две скорошни проучвания показват също, че предварителната обработка на Arabidopsis с OMV от патогенен или комензален вид Pseudomonas, потиска последващата Pst инфекция (Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). Тези резултати кумулативно показват, че при тестваните условия инфилтрацията на OMV не улеснява патогенната инфекция. В предишно проучване ние показахме, че множество мутанти на имунни рецептори поддържат WT реакция към Xcc OMV. Тези мутанти включват известни PRRs, разпознаващи или протеинови (FLS2, EFR, RLPReMAX), или непротеинови MAMPs (LYM1/LYM3) (Bahar et al., 2016). Интересното е, че Janda et al. (2021) съобщават, че когато FLS2 рецепторна мутантна линия на Arabidopsis (грип) е предизвикана с OMV от Pst, експресията на FRK1 е непроменена и е подобна на фалшиво третирани растения, което предполага, че FLS2 медиира отговора на Pst OMV. Възможно е флагелинът да е по-изобилен в препаратите на Pst OMV, отколкото в Xcc 33913 OMVs, и следователно отстраняването на рецептора на флагелин има по-изразен ефект върху реакцията на растенията към Pst, отколкото към Xcc OMVs.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Доказано е, че различните имунни анализи на растенията могат да дадат различни резултати, водещи до предполагаеми противоречиви заключения. Например, ние показахме, че при анализ на листен диск ROS burst, отговорът на Arabidopsis към OMVs е зависим от EFR рецептора, но при анализ на генна експресия на имунен маркер с разсад на Arabidopsis, всяка мутантна линия е толкова отзивчива към OMVs, колкото WT. McMillan и др. (2021) показаха, че различни физически обработки, прилагани към OMV, премахват определени дейности, като например инхибиране на растежа на разсад. Въпреки това, той не променя други имунни резултати, като например подготовката на растенията. Следователно е важно да се комбинират различни анализи, за да се тестват различни имунни резултати, за да се получи възможно най-широк поглед върху имунния отговор на растенията към даден елиситор. За по-нататъшно изследване на участието на някои от известните PRRs и ко-рецептори, ние тествахме линиите falls ever и bak мутантните линии, използвайки теста за първоначално зареждане на растенията. Нашите резултати показват, че линиите на двоен мутант на Arabidopsis са грундирани по подобен начин от Xcc OMV, както и WT растенията, подкрепяйки идеята, че MAMP, различни от флагелин и EF-Tu, също присъстват в Xcc 33913 OMV. Въз основа на анализи на генна експресия на имунен маркер, ние по-рано предположихме, че ко-рецепторът BAK1 участва в възприемането и/или реакцията на OMV (Bahar et al., 2016). В това проучване преразгледахме това предложение, използвайки първичния анализ. Тук линията bak мутант беше подготвена чрез предварителна обработка с OMV, но в малко по-малка степен от растенията WT Col-0. Въпреки че тази граница не е статистически значима, тя е по-голяма от тази, наблюдавана при двойната fls някога мутантна линия. Този резултат също е в съответствие с скорошно проучване, което показа, че линията на bak мутант реагира на OMV като WT растения в експерименти за имунно праймиране (Tran et al., 2021). Като цяло, това може да предполага, че докато BAK1 участва в възприемането на OMV, друго имунно възприятие и сигнални пътища се инициират от OMV, което води до ефективен имунен отговор и потискане на растежа на патогена. Участието на ко-рецепторите BAK1 и SOBIR1 в отговор на OMVs (Bahar et al., 2016) ни накара да приемем, че множество имунни рецептори, вероятно PRRs, участват в възприемането на OMV. Въпреки това, скорошно проучване предполага, че имунната активация на растенията от OMVs може да бъде MAMP-независима и да е резултат от физико-химични промени в растителната плазмена мембрана, предизвикани от интегрирането на OMV (Tran et al., 2021). Това е интригуваща хипотеза, която предстои да бъде разгледана допълнително. Интересното е, че McMillan et al. (2021) съобщават, че OMVs, третирани с протеиназа K, запазват своя имунен първичен капацитет, което показва, че тази активност може да е независима от протеиновия товар на OMV. Докато този резултат може да подкрепи MAMP-независимата хипотеза за имунно активиране на Tran et al. (2021), други, непротеинови MAMPs, присъстващи в OMV, като LPS и PGN, могат да активират MTI (Bahar et al., 2016; McMillan et al., 2021). Освен това, третираните с протеиназа К OMV запазват способността си да индуцират инхибиране на растежа на разсад, което показва, че инхибирането на растежа зависи от протеиновия товар на OMV (McMillan et al., 2021). Като цяло, тези резултати допълнително подчертават сложността на реакцията на растенията към OMV и значението на използването на различни резултати за тестване на участието на конкретен елиситор в специфични пътища.

През 2021 г. четири независими проучвания, включително това (които вероятно са се състояли едновременно), съобщават, че бактериалните OMV модулират имунната система на растенията и предизвикват ефективен отговор срещу патогенна инфекция (Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021; Тран и др., 2021). Тези вълнуващи резултати позиционират OMV като нов и важен играч във взаимодействията растения-микроби, където има още много да се учи. В това проучване ние предоставяме по-широк поглед върху транскрипционния отговор на Arabidopsis към Xcc OMV. Ще са необходими допълнителни изследователски подходи за по-нататъшно разбиране на компонентите и механизмите, включени в възприемането на OMV от растенията.

ПРЕПРАТКИ

Ambawat, S., Sharma, P., Yadav, NR, & Yadav, RC (2013). Гените на транскрипционния фактор на MYB като регулатори за реакциите на растенията: Общ преглед. Физиология и молекулярна биология на растенията, 307–321.

Бахар, О. (2020). Мембранни везикули от растителни патогенни бактерии и техните роли по време на взаимодействията растение-патоген. В: M. Kaparakis-Liaskos, & TA Kufer eds. Бактериални мембранни везикули – биогенеза, функции и приложения. Springer International Publishing, Швейцария, 119–129.

Бахар, О., Мордухович, Г., Луу, Д. Д., Швесингер, Б., Дауди, А., Йеле, А. К., Феликс, Г., и Роналд, ПК (2016). Бактериалните външни мембранни везикули предизвикват имунни реакции на растенията. Молекулярни взаимодействия растение-микроб, 374–384.

Birkenbihl, RP, Kracher, B., Ross, A., Kramer, K., Finkemeier, I., & Somssich, IE (2018). Принципи и характеристики на регулаторната мрежа на Arabidopsis WRKY по време на ранен имунитет, предизвикан от MAMP. Вестник за растенията, , 487–502.

Bjornson, M., Pimprikar, P., Nürnberger, T., & Zipfel, C. (2021). Транскрипционният пейзаж на Arabidopsis thaliana имунитет, предизвикан от модел. Природни растения, , 579–586.

Bolger, AM, Lohse, M., & Usadel, B. (2014). Trimmomatic: Гъвкав тример за данни от последователност на Illumina. Биоинформатика, 2114–2120.

Boutrot, F., & Zipfel, C. (2017). Функция, откриване и използване на рецептори за разпознаване на растителни модели за резистентност към широкоспектърни заболявания. Годишен преглед на фитопатологията, 257–286.

Chinchilla, D., Zipfel, C., Robatzek, S., Kemmerling, B., Nürnberger, T., Jones, JDG, Felix, G., & Boller, T. (2007). Индуциран от флагелин комплекс от рецептор FLS2 и BAK1 инициира защитата на растенията. Природа, 497–500.

Chowdhury, C., & Jagannadham, M. v. (2013). Вирулентните фактори се освобождават във връзка с везикулите на външната мембрана на Pseudomonas syringae pv. домат T1 по време на нормален растеж. Biochimica Et Biophysica Acta-протеини и протеомика, (1), 231–239.

Cook, DE, Mesarich, CH, & Thomma, BPHJ (2015). Разбиране на растителния имунитет като система за наблюдение за откриване на инвазия. Годишен преглед на фитопатологията, 541–563.

Couto, D., & Zipfel, C. (2016). Регулиране на сигнализирането на рецептора за разпознаване на образи в растенията. Nature Reviews Imunology, (9), 537–552.

Davidsson, P., Broberg, M., Kariola, T., Sipari, N., Pirhonen, M., & Palva, ET (2017). Късите олигогалактурониди индуцират генна експресия, свързана с резистентност към патогени в Arabidopsis thaliana. BMC Биология на растенията, 1–17.

Deatheragea, BL, & Cookson, BT (2012). Освобождаване на мембранни везикули при бактерии, еукариоти и археи: запазен, но недооценен аспект на микробния живот. Инфекция и имунитет, 1948–1957.

Denoux, C., Galletti, R., Mammarella, N., Gopalan, S., Werck, D., De Lorenzo, G., Ferrari, S., Ausubel, FM, & Dewdney, J. (2008). Активиране на пътищата на защитния отговор от OGs и Flg22 елиситори в разсад на Arabidopsis. Молекулярно растение, 423–445.

Dow, M., Newman, M.-A., & von Roepenack, E. (2000). Индукция и модулация на защитните реакции на растенията от бактериални липополизахариди. Годишни прегледи на фитопатологията, 241–261.

Du, Z., Zhou, X., Ling, Y., Zhang, Z., & Su, Z. (2010). agriGO: Инструментариум за GO анализ за селскостопанската общност. Изследване на нуклеинови киселини, W64–W70.

Ellis, TN, & Kuehn, MJ (2010). Вирулентност и имуномодулаторни роли на бактериални външни мембранни везикули. Прегледи по микробиология и молекулярна биология, 81–94.

Ellis, TN, Leiman, SA, & Kuehn, MJ (2010). Естествено произведени външни мембранни везикули от Pseudomonas aeruginosa предизвикват мощен вроден имунен отговор чрез комбинирано усещане на липополизахаридни и протеинови компоненти. Инфекция и имунитет, 3822–3831.

Erbs, G., Silipo, A., Aslam, S., de Castro, C., Liparoti, V., Flagiello, A., Pucci, P., Lanzetta, R., Parrilli, M., Molinaro, A. , Newman, M.-A., & Cooper, RM (2008). Пептидогликан и муропептиди от патогени Agrobacterium и Xanthomonas предизвикват вроден имунитет на растенията: структура и активност. Химия и биология, 438–448.

Felix, G., Duran, JD, Volko, S., & Boller, T. (1999). Растенията имат чувствителна система за възприятие за най-запазения домен на бактериалния флагелин. Вестник за растенията, 265–276.

Fesel, PH, & Zuccaro, A. (2016). -глюкан: Решаващ компонент на клетъчната стена на гъбичките и неуловим MAMP в растенията. Гъбична генетика и биология, 53–60

Fulsundar, S., Harms, K., Flaten, GE, Johnsen, PJ, Chopade, BA, & Nielsen, KM (2014). Потенциал за трансфер на гени на външни мембранни везикули на Acinetobacter baylyi и ефекти на стреса върху везикулацията. Приложна и екологична микробиология, 3469–3483.

Gómez-Gómez, L., & Boller, T. (2000). FLS2: LRR рецептор-подобна киназа, участваща във възприемането на бактериалния елиситор флагелин в Arabidopsis. Молекулярна клетка, 1003–1011.

Густ, А. А., Бисуас, Р., Ленц, Х. Д., Раухут, Т., Ранф, С., Кемерлинг, Б., Гоц, Ф., Главишниг, Е., Лий, Дж., Феликс, Г. и Нюрнбергер , Т. (2007). Пептидогликаните, получени от бактерии, представляват свързани с патогени молекулярни модели, задействащи вродения имунитет в Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry, 32338– 32348.

Ionescu, M., Zaini, PA, Baccari, C., Tran, S., da Silva, AM, & Lindow, SE (2014). Везикулите на външната мембрана на Xylella fastidiosa модулират колонизацията на растенията, като блокират прикрепването към повърхностите. Сборник на Националната академия на науките на Съединените американски щати, E3910–E3918.

Janda, M., Ludwig, C., Rybak, K., Meng, C., Stigliano, E., Botzenhardt, L., Szulc, B., Sklenar, J., Menke, FLH, Malone, JG, Brachmann, A., Klingl, A., & Robatzek, S. (2021). Биофизични и протеомични анализи предполагат функции на Pseudomonas syringae pv домати DC3000 извънклетъчни везикули при бактериален растеж по време на инфекция на растенията. bioRxiv, 2021.02.08.430144.