BCAT2 оформя невъзпалена туморна микросреда и предизвиква резистентност към анти-PD-1/PD-L1 имунотерапия чрез отрицателно регулиране на провъзпалителни хемокини и противораков имунитет
Oct 25, 2023
За да се подобри степента на отговор на монотерапията на блокадата на имунната контролна точка (ICB), е необходимо да се намери нова цел в комбинираната терапия. Чрез анализиране на индикатори, свързани с туморната микросреда (TME), е потвърдено, че BCAT2 оформя невъзпален TME при рак на пикочния мехур. Резултатите от мултиомиката показват, че BCAT2 има инхибиторен ефект върху набирането на цитотоксични лимфоцити чрез ограничаване на активността на провъзпалителните пътища, свързани с цитокини/хемокини и пътя на Т-клетъчен хемотаксис. Имуноанализите разкриват, че секрецията на хемокини, свързани с CD8+T-клетките, поддържа стабилна отрицателна корелация с BCAT2, генерирайки тенденция към намаляване на CD8+T клетките около BCAT2+ туморни клетки от далеч до близо до. Едновременното лечение на дефицит на BCAT2 и анти-PD-1 антитяло има синергичен ефект in vivo, което предполага потенциала на BCAT2 в комбинирана терапия. Освен това, стойността на BCAT2 при прогнозиране на ефикасността на имунотерапията е валидирана в множество имунотерапевтични кохорти. Заедно, като ключова молекула в TME, BCAT2 е нововъзникваща цел в комбинация с ICB и биомаркер за насочване на прецизна терапия.
Ползи от cistanche tubulosa-антитуморен
1. Въведение
Ракът на пикочния мехур (BLCA) е едно от най-честите злокачествени заболявания на пикочната система.[1] Изчислено е, че над 430000 пациенти се диагностицират по света всяка година.[2] Въпреки радикалното хирургично лечение, почти половината от пациентите с мускулно-инвазивен рак на пикочния мехур имат метастази[3]. Следователно, системната терапия играе важна роля при напреднал рак на пикочния мехур. С развитието на имунотерапията, особено блокадата на имунната контролна точка (ICB), натрупването на доказателства показва, че ICB има отлична производителност при елиминиране на туморния товар.[4] Все още обаче има голям брой пациенти, които не отговарят на монотерапията с ICB поради първична резистентност или придобита резистентност [5]. За разрешаване на неудовлетворената клинична нужда, комбинацията от други рационални терапии с ICB предоставя чисто нов поглед към резистентността към монотерапия. Туморната микросреда (TME) е сложна система и има дълбоко влияние върху ефикасността на имунотерапията [6]. При недостатъчно ниво на инфилтрация на цитотоксични Т-лимфоцити (CTL), невъзпаленият ТМЕ се счита за критичен фактор за неуспеха да се генерира мощен антитуморен имунен отговор по време на имунотерапия [7]. Ето защо е жизненоважно да се намери ключова молекула, която може да премоделира невъзпалената ТМЕ във възпалена ТМЕ и има потенциала да бъде цел за комбинирана терапия. Верижно-разклонената аминотрансфераза 2 (BCAT2) е основен ензим в процеса на метаболизма на серните аминокиселини.[8] Li et al. установяват, че BCAT2 е от съществено значение за развитието на рак на панкреаса чрез посредничество в катаболизма на аминокиселини с разклонена верига (BCAA).[9] Лий и др. демонстрира, че дефицитът на BCAT2 инхибира туморния растеж на панкреатичен дуктален аденокарцином (PDAC) чрез регулиране на липидния метаболизъм [10]. Въпреки че има няколко документирани изследвания, че BCAT2 влияе пряко върху биологичния процес на тумори чрез регулиране на метаболитни пътища, неговата роля в регулирането на имунния статус на TME никога не е била изследвана. В нашето проучване, чрез цялостен анализ на свързаните с TME индикатори в кохортата Xiangya BLCA и множество публични кохорти BLCA, ние проверихме, че BCAT2 вероятно оформя имуносупресивен TME в BLCA. За изследване на молекулярните механизми, ние допълнително извършихме едноклетъчно РНК секвениране (siRNA seq) и bulk-RNA seq, разкривайки, че BCAT2 играе репресивна роля в набирането на CTLs в TME, като инхибира активността на цитокин/хемокин-асоциираните сигнални пътища и Сигнални пътища на T-клетъчен хемотаксис. In vitro, мулти-имуноанализи показват, че секрецията на CTL-свързани хемокини има стабилни отрицателни корелации с експресията на BCAT2. Според панорамен анализ на тъканен микрочип (TMA), открихме взаимно изключваща се връзка между CTL и BCAT2+ туморни клетки в пространственото разпределение. In vivo беше открит съвместен ефект при комбинирана терапия на загуба на BCAT2 и ICB. По-важното е, че неговата роля в прогнозирането на лечебния ефект на имунотерапията е валидирана в кохортата на имунотерапията Xiangya BLCA.
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
2. Резултати
2.1. BCAT2 корелира отрицателно с противораковия имунитет на TME в BLCA
При повечето типове рак експресията на BCAT2 е по-висока в раковите тъкани, отколкото в нормалните тъкани (Фигура S1A, Подкрепяща информация) и неговият модел на експресия в BLCA е валидиран в Xiangya BLCA кохорта (Фигура S1B, Подкрепяща информация). Освен това, BCAT2 е широко експресиран в различни ракови клетъчни линии (Фигура S1C, Подкрепяща информация). Освен това, резултатите от изчерпателния панраков анализ на хемокинова система, MHCs, имуностимулатори и TIICs показват, че BCAT2 има значителни имуносупресивни ефекти при няколко вида рак, включително рак на пикочния мехур (BLCA), рак на гърдата (BRCA), бъбречни папиларни клетки карцином (KIRP), аденокарцином на панкреаса (PAAD), сарком (SARC) и карцином на щитовидната жлеза (THCA) (Фигура S2A, B, Подкрепяща информация). Освен това бяха открити и отрицателни корелации между BCAT2 и общи инхибиторни имунни контролни точки (PD- 1, PD-L1, CTLA-4 и LAG-3) (Фигура S2C–F, Подкрепяща информация ). Чрез цялостен панраков анализ открихме, че BCAT2 има най-дълбокия имуносупресивен ефект при BLCA. Следователно, ние допълнително проучихме неговата имунологична роля в BLCA. На базата на средната стойност на експресия на BCAT2, ние разделихме индивидите на група с висок BCAT2 и група с нисък BCAT2 в кохортата TCGA-BLCA. Очевидно серия от хемокини, хемокинови рецептори, МНС-свързани молекули и имуностимулатори са били понижено експресирани в групата с висок BCAT2 и свръхекспресирани в групата с нисък BCAT2 (Фигура 1А). Подобен резултат беше открит в цикъла на имунитета срещу рака, който обхваща множество основни стъпки в набирането и инфилтрирането на имунни клетки (Фигура 1B). Освен това, ние демонстрирахме силни отрицателни връзки между нивата на инфилтрация на имунните клетки (CD8+T клетка, CD4+T клетка, естествена клетка убиец (NK) и дендритна (DC) клетка) и BCAT2 в различни алгоритми (Фигура 1C). По същия начин, по-ниска експресия на ефекторни гени на имунната клетка (CD8+T клетка, NK клетка, макрофаг, Т хелперна 1 (Th1) клетка и DC клетка) е открита в групата с висок BCAT2 в сравнение с нисък BCAT2 група (Фигура 1D). По-важното е, че когато корелира BCAT2 с TIS резултат (Фигура S3, Подкрепяща информация) и инхибиторни имунни контролни точки (Фигура 1E), между тях бяха разкрити очевидни отрицателни връзки. Следователно спекулирахме, че BCAT2 може да регулира отрицателно имунния отговор на TME и да повлияе дълбоко на ефикасността на имунотерапията. Освен това горните резултати бяха добре валидирани в девет независими кохорти BLCA (GSE31684, GSE32894, GSE48075, GSE48276, GSE69795, GSE83586, GSE86411, GSE87304 и GSE128702) (Фигури S4– S12, Поддържаща информация). Най-накрая проверихме връзката между BCAT2 и TME отново в Xiangya BLCA кохорта. Последователно, експресията на BCAT2 има отрицателни връзки с активността на цикъла на имунния рак, нивата на инфилтрация на TIICs, TIS резултата и нивата на експресия на имунните контролни точки (Фигура 2A-C). Колективно разкрихме, че високата експресия на BCAT2 образува невъзпален TME в BLCA, а ниската експресия на BCAT2 оформя възпален TME в BLCA.
2.2. Изследване на механизма на BCAT2 при оформяне на TME чрез Bulk RNA-seq и siRNA-seq
В кохортата TCGA-BLCA, DEG между групи с висок/нисък BCAT2, групи с висок/нисък имунен резултат и групи с висок/нисък стромален резултат бяха идентифицирани и взеха пресечна точка (Фигура S13A, Подкрепяща информация). Интересното е, че BCAT2 положително свързаните DEG нямат пресечна точка с положително свързаните с имунния и стромален резултат DEG (Фигура 2D). Междувременно, същото явление се наблюдава при отрицателно свързаните EG сред тях (Фигура S13B, Подкрепяща информация). Тези констатации показват, че BCAT2 вероятно негативно регулира имунните пътища, свързани с имунитета. По съвпадение резултатите от анализите на GO и KEGG разкриват, че свързаните с BCAT2- DEG са най-значително обогатени в пътищата на миграция на левкоцити, активиране на Т клетки и взаимодействие цитокин-цитокинов рецептор (Фигура 2E, F). Следователно, ние спекулирахме, че BCAT2 оформя невъзпален TME в BLCA чрез инхибиране на дейностите на пътища, свързани с цитокини/хемокини. Въпреки това, характеристиката на груповото секвениране на NA определя неговото ограничение, чието ниво на експресия на гена се изчислява чрез средната стойност на всички клетки в тъканта. За да се преодолее ограничението, siRNA беше извършена върху три BLCA проби. Повече от 19 000 клетки бяха анализирани и класифицирани в шест категории: епителни клетки, фибробластни клетки, T/NK клетки, ендотелни клетки, В клетки и миелоидни клетки (Фигура 3A), отнасят се до признати биомаркери (EPCAM, LYZ, CD3D, COL1A1, CD79A, CD19, PECAM1 и VWF).[11] Поразително е, че BCAT2 се експресира главно в епителни клетки (EPCAM+), а не в ендотелни клетки и имунни клетки. Въз основа на натрупването на CNV, EPCAM+ епителните клетки се разглеждат като злокачествени уротелни клетки. За да се потвърди моделът на експресия на BCAT2, две външни групи siRNA бяха включени в изследването. В кохортата GSE135337 scRNA повече от 36 000 клетки бяха обработени и разделени на пет клъстера. Основно експресираният клетъчен подтип на BCAT2 все още беше злокачествена уротелна клетка на пикочния мехур (Фигура 3B). Подобен модел на експресия се появява отново в кохортата GSE145137 siRNA (Фигура 3C). Следователно моделът на мнозинството експресия върху злокачествените клетки предполага, че BCAT2 действа като имунорегулаторна част в TME главно чрез различни характеристики на раковите клетки. Въз основа на нивото на експресия на BCAT2, злокачествените уротелни клетки бяха разделени на група с висок BCAT2 и група с нисък BCAT2. Анализът на GSEA на GO термини в GSE135337 и GSE145137 siRNA кохорти разкри, че куп пътища, свързани с цитокини/хемокини, са значително понижени в групата с висок BCAT2, включително производство на хемокини, секреция на хемокини, регулиране на медиирания от хемокини сигнален път, отговор на хемокин, свързване с хемокин рецептор, цитокинова активност, свързване на цитокини и свързване с цитокинов рецептор (Фигура 3D–G; Фигура S14B, Подкрепяща информация). Междувременно хемотаксисът на левкоцитите, хемотаксисът на лимфоцитите, хемотаксисът на Т клетките и техните регулаторни пътища имат значително отрицателни корелации с BCAT2 (Фигура 3E–I; Фигура S14A, Поддържаща информация). Анализът на GSEA на термините KEGG показва, че пътищата на взаимодействие цитокин-цитокинов рецептор и обработката и представянето на антигена са очевидно понижени в групата с висок BCAT2 (Фигура 3F). Заедно, високата експресия на BCAT2 потиска активностите на провъзпалителни цитокини и пътища, свързани с хемокини, което води до понижено ниво на инфилтрация на TIICs, което в крайна сметка оформя невъзпален TME.
Фигура 1. BCAT2 корелира отрицателно с противораковия имунитет при TME на BLCA. A) Модел на експресия на хемокини, хемокинови рецептори, МНС молекули и имуностимулатори във високи и ниски BCAT2 групи. B) Активност на цикъла на имунитет срещу рак в групи с висок и нисък BCAT2. Седем цвята представляват седем стъпки в цикъла. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p <0,001. C) Корелации между BCAT2 и множество типове имунни клетки (CD8+T клетка, CD4+T клетка, DC клетка и NK клетка) в шест независими алгоритъма. D) Модели на експресия на множество подтипове на имунни клетки (CD8+T клетки, NK клетки, макрофаги, Th1 клетки и DC клетки), свързани ефекторни гени във високи и ниски BCAT2 групи. E) Корелации между BCAT2 и ICB свързани ефекторни гени. Числото в кръга означава коефициент на корелация.
Фигура 2. Валидиране на функцията на BCAT2 от Xiangya BLCA кохорта. A) Корелации между BCAT2/цикъл на имунитет срещу рак (вляво) и BCAT2/TIIC (вдясно). Плътните и пунктирани линии означават положителни и отрицателни връзки, дебелината на линиите означава коефициент на корелация, линиите с различни цветове представляват p-стойност на корелациите. B) Корелации между BCAT2 и ICB свързани ефекторни гени. C) Корелации между BCAT2 и TIS резултат, свързани с ефекторни гени. Числото в кръга представлява коефициент на корелация. D) Пресичане на BCAT2, имунен резултат и положително свързани гени със стромален резултат. E,F) Топ 20 обогатяващи сигнални пътища на GO и KEGG анализи в гените, свързани с BCAT2-.
Фигура 3. Изследване на механизма на BCAT2 при оформянето на TME чрез насипни RNA-seq и scRNA-seq. A, B) tSNE графики на едноклетъчния експресионен модел на BCAT2 в Xiangya siRNA кохорта и GSE135337 кохорта. C) Графика на цигулка на едноклетъчния експресионен модел на BCAT2 в кохортата GSE145137. D, E) GSEA анализ на термина GO показва активности на пътища, свързани с цитокин/хемокин, и пътища, свързани с хемотаксис на имунните клетки между различни BCAT2 групи в кохортата GSE135337. F) Анализът на GSEA на термина KEGG показва активности на представяне на антиген и взаимодействие на пътя на цитокините и цитокиновия рецептор между различни BCAT2 групи в кохортата GSE145137. G–I) GSEA анализ на термина GO показва активности на пътища, свързани с цитокин/хемокин, пътища, свързани с хемотаксис на имунни клетки, и пътища, свързани с миграция на имунни клетки между различни BCAT2 групи в кохортата GSE145137. J, K) GO и KEGG анализ на DEGs между BCAT2 OE и BCAT2 KD клетъчни линии.
2.3. BCAT2 променя моделите на експресия на свързаните с CD8+T-клетките хемокини и инхибира цитотоксичния капацитет на CTL
За валидиране на пътищата на обогатяване, споменати по-горе, BCAT2 свръхекспресия (BCAT2 OE) и BCAT2 нокдаун (BCAT2 KD) човешки (T24)/миши (MB49) клетъчни линии на рак на пикочния мехур бяха конструирани успешно (Фигура S15A–D, Подкрепяща информация) и бяха тествани с високопроизводително РНК секвениране. Очаквано, GO анализ на Т24 клетъчни линии разкри, че DEG са значително обогатени в пътищата на хемокин-медиирана сигнализация, отговор на хемокин, миграция на левкоцити и миграция на левкоцити (Фигура 3J). Анализът на KEGG пътя на Т24 клетъчни линии показа, че хемокиновият сигнален път, пътят на взаимодействие цитокин-цитокинов рецептор и пътят на рак на пикочния мехур са значително обогатени (Фигура 3K). По подобен начин бяха открити няколко критични пътя, свързани с цитокини/хемокини, в GO и KEGG анализи на клетъчни линии MB49 (Фигура S16A, B, Подкрепяща информация). Очевидно е, че различни цитокини и хемокини играят критична роля в регулирането на TME. Следователно е необходимо да се изследват цитокини/хемокини, които са специфично регулирани от BCAT2. Следователно, множество имуноанализи ProcartaPlex бяха приложени за идентифициране на вариациите на секрецията на цитокини/хемокини в човешки и миши клетъчни линии на рак на пикочния мехур. Изненадващо нивата на секреция на CCL3, CCL4, CCL5 и CXCL10 се регулират нагоре в човешки и миши BCAT2-KD клетъчни линии и се регулират надолу в човешки и миши BCAT2-OE клетъчни линии (Фигура 4A, B; Фигура S16C , D, Подкрепяща информация). В предишни проучвания CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 и CXCL10 се считат за решаващи хемокини за набиране на CD8+T клетки в TME.[12] Следователно, за по-добър изчерпателен анализ на свързаните с CD8+T-клетки хемокини, всички те бяха включени за по-нататъшно валидиране. Поразително е, че нивата на експресия на РНК на CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 и CXCL10 бяха значително понижени в BCAT2 OE клетки и значително повишени в BCAT2 KD клетки (Фигура 4C). По подобен начин, резултатите от ELISA показват, че нивата на секретиран протеин също имат отрицателни корелации с експресията на BCAT2 (Фигура 4D). Тези констатации показват, че свръхекспресията на BCAT2 инхибира транскриптомните и протеиновите нива на свързаните с CD8+T-клетките хемокини, включително CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 и CXCL10. По-важното е, че анализът на хемотаксиса разкри, че клетъчната линия BCAT2 OE значително инхибира способността за хемотаксис на CD8+T клетки (Фигура 4E, вляво). Обратно, клетъчните супернатанти на клетъчната линия BCAT2 KD са способни да привлекат повече CD8+T клетки, отколкото нейната отрицателна контрола (Фигура 4E, вдясно). Тези констатации показват, че BCAT2 може да повлияе на капацитета за хемотаксис на CD8+T клетките чрез регулиране на нивата на иРНК и протеини на свързани хемокини. Освен това, Т-клетъчно медииран анализ за убиване на ракови клетки беше използван за изследване на вариацията на цитотоксичността на Т клетките след директен контакт с туморни клетки, експресиращи различно ниво на BCAT2. Както е показано на Фигура 4F и Фигура S17A, B (Подкрепяща информация), свръхекспресията на BCAT2 върху туморни клетки директно потиска цитотоксичната функция на Т клетките и нокдаунът на BCAT2 върху туморните клетки значително обръща тенденцията. Анализът с поточна цитометрия на събрани Т клетки установи, че пропорциите на CD8+TNF-𝛼+ Т клетки и CD8+IFN-𝛾+ Т клетки имат значителни разлики в различните системи за съвместно отглеждане, което означава огромна промяна в активността на CD8+T клетки (Фигура 4G; Фигура S17C, D, Подкрепяща информация). Взети заедно, BCAT2 е в състояние да инхибира способността за набиране на CD8+T клетки чрез регулиране на свързани нива на хемокини, както и потискане на активността на CTL чрез директен контакт. Освен това, резултатът от Т-клетъчно-медиирания тест за убиване на ракови клетки (без Т-клетъчна група) може да заключи, че BCAT2 играе онкогенна роля при рак на пикочния мехур. Следователно, анализ на колония в плоча и анализ на миграция/инвазия през ямка бяха използвани за валидиране на тази хипотеза. Както се очакваше, свръхекспресията на BCAT2 значително засили способността за пролиферация, миграция и инвазия на туморните клетки, а нокдаунът на BCAT2 значително потисна тези поведения (Фигура S18A–F, Подкрепяща информация).
2.4. Валидиране на изключителна пространствена връзка между BCAT2+ туморна клетка и CD8+T клетка от TMA на Xiangya BLCA кохорта
Според резултатите от групови RNA-seq, scRNA-seq и витро експерименти, ние демонстрирахме, че BCAT2 играе имуносупресивна роля в BLCA чрез потискане на набирането и цитотоксичността на CD8+T клетки. Въпреки това, взаимодействието на BCAT2+ туморни клетки и CD8+T клетки все още е неизвестно на ниво човешка тъкан. В кохортата Xiangya BLCA представителни изображения и общ резултат от IHC разкриват отрицателна корелация между BCAT2 и CD8 (R=−0.38, p=0.0 038) (Фигура 5A, B). Многоцветно IF оцветяване на BCAT2+ туморни клетки (BCAT2+CK19+) и BCAT2+CD8+Т клетки беше проведено в TMA и полуавтоматично анализирано с помощта на Платформа за панорамно количествено определяне TissueFAXS. Както е показано на фигура 5C, обхватът на експресията на BCAT2 и CK19 до голяма степен се припокрива. Обратно, обхватът на експресията на BCAT2 и CD8 беше различен и отделен. Подробните пропорции на коекспресия на BCAT2+CK19+ клетки и BCAT2+CD8+T клетки бяха 87,29% и 5,09% (Фигура 5D, E), което беше в съответствие с модел на експресия на BCAT2 в scRNA-seq. В цялостния TMA все още имаше значителна разлика в съотношението на коекспресия между тях (Фигура S19A, Подкрепяща информация). По-важното е, че при многоизмерен анализ на градиента на разстоянието (0–25, 25–50, 50–100 и 100–150 μm) около BCAT2+ туморни клетки, броят на CD8+T клетки постепенно се увеличава от близо до далеч (Фигура 5F; Фигура S19B, Подкрепяща информация). Заедно демонстрирахме, че на ниво човешка тъкан BCAT2 също се експресира главно в туморни клетки, а туморната клетка BCAT2+ има изключителна пространствена връзка с CD8+T клетка.
Ползи от cistanche tubulosa-антитуморен
2.5. Загубата на BCAT2 повишава ефикасността на анти-PD-1 терапията
С подчертано неблагоприятно въздействие върху TME и отрицателна тясна корелация с инхибиторната блокада на контролните точки, предизвиква голям интерес да се изследва синергичният ефект от загубата на BCAT2 и лечението с анти-PD- 1. Преди имунотерапията беше изграден модел на подкожен рак на пикочния мехур от BCAT2 KD и контролни миши клетъчни линии. След това, анти-PD-1 терапия и контролна терапия бяха приложени към мишки, носещи тумор (Фигура 6А). В съответствие със своята онкогенна роля и механизъм за регулиране на хемокините in vitro, дефицитът на BCAT2 инхибира растежа на тумора и удължава времето за оцеляване in vivo, чрез регулиране на CD8+T свързани хемокини (Фигура 6B–E; Фигура S20A, Подкрепяща информация). От гледна точка на ефикасността на имунотерапията, въпреки че монотерапията с анти-PD-1 може частично да намали тежестта на тумора, съвместното лечение с BCAT2 KD и анти-PD-1 моноклонално антитяло (mab) показва по-добър ефект на потискане на тумора и печели повече обезщетение за оцеляване. В планирания ден туморите бяха събрани и подготвени за по-нататъшен анализ. Част от тях се смила в едноклетъчна суспензия и се провежда анализ на поточна цитометрия. С подобна популация от левкоцити и Т клетки (Фигура S20B–E, Подкрепяща информация) в тумора, по-висок дял от CD8+T клетки е показан в групата с дефицит на BCAT2, отколкото в групата с отрицателна контрола. По същия начин, групата на комбинирана терапия има по-масивна инфилтрация на CTL, отколкото групата на монотерапия (Фигура 6F–H). По-важното е, че показателите за цитотоксичност (GZMB, IFN-𝛾, TNF-𝛼 и перфорин) на CTLs също бяха подсилени в миши тумори със загуба на BCAT2 и комбинирано лечение в сравнение със съответната контрола (Фигура 6G, I–L). Другите части на туморите бяха направени в замразени срезове и приложено IF оцветяване. Както се очакваше, плътността на CD8+T клетки в областта на интерес (ROI) показа същата тенденция с анализ на поточна цитометрия (Фигура 6M, N). Тези констатации показват, че дефицитът на BCAT2 върху туморните клетки може да оформи възпалена ТМЕ и има голяма ефикасност при лечението на имунотерапия. За да се разбере ролята на CD8+T клетките в синергичния ефект от съвместното лечение, CD8𝛼 mab беше приложено, за да ги антагонизира при имунокомпетентни мишки (Фигура S21A, Подкрепяща информация) и потвърди неговия ефект на изчерпване чрез поточна цитометрия и IF (Фигура S21B, C, Подкрепяща информация). Очевидно, след изчерпване, тежестта на тумора и времето за оцеляване са значително обърнати (Фигура S21D–G, Подкрепяща информация). Тези констатации показват, че CD8+T клетките играят незаменима роля в синергичния ефект на комбинираната терапия.
Фигура 4. BCAT2 променя моделите на експресия на хемокини, свързани с CD8+T-клетки, и инхибира цитотоксичния капацитет на CTL. A, B) Топлинните карти на множеството имуноанализи ProcartaPlex показват вариация на секрецията на общи цитокини и хемокини в BCAT2 OE, BCAT2 KD и отрицателни контролни групи (n=3 на група). C, D) Хистограмите показват нормализирани нива на експресия на иРНК и концентрации на протеинова секреция на CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 и CXCL1 0 в BCAT2 OE (вляво), BCAT2 KD (вдясно) и отрицателни контролни групи (n {{ 15}} на група). *p < 0.{{20}}5; **p < 0.01; ***p <0,001. E) Тестът за хемотаксис показва различна способност за хемотаксис на CTL в BCAT2 OE, BCAT2 KD и отрицателни контролни групи (n=3 на група). *р <0,05; **p <0,01. F) Тест за убиване на ракови клетки, медииран от Т-клетки, показва различни способности за убиване на Т-клетки, съвместно култивирани с BCAT2 OE, BCAT2 KD и отрицателни контролни клетъчни линии (n=3 на група). G) Анализът с поточна цитометрия показва различни активности на CD8+T клетки в различни групи съвместни култури (n=3 на група).
Фигура 5. Валидиране на изключителни пространствени връзки на BCAT2+ туморни клетки и CD8+T клетки от TMA на Xiangya BLCA кохорта. A) IHC изображение на BCAT2 и CD8 при възпалени и невъзпалени видове TME. Скала: 50 μm. B) Корелация между BCAT2 и CD8 въз основа на IHC резултатите от тях в общата TMA. C) Многоцветно IF изображение на BCAT2, CK19, CD8 и комбиниран индекс при възпалени и невъзпалени типове TME. BCAT2+ клетка (розово), CK19+ клетка (циан), CD8+T клетка (оранжево) и клетъчно ядро (синьо). Скала: 50 μm. D,E) Подробни нива на коекспресия на BCAT2+CK19+ и BCAT2+CD8+ клетки в типичната проба. F) Анализ на градиента на разстоянието (0–25, 25–50, 50–100 и 100–150 μm) на CD8+T клетки около BCAT2+CK19+ клетки в типичния проба.
Фигура 6. Загубата на BCAT2 повишава ефикасността на анти-PD-1 терапията. А) Диаграма на терапевтичния план. B) Събрани тумори от различни терапевтични режими (n=5 на група). C–E) Количествено определяне на обема на тумора, телесното тегло и времето на преживяемост при различни терапевтични режими (n=5 на група). ns: без значение; *стр< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. F) Contour plots indicate the proportion of CD8+T cells; G) proportions of GZMB+CD8+T cells, IFN-𝛾+CD8+T cells, TNF- 𝛼+CD8+T cells, and Perforin+CD8+T cells in different therapy regimens. H) Quantified scatter plots exhibit proportion of CD8+T cells; I–L) proportions of GZMB+ CD8+T cells, IFN-𝛾+ CD8+T cells, TNF-𝛼+ CD8+T cells, and Perforin+ CD8+T cells in different therapy regimens (n = 5 per group). ns: no significance; *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. M, N) IF image and quantified histogram show densities of CD8+T cells in different therapy regimens (n = 3 per group). Scale bar: 20 μm. CD8+T cell (green) and cell nucleus (blue). ns: no significance, *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
Освен това, наред с туморните клетки, малка част от BCAT2 се експресира и в CD8+T клетки. Следователно, ние допълнително проучихме дали различното ниво на експресия на BCAT2 върху CD8+T клетки може да повлияе на техните дейности. След оцветяване на едноклетъчна суспензия на миши далак с BCAT2 и флуоресцентни антитела, свързани с Т клетки, сравнихме пропорциите на CD8+ TNF-𝛼+T и CD8+ IFN-𝛾+T клетки между BCAT 2+CD8+ и BCAT2−CD8+ групи. Интересното е, че открихме, че пропорциите са сходни между двете групи, разкривайки, че активността на CD8+T клетката е независима от нейното ниво на експресия на BCAT2 (Фигура S22A–C, Поддържаща информация).
2.6. BCAT2 прогнозира отговора на имунотерапията в няколко кохорти от имунотерапия в реалния свят
Горните констатации демонстрират имуносупресивна роля на BCAT2 при ТМЕ и синергичния ефект от комбинирането на загуба на BCAT2 с анти-PD-1 терапия. Неговият предсказващ потенциал за ефикасността на имунотерапията обаче е неясен. Следователно, в кохортата TCGA-BLCA, резултатите за обогатяване на пътищата, свързани с имунотерапията, бяха сравнени между групите с висок и нисък BCAT2. Както е показано на фигура S23A (Подкрепяща информация), групата с нисък BCAT2 има по-активни гени в пътища, свързани с имунотерапията, което може да заключи, че ниската експресия на BCAT2 представлява по-чувствително състояние към имунотерапията. За по-нататъшно валидиране 58 пациенти с мускулно-инвазивен рак на пикочния мехур (MIBC), които са приели неоадювантна анти-PD-1 терапия в нашата болница, бяха включени в кохортата за имунотерапия Xiangya BLCA. Представителни IHC, IF и CT изображения на отговорилите и неотговорилите предполагат, че нивото на експресия на BCAT2 има тясна връзка с ефикасността на имунотерапията - индивид с ниско ниво на експресия на BCAT2 е по-вероятно да отговори на имунотерапията, отколкото индивид с високо ниво на експресия на BCAT2 (Фигура 7A–C). Освен това IHC резултатът на кохортата за имунотерапия Xiangya BLCA и матрицата на експресия на mRNA на кохортата IMvigor210 показват силна отрицателна корелация между BCAT2 и PD-L1 (R=−{{3{{32} }}}.4, p=0.002; R=−0.41, p < 0.001) (Фигура S23B, C, Подкрепяща информация). Следователно, ние директно сравнихме ефикасността на имунотерапията между групите с висок и нисък BCAT2 в имунотерапевтичната кохорта Xiangya BLCA и открихме, че групата с нисък BCAT2 има значително по-висок дял от отговорилите, отколкото групата с висок BCAT2 (p=0.001) (Фигура 7D). Освен това, ние оценихме прогнозните стойности на BCAT2, PD-L1 и комбинирания индекс (BCAT2+PD-L1) за патологичния отговор на имунотерапията и открихме страхотното представяне на комбинирания индекс (BCAT2+PD- L1) върху точността на прогнозиране (Фигура 7E). Вдъхновяващо, в аспекта на резултата от преживяемостта, групата с нисък BCAT2 има по-дълга преживяемост без заболяване (DFS) в сравнение с групата с висок BCAT2 (p=0.032) (Фигура 7F), демонстрирайки прогнозната стойност на BCAT2 в BLCA имунотерапия. В клиниката индивидите с пустинен ТМЕ са по-склонни да имат ограничена ефикасност на имунотерапията, отколкото индивидите с възпален ТМЕ, което допълнително подчертава важността на индикаторите за прогнозиране. Следователно, ние избрахме всички индивиди с пустинен TME в кохортата IMvigor210 и проведохме цялостната оценка. При пряко сравнение на нивото на експресия на BCAT2 сред различни групи с отговор, CR групата (респондер) има значително по-ниско ниво на експресия на BCAT2 от SD и PD групите (нереагиращи) (Фигура 7G). По-важното е, че комбинираният индекс (BCAT2+PD-L1) също имаше страхотно представяне по отношение на точността на прогнозиране (Фигура 7H). Въпреки че няма значителна разлика в общата преживяемост (OS) между групите с висок и нисък BCAT2 в кохортата от пустинен тип на IMvigor210, прогнозната тенденция все още е подобна на резултата от кохортата за имунотерапия Xiangya BLCA (Фигура 7I). Освен PD-L1, микросателитната нестабилност (MSI) е другият основен предиктор за ефикасността на имунотерапията. Състоянието на поправка на несъответствие (MMR) — професионален MMR (pMMR) и недостатъчен MMR (dMMR) поддържат високо съответствие с нискочестотен MSI (MSI-L) и високочестотен MSI (MSI-H).[13] Следователно, ние проведохме цялостна оценка на всички индивиди в кохортата за имунотерапия Xiangya BLCA въз основа на резултатите от оцветяването на четири MMR маркерни гена (MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2). Резултатът разкрива значително по-висок дял на dMMR (MSI-H) в групата с нисък BCAT2 в сравнение с групата с висок BCAT2 (p=0.02) (Фигура S23D, E, Подкрепяща информация). Освен това, ние оценихме прогнозните стойности на MMR, BCAT2 и комбинирания индекс (MMR+BCAT2) за ефикасността на имунотерапията и открихме, че комбинираният индекс (MMR+BCAT2) има допустимо представяне по отношение на точността на прогнозиране (Фигура S23F, Подкрепяща информация). Заедно тези констатации показват, че BCAT2 е квалифициран да действа като допълнителен предиктор на ефикасността на имунотерапията с BLCA. И накрая, прогностичната стойност на BCAT2 в отговор на имунотерапия е изследвана при различни видове рак. Ние открихме, че индивиди с висока експресия на BCAT2 показват значително по-лош процент на отговор (p=0.04) в кохортата GSE35640 (меланом) (Фигура 7J). Въпреки че няма значителни разлики в степента на отговор между групите с висок и нисък BCAT2 в групата GSE173839 (рак на гърдата), GSE135222 (NSCLC) и Gide 2019 (меланом), пациентите с ниска експресия на BCAT2 все още са по-склонни да имат положителен отговор към имунотерапия (Фигура 7K–M).
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity
【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2.7. Стойността на BCAT2 при прогнозиране на молекулярния подтип и насочване на прецизна терапия
С голяма хетерогенност, съществуваща в традиционната хистологична класификация, нарастващите доказателства показват, че молекулярният подтип е в състояние да осигури по-точна класификация въз основа на профила на транскриптома в BLCA.[14] Освен това, със сходни имунологични характеристики в същия подтип, молекулярната класификация има голям потенциал за предсказване на ТМЕ и насочване на прецизна терапия в клиниката [15]. Чрез цялостен анализ на различни молекулярни подтипове системи в кохортата TCGA-BLCA, ние открихме, че индивиди с ниска експресия на BCAT2 са по-вероятно класифицирани в базален подтип, придружен от активирани пътища на базална диференциация, EMT диференциация, имунна диференциация, интерферонов отговор, и така нататък. Индивидите с висока експресия на BCAT2 се класифицират главно в луминални подтипове, придружени от активни пътища на луминална диференциация, уротелиална диференциация и Ta (Фигура S24A, Подкрепяща информация). Според консенсуса на молекулярния подтип, базалният подтип има по-високо ниво на инфилтрация на ефекторни лимфоцити и по-активен IFN-𝛾 сигнален път от луминалния подтип, [16] което предполага по-добра ефикасност на имунотерапията. След това се използва AUC за оценка на точността на прогнозата. Учудващо, но с изключение на системата от подтип Baylor (AUC=0.76), по-голямата част от AUC беше над 0.90 в други системи (Фигура S24B, Подкрепяща информация), което означава стабилна точност на прогнозиране на BCAT2 в молекулярния подтип. За да проучим по-нататък ролята му в прогнозирането на ефикасността на други терапии, сравнихме активността на таргетната терапия на рецептора на епидермалния растежен фактор (EGFR) и свързаните с лъчетерапията пътища между групи с висок и нисък BCAT2. С очевидно повишено регулиране на активността, пациентите в групата с нисък BCAT2 е по-вероятно да имат положителен отговор на EGFR-таргетната терапия и лъчетерапия (Фигура S24C, Подкрепяща информация). За повишаване на надеждността на прогнозиране на молекулярния подтип и чувствителността на лечението, осем BLCA кохорти (Xiangya BLCA кохорта, GSE31684, GSE69795, GSE48075, GSE128702, GSE83586, GSE52329 и E-MTAB-1803) и една BLCA имунотерапевтична кохорта (IMvigor210) бяха кандидатства за външно валидиране. Наред с отличната точност на прогнозата, подобни открития бяха открити в тези кохорти (Фигури S25–S27, Подкрепяща информация). Хиперпрогресивното заболяване (HPD) е изключително нечувствително състояние към имунотерапията. За изследване на влиянието на BCAT2 върху HPD, свързаните с HPD биомаркери бяха събрани от предишни проучвания [17] и CNV на биомаркерите бяха сравнени между групи с нисък и висок BCAT2. С изключение на EGFR, нивата на CNV амплификация на други HPD-позитивни свързани биомаркери (червен символ) са по-високи в групата с висок BCAT2, особено MDM2 (p=0.0116). Степента на делеция на CNV на HPD-негативни свързани биомаркери (зелен символ) е по-ниска в групата с висок BCAT2 (Фигура S24D, Подкрепяща информация). Резултатът показва, че пациентите с висока експресия на BCAT2 имат потенциален риск от HPD по време на имунотерапия. Неоадювантната химиотерапия (NAC) е решаваща терапия при BLCA. Маркерите, прогнозиращи отговора на NAC в BLCA, бяха събрани от преглед на Buttigliero et al [18]. и техните нива на мутация бяха сравнени между двете групи. Въз основа на по-високи общи нива на мутация на биомаркери и по-честа мутация на RB1 в групата с нисък BCAT2, ние спекулирахме, че индивид с ниска експресия на BCAT2 има по-добра ефикасност на NAC в клиниката (Фигура S24E, Подкрепяща информация). Следователно, базата данни на Drugbank беше използвана за сравняване на ефикасността на няколко обичайни режима на химиотерапия между две групи и установи, че индивиди с ниска експресия на BCAT2 са по-склонни да отговорят на химиотерапия. Освен това, групата с нисък BCAT2 също показа по-добра ефикасност при обичайните режими на имунотерапия и ERBB терапия. Неочаквано пациенти с висока експресия на BCAT2 вероятно получават по-добри лечебни ефекти при антиангиогенна терапия (Фигура S24F, Подкрепяща информация). Взети заедно, индивидите с ниска експресия на BCAT2 принадлежат към възпален молекулярен подтип, основен подтип, което означава по-положителен отговор на имунотерапия, химиотерапия, лъчетерапия, EGFR-таргетна терапия и ERBB терапия. За съжаление, пациенти с висока експресия на BCAT2 имат слаб отговор на тези лечения. Въпреки това, антиангиогенната терапия може да бъде искрица светлина за тях.
Фигура 7. BCAT2 прогнозира отговора на имунотерапията в няколко кохорти от имунотерапия в реалния свят. A) IHC изображение на BCAT2 и PD-L1 между отговорили и неотговорили в кохорта за имунотерапия Xiangya BLCA. Скала: 50 μm. B) Многоцветно IF изображение на BCAT2 и PD-L1 между отговорили и неотговорили в кохорта за имунотерапия Xiangya BLCA. Скала: 50 μm. BCAT2+клетка (зелена), PD-L1+клетка (жълта) и клетъчно ядро (синьо). C) CT изображение на разлика в ефикасността на имунотерапията между индивиди с високи и ниски нива на експресия на BCAT2. Червената стрелка сочи към областта на тумора. D) Обща разлика в степента на отговор между групите с висок и нисък BCAT2 в кохортата за имунотерапия Xiangya BLCA. E) Точност на прогнозиране на BCAT2, PD-L1 и комбиниран индекс (BCAT2+PD-L1) при отговор на имунотерапия в кохорта за имунотерапия Xiangya BLCA. F) Разлика в преживяемостта без заболяване (DFS) между групите с висок и нисък BCAT2 в кохортата за имунотерапия Xiangya BLCA. G) Разлики в нивото на експресия на BCAT2 сред CR, PR, SD и PD групите в пустинния тип на групата IMvigor210. *р <0,05; ns: няма значение. H) Точност на прогнозиране на BCAT2, PD-L1 и комбиниран индекс (BCAT2+PD-L1) при отговор на имунотерапия в кохорта IMvigor210 от пустинен тип. I) Разлика в общата преживяемост (OS) между групи с висок и нисък BCAT2 в пустинен тип кохорта IMvigor210. J–M) Разлики в отговора на имунотерапията между групи с висок и нисък BCAT2 в кохорти GSE35640, GSE173839, GSE135222 и Gide2019.
3. Дискусия
Като ключов ензим в процеса на катаболизъм на BCAA, предишни изследвания се фокусираха главно върху свързаната с метаболизма роля на BCAT2 при заболявания като затлъстяване, диабет и аритмия. Ма и др. демонстрира, че премахването на BCAT2 в мастната тъкан може да ускори покафеняването на мастната тъкан и термогенезата, което води до намален процент на затлъстяване при мишки.[19] Чрез откриване на кръвни проби от повече от 2000 индивида, Gerszten et al. изобразява свързан с диабета метаболитен профил и установява, че BCAT2-трансформираните BCAA играят решаваща роля в развитието на заболяването.[20] Portero и др. разкри, че безсмислените мутации на BCAT2p.Q300*/p.Q300* водят до повишени нива на BCAA и предизвикват аритмии при мишки.[21] Наскоро няколко проучвания установиха, че BCAT2 има тясна връзка с рака. Лей и др. разкри, че медиираното от ацетилиране разграждане на BCAT2 може да забави развитието на панкреатичен дуктален аденокарцином (PDAC) чрез регулиране на нивото на метаболизма на BCAA.[22] Wang и др. счита, че ограниченото ниво на транскрипция на BCAT2 води до понижено вътреклетъчно ниво на глутамат, което стимулира фероптозата на хепатомните клетки [23]. Въпреки това, всички съществуващи изследвания подчертават влиянието на BCAT2-медиирания BCAA катаболизъм върху биологичния процес на рак, вместо да изследват съвсем нов механизъм. В това проучване за първи път разкрихме имуносупресивната роля на BCAT2 при TME. Прилагането на имунотерапия предефинира лечението на рак, със страхотно качество на живот и удължено време на оцеляване. Независимо от това, поради хетерогенността на туморната имунна екологична система, само част от индивидите получават задоволителна ефикасност. TME е сложна система, съставена от туморни клетки, имунни клетки, стромални клетки и капиляри.[24] Според нивото на инфилтрация на CTL, TME може да се класифицира като цяло на възпалени и невъзпалени типове [25]. Нарастващите доказателства показват, че възпаленият ТМЕ играе положителна роля в предизвикването на ефективни антитуморни имунни отговори по време на терапията [26]. Следователно, ние изчерпателно анализирахме множество индикатори, свързани с TME, и открихме, че високата експресия на BCAT2 оформя невъзпален TME, с възпрепятстван цикъл на имунитет срещу рак, репресивен модел на експресия на хемокинов профил, MHC молекули и недостатъчно ниво на инфилтрация на TIIC. В допълнение, BCAT2 е отрицателно свързан с TIS и ефекторните гени на ICB, което предполага, че индивиди с висока експресия на BCAT2 е по-вероятно да не реагират на имунотерапия. За да потвърдим нашата хипотеза, сравнихме степента на отговор между групите с висок и нисък BCAT2 в имунотерапевтичната кохорта Xiangya BLCA и други имунотерапевтични кохорти. Изненадващо, имаше значителни разлики в множество кохорти, което показва, че BCAT2 също е в състояние да играе предиктор за ефикасността на имунотерапията, особено при BLCA. Освен това, scRNA-seq беше използван за изследване на регулиращия механизъм на BCAT2 в TME и посочи, че активността на свързаните с цитокини/хемокини сигнални пътища, Т-клетъчният сигнален път за хемотаксис и Т-клетъчният сигнален път за миграция имат значителни отрицателни корелации с BCAT2. Като критична регулаторна мрежа, цитокините и хемокините са незаменими за трафик на различни имунни клетки в TME. Хемокиновата система има четири суперсемейства: C, CC, CXC и CX3C, със значително излишък в сдвояването на лиганди и рецептори [27]. Цитокините могат да бъдат разделени на подфамилии Th1, Th2 и Th17 въз основа на тяхната биологична функция.[28] Чрез секрецията на различни нива от тях, борбата между туморните клетки и имунните клетки е достатъчна, за да препрограмира характеристиките на TME.[29] Независимо от това, сред по-голямата част от цитокини и хемокини е необходимо да се отсее най-ценният клъстер. Използвайки 34-панел за имуноанализ на цитокини и хемокини, ние разкрихме, че хемокините, включително CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 и CXCL10, са в силна отрицателна корелация с експресията на BCAT2 в човешки и миши ракови клетки на пикочния мехур. Добре известно е, че CXCL9 и CXCL10 са отговорни за набирането на CD8+T клетки в TME.[30] За да установим функцията на CCL3, CCL4 и CCL5, потърсихме предишни изследвания. Харлин и др. използваха протеинови масиви и qPCR, за да разкрият, че регулирането нагоре на CCL3, CCL4 и CCL5 е в състояние да насърчи миграцията на CD8+T клетки в меланома.[31] Noman и др. установиха, че повишената популация на секреция на CCL5 подпомага установяването на провъзпалителен TME чрез трафик на CTLs в тъкан на колоректален рак [32]. Чрез IHC и RNA-seq на хемокинов профил в множество кохорти, Romero et al. демонстрира, че CCL4 и CCL5 имат силна връзка с нивото на инфилтрация на CD8+T клетки при рак на панкреаса.[33] Следователно считаме, че свързаните с CD8+Т-клетките хемокини са основните хемокини, регулирани от BCAT2 при рак на пикочния мехур. Въпреки че демонстрирахме силните отрицателни корелации между BCAT2 и свързаните с CD8+T клетки хемокини, основният регулаторен механизъм между тях все още трябва да бъде допълнително проучен. Проучването на Peterson et al. демонстрира, че активирането на сигналния път на MAP киназата (MAPK) може да индуцира производството на CX3CL1 [34]. Xu и др. разкриха, че сигналният път JAK-STAT регулира секрецията на Th1-свързани хемокини, причинявайки намалено ниво на инфилтрация на TIL.[35] Наскоро Peng et al. установи, че деметилазата JMJD3 може да инхибира експресията на свързани с CD4+T-клетките хемокини и да намали нивото на инфилтрация на цитотоксични Т-клетки в TME, което представлява решаваща роля на епигенетичната модификация в регулирането на експресията на хемокини.[36] Mayo и др. също разкрива, че епигенетичен инхибитор, хистон деацетилаза 1, има голям капацитет да потиска експресията на CXCL8 чрез активиране на сигналния път на ядрения фактор-𝜅B (NF-𝜅B) [37]. Освен това, като символи на метаболизма на туморните клетки, аеробна гликолиза и реактивни кислородни видове (ROS), показващи страхотни резултати при индуциране на експресия на CXCL8 и CXCL14 чрез повишаване на активността на сигналните пътища на NF-𝜅B и транскрипционен фактор активатор протеин 1 (AP{{93) }}).[38] Интересното е, че в нашето проучване сигналните пътища на NF-𝜅B, STAT и MAPK бяха значително обогатени между високи и ниски BCAT2 клетъчни линии (Фигура 3K; Фигура S16A, B, Поддържаща информация). Следователно, комбинирайки с горните проучвания, ние ще проучим допълнително ключовата молекула в механизма на регулиране на BCAT2 и CD{100}}T-свързаните хемокини. Ограниченият обективен процент на отговор на монотерапията с ICB подтиква появата на стратегия за комбинирана терапия. За превръщане на неимунологичен TME в имунологичен TME, Wolchok et al. прилага съвместно лечение с ниволумаб (анти-PD{103}} терапия) и ипилимумаб (анти-CTLA-4 терапия) при пациенти с меланом и открива окуражаващ лечебен ефект, приписвайки синхронно подобрено праймиране, активиране и убиване на CTLs [39] Повече от комбиниране с друг тип ICB, химиотерапията плюс имунотерапията е алтернативна терапевтична опция. Като режим на лечение от първа линия за напреднал уротелиален карцином, няколко проучвания установиха, че базираната на цисплатин химиотерапия е способна да оформи провъзпалителна TME чрез повишаване на нивото на експресия на MHC I клас върху дендритни клетки и увреждане на MDSC и Tregs [40]. По случайност Homma et al. разкриват, че друго обичайно химиотерапевтично лекарство за рак на пикочния мехур — гемцитабин — може да подобри количеството инфилтрация на CD8+T клетките и да увреди имуносупресивните имунни клетки при ТМЕ.[41] В нашия предклиничен експеримент с животни, съвместното лечение на загуба на BCAT2 и анти-PD-1 mab показва по-отчетлива антитуморна ефикасност в сравнение с монотерапията с анти-PD-1 mab при имунокомпетентни мишки, което осигурява иновативно лечение стратегия за пациенти с резистентност към ICB. Междувременно, чрез анализ на поточна цитометрия и IF, ние демонстрирахме, че събарянето на BCAT2 не само набира повече популация от CTL в TME, но също така подобрява убиващата активност на CTL. По подобен начин, Peng et al. установяват, че свръхекспресията на LGALS2 намалява количеството на инфилтриращите CTL, както и цитотоксичните биомаркери при мишки, носещи рак на гърдата [42]. Yang и др. илюстрира, че CXCL13 е в състояние да повиши отговора на имунотерапията при миши модели на рак на яйчниците чрез повишаване на нивото на инфилтрация на CD8+T клетки и нивото на секреция на GZMB, IFN-𝛾 и IL-2.[43] Придружавайки по-силен противораков отговор, комбинираната терапия допълнително нарушава съществуващата имунна обратна връзка, което вероятно води до сериозни странични ефекти. Според модела на експресия на BCAT2 на ниво siRNA, специфично експресиран в туморни клетки, а не в имунни клетки и ендотелни клетки, можем предварително да заключим, че загубата на BCAT2 или инхибитор на BCAT2 е по-малко вероятно да доведе до ужасни неблагоприятни ефекти. Въпреки това, оптималната доза и интервал от време на BCAT2 инхибитор и анти-PD-1 mab в комбинирана терапия все още трябва да бъдат проучени.
За насочване на прецизна терапия при индивиди, ние свързахме BCAT2 с молекулярния подтип на BLCA и критични биомаркери на различни терапии. Въз основа на достоверни прогнози в множество кохорти, ние открихме, че имунотерапията, химиотерапията, лъчетерапията и EFGR-таргетната терапия са подходящи за пациенти с ниска експресия на BCAT2. Антиангиогенната терапия се препоръчва при пациенти с висока експресия на BCAT2. За разлика от сложния процес на откриване на молекулярни подтипове, BCAT2 е преносим предиктор за прецизна терапия. Неизбежно има някои ограничения в нашите проучвания. Първо, размерите на пробите и времето за проследяване на кохортата Xiangya BLCA и кохортата за имунотерапия Xiangya BLCA бяха ограничени. Трябва допълнително да увеличим размера на извадката и да продължим стандартизираното проследяване. Второ, като кохорта от реалния свят, имунотерапевтичната кохорта Xiangya BLCA съдържа различни опции за операция, които вероятно са причинили потенциално отклонение. Ще разширим допълнително нашата кохорта и ще проведем анализ на подгрупи въз основа на същата опция за операция. Трето, кооперативният ефект на комбинираната терапия in vivo трябва да бъде допълнително валидиран чрез системно приложение на BCAT2 инхибитор. В обобщение, като имуносупресивна роля в TME на BLCA, BCAT2 е нововъзникваща цел в комбинираната терапия на ICB и точен биомаркер за прецизна терапия.
Ползи от Cistanche tubulosa- укрепване на имунната система
4. Експериментален участък
cohort: As illustrated in a previous study,[44] 56 eligible BLCA patients accepted surgical treatment (TURBT (transurethral resection of bladder tumor) or radical cystectomy) in Xiangya Hospital. All the samples were conducted through high throughput RNA sequencing (RNA-seq) to acquire transcriptome information. Then, data on RNA-seq, clinicopathologic features, and follow-up information of these patients were utilized to construct the Xiangya BLCA cohort (Table S1, Supporting Information). Xiangya BLCA immunotherapy cohort: 58 MIBC patients were included in the Xiangya BLCA immunotherapy cohort. All the samples were obtained by diagnostic TURBT before the implementation of neoadjuvant anti-PD-1 therapy. After at least two cycles standard neoadjuvant immunotherapy (NAI), TURBT, or radical cystectomy (RC) were conducted based on treatment response and patients' willingness. 17 individuals with complete response (CR) and 16 individuals with partial response (PR) were classified into responders, 17 individuals with stable disease (SD), and 8 individuals with progressive disease (PD) were classified into nonresponders. The detailed clinicopathological characteristics are listed in Table S2 (Supporting Information). Xiangya scRNA cohort: Three samples of muscle-invasive bladder cancer were implemented scRNA-seq, constituting the Xiangya scRNA cohort. Detailed preparation of single-cell suspension, data transformation, and cell quality control have been elaborated in previous articles.[45] In simple terms, three tumor samples were loaded on a Chromium Single Cell Controller instrument (10×Genomics, USA) to produce single-cell gel beads in suspension. Seurat R package was applied to transform the count matrix into Seurat format. Four standards were set up for excluding low-quality cells in the matrix: unique molecular identifier (UMI) amount < 1000, gene quantity < 200, log10GenesPerUMI < 0.70, and mitochondrial-originated UMI counts > 20%. After integrating the samples based on the top 3000 variable traits, principal component analysis (PCA) and the Findclusters algorithm were employed to identify main cell clusters. Based on the level of copy number variation (CNV) in epithelial cells, malignant bladder carcinoma cells were selected from clusters. The study plan was approved by the ethics committee of Xiangya Hospital, Central South University (Item number: 2021101175). All the specific men were collected complying with informed consent rights. The Cancer Genome Atlas (TCGA) Database: RNA expression matrix, survival outcome, and CNV of 33 types of carcinomas were acquired from the UCSC Xena database. Log2 transformation was employed to normalize RNA-seq data and the GISTIC algorithm was applied to process CNV data. Gene Expression Omnibus (GEO) Database: Transcriptome data of 1740 samples from nine BLCA cohorts: GSE31684 (93 samples), GSE48075 (142 samples), GSE69795(61 samples), GSE32894 (308 samples), GSE48276 (116 samples), GSE83586 (307 samples), GSE86411 (132 samples), GSE52329 (20 samples), GSE87304 (305 samples), and GSE128702 (256 samples) were obtained from GEO database. RNA-seq data of three immunotherapy cohorts: GSE35640 (14 samples, melanoma, and MAGE-A3 therapy), GSE173839 (105 samples, breast cancer, and anti-PD-L1 therapy), and GSE135222 (27 samples, nonsmall cell lung carcinoma (NSCLC), and anti-PD-1/PD-L1 therapy) were downloaded from GEO database. Single-cell transcriptomic characterization of two BLCA scRNA cohorts: GSE135337 (8 samples) and GSE145137 (3 samples) was obtained from the GEO database. Data processing was similar to the Xiangya siRNA cohort. Other Databases: RNA expression matrix and clinicopathologic characteristics of immunotherapy cohorts: IMvigor210 (348 samples, bladder cancer, and anti-PD-1 therapy) and Gide2019 (58 samples, melanoma, anti-PD-1, or anti-CTLA-4 therapy) were collected from http://researchpub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies and TIDE database (http://tide. dfci.harvard.edu/). Data of RNA-seq and clinical characteristics of a BLCA cohort—E-MTAB-1803 (85 samples)—was downloaded from ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/). BCAT2 expression levels in various types of cancer cell lines were downloaded from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) database. Specific clinicopathologic and follow-up information from public databases were listed in our previous studies.[44,46] Assessment of Immunological Identity of TME in BLCA: As depicted in our previous study,[44] a comprehensive evaluation of the immunological trait of TME in BLCA was summarized. The tracking tumor immunophenotype (TIP) website (http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/) was used to assess the activities of cancer immunity cycles, which reflected the effectiveness of antitumor immunity. It is separated into seven concrete steps: release and presentation of tumor antigen (steps 1 and 2), startup and activation of effector T cells (step 3), trafficking and assisting diverse immune cells into TME (steps 4 and 5), recognition and killing cancer cells (steps 6 and 7).[47] Six independent algorithms (TIMER, CIBERSORT, CIBERSORT-ABS, MCP-COUNTER, TISIDB, and XCELL) were employed to calculate the infiltration levels of tumor-infiltrating immune cells (TIICs).[48] Furthermore, effector genes of immune cells, ligands and receptors of chemokines, major histocompatibility complex (MHC) molecules, and immunostimulators were collected for evaluating immunological characteristics of TME multi-dimensionally. T cell-inflamed score (TIS) and markers of ICB were utilized to assess the host sensitivity state to immunotherapy.[49] Enrichment Pathways Analysis: Limma R package with empirical Bayesian function was employed to screen differentially expressed genes (DEGs) between high and low expression of BCAT2 in the RNA expression matrix.[50] Screening thresholds were |log (fold change) (log FC) |>1,5 и коригираната p-стойност < 0.05. Анализите на генната онтология (GO) и Киото Енциклопедия на гените и геномите (KEGG) бяха проведени върху идентифицирани DEG от пакета ClusterProfiler R.[51] Seurat R пакет с алгоритъм Findmarker беше приложен за изчисляване на нивото на експресия на BCAT2 върху епителни клетки в scRNA-seq. На базата на разнообразно класиране на генната експресия по стойност на промяна на гънките (FC), беше приложен анализ на обогатяване на набор от гени (GSEA) за преценка на положителни и отрицателни корелации. Идентифициране на имуно-свързани DEG: пакетът ESTIMATE R беше използван за изчисляване на имунни и стромални резултати в кохортата TCGA-BLCA. Според средната стойност на два резултата и нивото на експресия на BCAT2, пакетът Limma R беше приложен за идентифициране на положителни/отрицателни имунно-свързани и стромално-свързани DEG. R пакетът с диаграма на Venn беше използван за пресичане на различни групи и определяне на общите DEG. Класификация на индивиди, използващи молекулярни подтипове на BLCA: Седем молекулярни подтипа на BLCA (UNC, Baylor, TCGA, MDA, Lund, CIT и Consensus) са широко прилагани в клиниката за оценка на характеристиките на TME и ефикасността на различни терапии [52]. Като се има предвид сложното взаимодействие на различни подтипове, ние колективно ги разделихме на две основни категории - базални и луминални подтипове.[16] R пакетите на Consensus MIBC и BLCAsubtyping бяха използвани за класифициране на индивидите в специфични подтипове. След нормализиране, площта под ROC кривата (AUC) беше използвана за оценка на надеждността на BCAT2 при прогнозиране на класификацията. Прецизна терапевтична оценка на пациенти: Както беше показано в предишното ни проучване [53], серия от критични генни сигнатури, които могат да предскажат ефикасността на химиотерапията, лъчетерапията, таргетната терапия и имунотерапията, бяха събрани от различни проучвания и бази данни [16, 54] Алгоритъмът ssGSEA беше използван за пресмятане на резултатите за обогатяване на генните подписи.[55] Клетъчни линии: Човешки ракови клетки на пикочния мехур (T24) и ракови клетки на миши пикочен мехур (MB49) бяха закупени съответно от Procell Life Science & Technology (Wuhan, Китай) и Meisen CTCC (Jinhua, Китай). Те се поддържат в среда DMEM (BasalMedia, Китай) с 10% фетален говежди серум (FBS) (BI, Израел), 1% пеницилин и стрептомицин (NCM Biotech, Китай) и се култивират в инкубатор при 37 градуса температура, съдържаща 5% CO2. Конструиране и RNA-seq на стабилни клетки за трансфекция: Лентивирусен вектор plenti-BCAT2-flag-puromycin (GV341) е проектиран и конструиран от GeneChem (Шанхай, Китай) за стабилна свръхекспресия на BCAT2- (BCAT2 OE) клетъчна линия и нейната отрицателна контрола (oe-вектор). В допълнение, BCAT2- РНК с къса фибичка (shRNA) беше клонирана в GV112-лентивирусен вектор от GeneChem (Шанхай, Китай) за стабилна BCAT2-нокдаун (BCAT2 KD) клетъчна линия . Целевите последователности на shRNA са изброени в Таблица S3 (Подкрепяща информация). След това рекомбинантните BCAT2 лентивируси се трансфектират в обективни клетки съгласно инструкциите на производителя. 2 ug mL-1 пуромицин (Amersco, САЩ) се използва за филтриране на стабилни трансфекционни клетки в продължение на три дни. За валидиране на ефикасността на трансфекцията бяха приложени Western blot и количествена PCR с обратна транскрипция (qRT-PCR). В крайна сметка, стабилна клетка за трансфекция с най-добра ефикасност беше избрана за RNA-seq и допълнителни експерименти. Три дублирани проби от всяка клетъчна линия бяха изпратени до платформата BGI RNA-seq (Шенжен, Китай). Критериите за избор на DEG и анализ на пътищата на обогатяване бяха същите, както са описани в 2.3 (анализ на пътищата на обогатяване). Множество имуноанализи ProcartaPlex за откриване на ниво на секреция на хемокини и цитокини на ракови клетъчни линии: Панел за човешки имуноанализ ProcartaPlex (Cat: EPX340-12167-901) и панел за имуноанализ на мишка ProcartaPlex (Cat: EPX{{50}}) са закупени от ThermoFisher Scientific (Масачузетс, САЩ) за откриване на нива на протеинова експресия на повече от 30 важни хемокини и цитокини в стабилни трансфекция на ракови клетки. Накратко, супернатантите на клетъчната култура бяха събрани от 24-ямкова плака и центрофугирани за отстраняване на клетките и клетъчните остатъци. След това избистрящите супернатанти се инкубират с перли в панела, следвайки инструкциите на производителя. Платформата за откриване Luminex (ThermoFisher Scientific, САЩ) беше използвана за извършване на количествен анализ на всяка проба. Неоткритите индикатори бяха изключени от анализа. qRT-PCR: Общата РНК се изолира от клетки с комплект за изолиране на обща клетъчна РНК и комплект за изолиране на обща РНК на животни (Foregene, Китай) съгласно протокола на производителя. cDNA се синтезира с помощта на UeIris II RTPCR система за синтез на First-Strand cDNA (US Everbright, Китай). qRTPCR беше извършен с помощта на SYBR Green qPCR Master Mix (US Everbright, Китай) на CFX Connect System (Bio-Rad, САЩ). GAPDH се използва като вътрешен стандартен контрол. Праймерите са проектирани и синтезирани от Sangon Biotech (Шанхай, Китай) и подробните последователности на праймерите са изброени в Таблица S4 (Подкрепяща информация). ELISA: Концентрациите на CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 (MIG) и CXCL10 (IP10) в супернатанти от клетъчна култура на рак на пикочния мехур при хора се определят чрез човешки ELISA комплекти, следвайки протокола на производителя (Proteintech, САЩ). Беше използван биотехнологичен четец на микроплаки (ThermoFisher Scientific, САЩ) за измерване на стойностите на оптичната плътност (OD). С оглед на огромното разнообразие от нива на секреция сред различните цитокини и хемокини, ние проведохме стандартизация на данните (log 2 трансформация) преди анализа. Western Blot: RIPA буфер (NCM biotech, Китай), добавен с 1% коктейл от протеазен инхибитор (NCM biotech, Китай), се използва за лизиране на клетките. BCA Protein Assay Kit (NCM biotech, Китай) беше използван за определяне на протеиновите концентрации. След като се прехвърлят върху PVDF мембрани, клетъчните протеини се инкубират последователно с първични антитела и специфични HRP-конюгирани вторични антитела. Сигналите бяха уловени от системата за изображения XRS (Bio-Rad, САЩ). Първичните антитела включват анти-BCAT2 антитяло (Cat: ab95976, Abcam, САЩ) и анти-GAPDH антитяло (Cat: ab8245, Abcam, САЩ). Вторичните антитела включват HRP кози анти-заешки IgG (Кат.: 7074, Cell Signaling Technology, САЩ) и HRP кози анти-миши IgG (Кат.: 7076, Cell Signaling Technology, САЩ). Тест за унищожаване на ракови клетки, медииран от Т-лимфоцити, и анализ на съкултури: Кръвни проби бяха събрани от 10 здрави донора в нашата болница. Съгласно инструкциите на производителя, беше използвано градиентно центрофугиране за извличане на мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMCs) от Lymphoprep (Кат.: 07851, StemCell Technologies, САЩ). В допълнение, буферът за лизис на червени кръвни клетки (Solarbio, Китай) беше използван за елиминиране на червените кръвни клетки, смесени с PBMC. За да се активират Т клетките, PBMCs се култивират в среда DMEM (Gibco, САЩ), допълваща рекомбинантен човешки IL- 2 (10 ng mL−1, Cat: 202-1L-050, R&D , САЩ) и ImmunoCult човешки CD3/CD28/CD2 Т клетъчен активатор (25 μL mL-1, Cat: 10970; STEMCELL Technologies, САЩ) за 1 седмица. В съотношение 1:5 човешките ракови клетки на пикочния мехур (BCAT2-OE, BCAT2-KD и техните отрицателни контроли) се култивират съвместно с активирани Т клетки в DMEM среда с анти-CD3 антитяло (100 ng mL−1, Thermo Scientific, САЩ) и IL-2 (10 ng mL−1) от един донор в 12- ямкова плака за 72 часа. След това се събират Т клетки за анализ на поточна цитометрия. Подробната стратегия за анализ на потока е показана на Фигура S28 (Подкрепяща информация). Останалите ракови клетки се оцветяват с кристално виолетово и се измерва OD стойност при 570 nm от четец на микроплаки. Антителата за анализ на поточна цитометрия включват Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Cat: 423101, Biolegend, САЩ), APC/Cy7 анти-човешки CD45 (Cat: 368516, Biolegend, САЩ), Pacific Blue анти-човешки CD3 антитяла (Cat: 300329, Biolegend, САЩ), PerCP/Cy5.5 анти-човешко CD4 антитяло (Cat: 317427, Biolegend, САЩ), FITC анти-човешко CD8a антитяло (Cat: 301006, Biolegend, САЩ), PE/Dazzle 594 анти-човешки TNF- 𝛼 Антитяло (Cat: 502946, Biolegend, САЩ) и Brilliant Violet 711 античовешко IFN- 𝛾 антитяло (Cat: 502540, Biolegend, САЩ). Анализ на хемотаксис: Анализът на хемотаксис беше приложен в 24-ямкова трансуелна плака с диаметър на ядрото 3 μm (Corning, САЩ). Човешки комплект за изолиране на CD8+T клетки (Кат.: 480012, Biolegend, САЩ) беше използван за извличане на CD8+T клетки от PBMC. 1 × 105 изолирани клетки в 200 μL обем бяха добавени в горната камера и 600 μL супернатанти от различни стабилни трансфекционни клетъчни линии бяха добавени в долната камера. След инкубиране в продължение на 6 часа при 37 градуса, клетките мигрираха в долната камера и бяха събрани и преброени чрез поточна цитометрия. Анализи на клетъчна пролиферация, миграция и инвазия: Използван е тест за образуване на колония в плоча за оценка на способността за клетъчна пролиферация. BCAT2-OE, BCAT2-KD и отрицателни контролни човешки ракови клетки на пикочния мехур бяха култивирани в 6-ямкови плаки на ямка. След инкубиране при 37 градуса влажна атмосфера в продължение на 2 седмици, колониите бяха фиксирани и боядисани съответно с параформалдехид и кристално виолетово. Transwell камери с вложки от поликарбонатна мембрана с 8, 0 μm пори (Corning, САЩ) бяха използвани за оценка на капацитета на клетъчна миграция и инвазия in vitro. 1 × 105 стабилни трансфектирани клетки се суспендират в среда без серум и се посяват в горната камера с или без Matrigel (Corning, САЩ), за анализ на инвазия и миграция поотделно. След инкубиране в продължение на 24 часа (тест за миграция) и 48 часа (тест за инвазия), клетките, прилепнали към долната повърхност на мембраната, се фиксират и оцветяват. Клетките, останали в горната камера, се отстраняват с тампони. Пет произволни полета бяха избрани под микроскоп за изчисляване на броя на клетките. Имунофлуоресценция (IF) и имунохистохимия (IHC): Многоцветна IF върху TMAs на Xiangya BLCA кохорта и Xiangya BLCA имунотерапевтична кохорта беше приложена чрез комплект за множествено флуоресцентно имунохистохимично оцветяване (Absin, Китай). Накратко, след обезпаразитяване, рехидратиране и обновяване на антиген, ТМА се инкубира с първични антитела и вторични антитела, което подтиква свързването на различни луциферини чрез усилване на тирамиден сигнал (TSA). След изтриване на несвързани антитела с цитратен буфер, процесът на инкубиране се повтаря два пъти. DAPI беше използван за противооцветяване на клетъчните ядра и изображенията бяха сканирани от платформата Pannoramic MIDI (3DHISTECH, Унгария). Първичните антитела върху TMA на Xiangya BLCA кохорта включват анти-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, САЩ), анти-цитокератин 19 (CK19) (Cat: ab52625, Abcam, САЩ), анти-CD8 (Cat: ab237709, Abcam, САЩ ) и DAPI (Invitrogen, САЩ). Вторичните антитела и флуорохром върху TMA на групата Xiangya BLCA включват HRP кози анти-заешки/миши IgG, Absin 520 TSA Plus, Absin 570 TSA Plus, Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). Първичните антитела върху TMA на Xiangya BLCA имунотерапевтична кохорта включват анти-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, САЩ), анти-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, САЩ) и DAPI (Invitrogen, САЩ). Вторичните антитела и флуорохром върху TMA на имунотерапевтичната група Xiangya BLCA включват HRP кози анти-заешки/миши IgG, Absin 520 TSA Plus и Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). IF върху миши туморни тъкани се инкубира с първично антитяло — анти-CD8 (Cat: 372902, BioLegend, САЩ) — и вторично антитяло — анти-миши конюгат с боя Alexa Fluor 488 (Invitrogen, САЩ) последователно. DAPI се прилага към визуализираното клетъчно ядро. Пет произволни полета бяха избрани под микроскоп, за да се изчисли броят на положително оцветените клетки. IHC върху TMAs на Xiangya BLCA кохорта и Xiangya BLCA имунотерапевтична кохорта беше проведена от SP-9000 Kit (ZSGB-BIO, Китай). След извличане и блокиране на антиген, първичните антитела и вторичните антитела се инкубират последователно с туморни тъкани. След това се прилага диаминобензидин (DAB) за оцветяване на прицелните антигени. Кафявият сигнал се счита за положително оцветяване. Резултат от интензитета на оцветяване (липса=0, слаб=1, умерен=2 и силен=3) умножаващ резултат на положителен процент (без оцветяване=0, оцветяване на клетките по-малко от 25%=1, 25%–50% оцветяващи клетки=2, 50%–75% оцветяващи клетки=3 и оцветяващи клетки повече от 75%=4) беше окончателен IHC резултат на пробите. Резултатите на BCAT2/CD8/PD-L1 по-малко от шест точки бяха класифицирани като ниска експресия, резултатите от тях, по-големи или равни на шест точки, бяха класифицирани като висока експресия. За преценка на статуса на индивида по MMR, всички проби от имунотерапевтичната кохорта Xiangya BLCA бяха оценени въз основа на резултатите от оцветяването на четири MMR маркерни гена (MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2). Както е показано в предишни проучвания, [56] когато и четирите маркерни гена са били положително оцветени, индивидът е маркиран като MMR. Когато някой от четирите маркерни гена има отрицателно оцветяване, индивидът се маркира като dMMR. Двама независими патолози бяха поканени да извършат оценката. Антителата включват: анти-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, САЩ), anti-CD8 (Cat: ab4055, Abcam, САЩ), anti-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, САЩ), anti-MLH1 (Cat: A4858, Abcolonal, Китай), анти-MSH2 (Cat: A22177, Abcolonal, Китай), анти-MSH6 (Cat: A16381, Abcolonal, Китай), анти-PMS2 (Cat: A4577, Abcolonal, Китай) и HRP Goat Anti -Заешки/миши IgG (ZSGB-BIO, Китай). Панорамни анализи на TissueFAXS на пространственото взаимодействие в TME: За оценка на пространственото взаимодействие на злокачествени клетки BCAT2+ и ефекторни Т клетки, панорамната платформа TissueFAXS (Tissue Gnostics, Австрия) беше използвана за сканиране и полуавтоматично анализиране на обективни клетки, оцветени с многоцветен IF на TMA на Xiangya BLCA кохорта. ТМА се състои от 1,5 mm биопсии на сърцевина от вградени в парафин проби от туморни тъкани. По-подробно, BCAT2+ клетки, злокачествени клетки и CD8+T клетки бяха оцветени от специфични първични антитела и вторични антитела. DAPI (Invitrogen, САЩ) се използва за оцветяване на клетъчното ядро. Подробни стъпки са описани в изследването на Makarević et al.[57] Накратко, според интензитетите на флуоресценция на различни индикатори и физични свойства на клетките, положителните клетки бяха маркирани и количествено определени. По-важното е, че пространствените разпределения на CD8+T клетки около BCAT2+CK19+ клетки са изобразени чрез диаграми на разсейване на базата на пространствено разстояние (0–25, 25–50, 50– 100 и 100–150 μm). Двама опитни патолози бяха поканени да проверят резултата от решението на панорамната платформа TissueFAXS. Експерименти с животни: Женски C57BL/6 мишки (6-7 седмици) са получени от отдела за лабораторни животни, Central South University. Всички операции върху мишки бяха проверени и одобрени от Комитета за грижа и използване на животните на болница Xiangya, Central South University (номер на артикул: 2021101175). Преди всичко, за да се изследва ролята на BCAT2 върху туморния растеж in vivo, BCAT2 KD MB49 клетки (5 × 105) и неговите контролни клетки в 100 μL среден обем бяха инжектирани подкожно в десния хълбок на мишки. Освен това, след успешно конструиране на модел на подкожен тумор (обем на тумора до 100 mm3), 100 ug InVivomAb анти-миши PD-1 (Cat: BE0146, Bioxcell, САЩ) и IgG2a изотип контрол (Cat: BE0089, Bioxcell, САЩ) се инжектират интраперитонеално на мишка за оценка на синергичния ефект от загубата на BCAT2 и анти-PD-1 терапията. Анти-PD-1 терапия се прилага върху мишки на всеки 3 дни и продължава до пет курса. Освен това, за преценка дали кооперативният ефект от съвместното лечение е зависим от CD8+T клетки. Придружаваща комбинирана терапия, 100 ug InVivoPlus анти-миши CD8𝛼 (Cat: BP0117, Bioxcell, САЩ) и IgG2b изотип контрол (Cat: BP0090, Bioxcell, САЩ) бяха използвани за изчерпване на CD8+T клетки в мишки. Телесното тегло на мишките се записва на всеки три дни. На планираната дата туморите бяха събрани, измерени и подготвени за анализ с поточна цитометрия, IF оцветяване и qRT-PCR. За изследване на взаимодействието между нивото на експресия на BCAT2 върху CD8+T клетки и активността на CD8+T клетки, далаците на женски C57BL/6 мишки (6-7 седмици) без туморни клетки бяха изследвани дисоциирани и подготвени за едноклетъчна суспензия за по-нататъшен анализ. Анализ с поточна цитометрия: Миши тумори бяха смлени и смлени в едноклетъчна суспензия от колагеназа IV (Cat: C5138, Sigma, САЩ), хиалуронидаза (Cat: H3506, Sigma, САЩ) и DNase I (Cat: DN25, Sigma, САЩ ). 70 μm клетъчни цедки (BIOFIL, Китай) бяха използвани за филтриране на примесите и клетъчен брояч (Countstar, Китай) беше използван за получаване на (3–5) × 106 клетки във всяка проба. След идентифициране на живи клетки с помощта на Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Cat: 423101, Biolegend, САЩ) и блокиране на Fc рецептор с анти-мише CD16/32 антитяло (Cat: 156603, Biolegend, САЩ), антигените на клетъчната мембрана се оцветяват с APC-Cy7 анти-миши CD45 (Cat: 103116, Biolegend, САЩ), BV421 анти-миши CD3 (Cat: 100341, Biolegend, САЩ), BV605 анти-миши CD8a (Cat: 100744, Biolegend, САЩ) и PerCPCy5.5 анти-миши CD4 (кат.: 100540, Biolegend, САЩ). След това наборът от буфери за оцветяване Foxp3/транскрипционен фактор на bioscience (Cat: 2400632, Invitrogen, САЩ) беше използван за фиксиране и пермеабилизиране на клетъчната и ядрената мембрана. Свързаните с цитотоксичен ефект антигени бяха оцветени с PE анти-човешки/миши Granzyme B (Cat: 372208, Biolegend, САЩ), PE-Cy7 анти-миши TNF-𝛼 (Cat: 506324, Biolegend, САЩ), PE-Dazzle 594 анти- миши IFN-𝛾 (кат.: 505846, Biolegend, САЩ), APC анти-миши перфорин (кат.: 154304, Biolegend, САЩ). Стратегията за стробиране на анализа с поточна цитометрия е показана на Фигура S29 (Подкрепяща информация). Анти-човешки/миши BCAT2 (Cat: A7426, Abclonal, Китай) се инкубира с гъвкав комплект за маркиране на антитела 488 (Cat: KFA001, Proteintech, САЩ) за синтезиране на персонализирано BCAT2 флуоресцентно антитяло за анализ на поточна цитометрия. След това BCAT2 антитяло и свързани с Т-клетките антитела бяха смесени и добавени в едноклетъчна суспензия от миши далак за изследване на взаимодействието между нивото на експресия на BCAT2 върху CD8+T клетка и активността на CD{{357} }T клетка. Стратегията за стробиране на анализа с поточна цитометрия е показана на Фигура S30 (Подкрепяща информация). Оцветените проби бяха открити с Cytek DxpAthena Flow cytometry (Cytek Biosciences, САЩ) и данните бяха анализирани от софтуера Flowjo версия (BD Biosciences, САЩ). Статистически анализ: Данните бяха представени като средно ± SD. t-тест с или без корекция на Welch беше използван за сравняване на непрекъснати променливи между две групи. Еднопосочен ANOVA анализ със или без тестове на Brown-Forsythe и Welch беше използван за сравняване на непрекъснати променливи между множество групи. Тестът на хи-квадрат или точният тест на Фишер беше приложен за сравняване на дихотомични променливи. Тестът на коефициентите на корелация на Pearson или Spearman беше използван за оценка на интензивността на корелация между различни променливи. Кривата на оцеляване на Каплан-Майер беше използвана, за да покаже прогностични анализи на дихотомични променливи, а тестът за логаритмичен ранг беше използван за преценка на статистическите разлики. Двустранно p <0.05 се определя като праг на значимост. R софтуер (версия 4.0) и GraphPad Prism8 бяха приложени за обработка на данни в проучването.
справка
[1] RL Siegel, KD Miller, HE Fuchs, A. Jemal, CA: Cancer J. Clin. 2021, 71, 7.
[2] VG Patel, WK Oh, MD Galsky, Ca-Cancer J. Clin. 2020, 70, 404.
[3] R. Nadal, J. Bellmunt, Лечение на рака. Rev. 2019, 76, 10.
[4] a) MD Galsky, A. Arija JÁ, A. Bamias, ID Davis, M. De Santis, E. Kikuchi, X. Garcia-Del-Muro, U. De Giorgi, M. Mencinger, K. Izumi, S. Panni, M. Gumus, M. Özgüro˘glu, AR Kalebasty, SH Park, B. Alekseev, FA Schutz, JR Li, D. Ye, NJ Vogelzang, S. Bernhard, D. Tayama, S. Mariathasan, A Mecke, A. Thåström, E. Grande, Lancet 2020, 395, 1547; б) MD Galsky, A. Mortazavi, MI Milowsky, S. George, S. Gupta, MT Fleming, LH Dang, DM Geynisman, R. Walling, RS Alter, M. Kassar, J. Wang, S. Gupta, N. Дейвис, Дж. Пикус, Г. Филипс, Д. И. Куин, Г. К. Хейнс 3-ти, Н. М. Хан, К. Джао, М. Ю, С. К. Пал, Дж. Клин. Oncol. 2020, 38, 1797; в) T. Powles, SH Park, E. Voog, C. Caserta, BP Valderrama, H. Gurney, H. Kalofonos, S. Radulovi´c, W. Demey, A. Ullén, Y. Loriot, SS Sridhar, N Tsuchiya, E. Kopyltsov, CN Sternberg, J. Bellmunt, JB Aragon-Ching, DP Petrylak, R. Laliberte, J. Wang, B. Huang, C. Davis, C. Fowst, N. Costa, JA Blake-Haskins , А. ди Пиетро, П. Гривас, Н. англ. J. Med. 2020, 383, 1218.
[5] a) RW Дженкинс, DA Barbie, KT Flaherty, Br. J. Cancer 2018, 118, 9; b) AJ Schoenfeld, MD Hellmann, Cancer Cell 2020, 37, 443.
[6] a) DS Chen, I. Mellman, Nature 2017, 541, 321; b) TF Gajewski, L. Corrales, J. Williams, B. Horton, A. Sivan, S. Spranger, Adv. Exp. Med. Biol. 2017, 1036, 19; c) DC Hinshaw, LA Shevde, Cancer Res. 2019, 79, 4557.
[7] a) SM Vareki, J. Immunother. Рак 2018, 6, 157; б) B. Zhang, Q. Wu, B. Li, D. Wang, L. Wang, YL Zhou, Mol. Рак 2020, 19, 53.
[8] JR Mayers, ME Torrence, LV Danai, T. Papagiannakopoulos, SM Davidson, MR Bauer, AN Lau, BW Ji, PD Dixit, AM Hosios, A. Muir, CR Chin, E. Freinkman, T. Jacks, BM Wolpin, D. Vitkup, MG Vander Heiden, Science 2016, 353, 1161.
[9] JT Li, M. Yin, D. Wang, J. Wang, MZ Lei, Y. Zhang, Y. Liu, L. Zhang, SW Zou, LP Hu, ZG Zhang, YP Wang, WY Wen, HJ Lu , ZJ Chen, D. Su, QY Lei, Nat. Cell Biol. 2020, 22, 167.
[10] JH Lee, YR Cho, JH Kim, J. Kim, HY Nam, SW Kim, J. Son, Exp. Mol. Med. 2019, 51, 146.
[11] а) Х. Лай, X. Ченг, К. Лиу, В. Луо, М. Лиу, М. Джан, Дж. Мяо, З. Джи, Г. Н. Лин, У. Сонг, Л. Джан, Дж. Bo, G. Yang, J. Wang, WQ Gao, Int. J. Cancer 2021, 149, 2099; б) D. Lambrechts, E. Wauters, B. Boeckx, S. Aibar, D. Nittner, O. Burton, A. Bassez, H. Decaluwé, A. Pircher, K. Van den Eynde, B. Weynand, E. Verbeken, P. De Leyn, A. Liston, J. Vansteenkiste, P. Carmeliet, S. Aerts, B. Thienpont, Nat. Med. 2018, 24, 1277.
[12] N. Nagarsheth, MS Wicha, W. Zou, Nat. Rev. Immunol. 2017, 17, 559.
[13] a) E. Stelloo, AML Jansen, EM Osse, RA Nout, CL Creutzberg, D. Ruano, DN Church, H. Morreau, V. Smit, T. van Wezel, T. Bosse, Ann. Oncol. 2017, 28, 96; b) AS Tjalsma, A. Wagner, WNM Din jens, PC Ewing-Graham, LSM Alcalá, MER de Groot, KE Hamoen, AC van Hof, W. Hofhuis, LN Hofman, KJ Hoogduin, J. Kaijser, ACF Makkus, SJJ Mol, GM Plaisier, K. Schelfhout, HPM Smedts, RA Smit, PJ Timmers, P. Vencken, B. Vischers, AAM van der Wurff, HC van Doorn, Gynecol. Oncol. 2021, 160, 771.
