БЦЖ-индуциран обучен имунитет подобрява ацелуларните реакции на ваксинация срещу коклюш в проучвателно рандомизирано клинично изпитване

ВЪВЕДЕНИЕ

Коклюшът е силно трансмисивно остро респираторно заболяване, причинено от бактерията Bordetella pertussis, и отново се появи като сериозен проблем за общественото здраве въпреки високото покритие на ваксините1. Години наред заболяването се контролираше в индустриализираните страни чрез ваксиниране с целноклетъчни ваксини срещу коклюш (wPs), които бяха въведени през 40-те-1950} години на миналия век. Тези ваксини бяха много ефективни и предизвикаха дългосрочна защита.

Въпреки това, високата реактогенност и опасения за безопасността доведоха до тяхната замяна през 1990-те и 2000-те години с ацелуларни ваксини срещу коклюш (aPs). AP бустер ваксини, включително комбинирани ваксини, които съдържат тетаничен и дифтериен токсоид (Tdap) със или без инактивиран полиовирус (IPV) (Tdap-IPV), бяха въведени скоро след това. AP ваксините сега се използват широко за повишаване на имунитета при деца в предучилищна възраст, юноши и възрастни. Въпреки тези мерки и техния подобрен профил на безопасност, множество проучвания показват, че индуцираният имунитет остава неоптимален2 и намалява с времето3. Освен това, продължителността на защитата след повтарящи се дози aP прогресивно се скъсява4–6. Нарастващата нужда от нови и подобрени стратегии за ваксиниране доведе до изследване на нови адюванти, които са насочени към вродения имунитет и повишават специфичния имунитет към aPs7–9.

Комбинираните ваксини могат да повишат имунитета. Комбинираните ваксини са комбинация от няколко различни ваксини за предотвратяване на заболявания, които осигуряват множество защити на пациентите едновременно, намалявайки стреса и болката от получаването на многократни инжекции. В същото време комбинираната ваксина може също така да подобри имунитета на ваксинираните, тъй като може да стимулира повече имунни отговори и да произведе повече антитела и имунни клетки, като ефективно подобрява способността за предотвратяване на много различни заболявания. Подобряването на имунитета е много важно в нашето ежедневие. Cistanche може да повиши имунитета. Полизахаридите в месото могат да регулират имунния отговор на човешката имунна система, да подобрят стресовата способност на имунните клетки и да засилят ефекта на стерилизация на имунните клетки.

Кликнете, за да научите какво е cistanche

Ваксината Bacille Calmette-Guérin (BCG) предпазва от микобактериални инфекции като туберкулоза10, както и защита срещу вторични инфекции с несвързани патогени при миши модели1. При хора тези неспецифични благоприятни ефекти са свързани с намалена детска смъртност11,12 и са валидирани в рандомизирани клинични проучвания10,13. BCG индуцира дългосрочни промени във вродените имунни клетки, които повишават тяхната чувствителност към стимулация с несвързани патогени. Този процес, наречен обучен имунитет, включва епигенетично препрограмиране на моноцити и продължава до една година след BCG ваксинация14. Клиничното значение на обучения имунитет е демонстрирано при хора чрез проучвания, които използват BCG като прототип за индукция на обучен имунитет и ваксинация или експериментална човешка инфекция като вторично имунно смущение15-17. Има натрупващи се доказателства, че BCG ваксинацията модулира адаптивните имунни отговори към ваксините. Сред осем проучвания, които бяха оценени в скорошен преглед, пет показаха засилени специфични за ваксината хуморални отговори18.

Усилията за очертаване на взаимодействащите ефекти на BCG и ваксините срещу коклюш предполагат, че BCG-индуцираният обучен имунитет може да има положителен ефект върху имунния отговор към коклюш. При мишки предшестваща ваксинация с BCG засилва Th1 и хуморалния имунен отговор след aP, но не и wP ваксинация19. При хора едно проучване в популационен мащаб показа, че едновременното прилагане на BCG с ваксинация срещу коклюш намалява смъртността при кърмачета20 в сравнение с последователното прилагане на ваксините. Доколкото ни е известно, нито едно проучване досега не е изследвало в рандомизирано контролирано проучване дали обученият имунитет модулира имунните отговори към ваксини срещу коклюш или е сравнявало времето на прилагане на BCG ваксинация спрямо втора ваксинация или предизвикателство.

Тук тествахме дали BCG ваксинацията влияе върху адаптивния имунен отговор към ваксинация и дали тренираният имунитет е свързан с тези отговори. Ние показваме, че BCG-индуцираният обучен имунитет повишава aP-специфично антитяло, aP-специфични Th1 клетъчни отговори и общи реакции на В клетки на паметта 2 седмици след Tdap-IPV имунизация. Тези увеличения корелират положително с увеличените биомаркери на обучен имунитет, включително IL-1 и IL-6. Нашите констатации подчертават ролята на обучения имунитет, предизвикан от BCG ваксинация, за потенциране на имунитета към ваксини срещу коклюш.

РЕЗУЛТАТИ

Уча дизайн

Seventy-five healthy female volunteers were randomized to one of three cohorts to receive BCG and Tdap-IPV vaccines in different orders21. We chose to enroll only women since gender-specific effects of pertussis vaccines have been reported 22. The median age of the volunteers was 23, with no significant difference in age between cohorts (Kruskal–Wallis test; P = 0.6), as previously reported21. Two subjects were excluded from analysis for having a high anti-pertussis toxin IgG concentration before Tdap-IPV vaccination (>100 IU/ml), което е показателно за скорошна инфекция с коклюш23,24 (фиг. 1а).

За да се идентифицират промените в отговора на ваксината срещу TdapIPV, които са свързани с обучен имунитет, кохортата "обучена с BCG" получи BCG 3 месеца преди TdapIPV. Ние също така включихме две контролни кохорти, за да отчетем времето на BCG ваксинацията. Кохортата "BCG плюс Tdap" получи и двете ваксинации в противоположните крайници по едно и също време, а групата "Tdap-IPV" получи първо Tdap-IPV и BCG 3 месеца по-късно (фиг. 1b). Кръвта беше събрана в няколко времеви точки преди и след ваксинациите. Времевите клейма се дефинират спрямо изходното ниво на ваксинацията с Tdap-IPV (-M3=3 месеца преди, -M3 плюс W2 = 3 месеца преди плюс 2 седмици, D0=изходно ниво на Tdap-IPV или едновременни ваксинации BCG и Tdap-IPV, W2=2 седмици след това, M3 плюс W2=3 месеца плюс 2 седмици след това, Y1=1 година след това). Първичните резултати са посочени като повишения на адаптивните имунни отговори 2 седмици или 1 година след ваксинацията с Tdap-IPV.

Общо ние оценихме 31 имунологични резултата в три ваксинационни кохорти. Използвахме мултиплексен имуноанализ на базата на топчета за измерване на концентрациите на антитела на IgG срещу коклюшни антигени коклюшен токсин (PT), нишковиден хемаглутинин (FHA), пертактин (PRN), както и дифтериен токсоид (DIPH) и тетаничен токсин (TET)25. Общите В-клетки и PRN-специфичните В-клетки се измерват директно в цяла кръв чрез поточна цитометрия, използвайки флуоресцентно белязан PRN (допълнителна фигура 1). Th1 и Th17 Т-клетъчните отговори срещу коклюшни антигени бяха измерени чрез стимулиране на периферни кръвни мононуклеарни клетки (PBMC) с PRN, PT или FHA в продължение на 7 дни и измерване на секретирания IFN, IL22 и IL-17 чрез ELISA26.

BCG ваксинацията засилва цитокиновия отговор на имунните клетки към несвързани стимули, феномен, който се обяснява с два различни биологични механизма. Първият процес се нарича хетероложен имунитет и зависи от неспецифичното активиране на Т клетките 27, 28. Вторият процес, наречен обучен имунитет, води до повишено производство на провъзпалителни цитокини от вродени имунни клетки14. Ние дефинирахме вторични резултати за групата, обучена с BCG, като промени в производството на цитокини на PBMCs след стимулация с убита от топлина Candida albicans (C_alb), Staphylococcus aureus (S_aur), Bordetella pertussis (Bp) , или липополизахарид (LPS). Както в предишни проучвания16,21, ние количествено определихме Th1/17 цитокините IFN, IL-22 или IL-17 след 7 дни като показание за хетероложен имунитет или цитокини, получени от моноцити IL-10 , IL-6, IL-1 или TNF след 24 часа като показание за обучен имунитет (фиг. 1b). Производството на цитокини в отговор на ултразвук Mycobacterium tuberculosis (Mtb) беше измерено за количествено определяне на антимикобактериалния имунитет.

Предшестваща BCG ваксинация засилва индуцираните от Tdap-IPV адаптивни имунни отговори

За количествено определяне на ефектите от обучения имунитет върху ваксинацията с Tdap-IPV, за всяка първична крайна точка, ние конструирахме линеен модел със смесени ефекти с време на извадката, членство в кохорта, както и взаимодействието на времето и кохортата като ковариати. Разгледахме два контраста: (i) разлики в сравнение с изходното ниво (D0) в рамките на всяка кохорта (ефекти след ваксинация, допълнителна таблица 1) и (ii) разлики между кохортите в големината на тези промени (диференциал ефекти, допълнителна таблица 2). Всички кохорти показват значително повишаване на отговорите на антителата към петте антигена след Tdap-IPV имунизация. Концентрациите на антитела остават по-високи от изходните до една година след ваксинацията (Y1), с изключение на ТЕТ, който е намалял в BCG обучени и BCG плюс Tdap кохорти (допълнителна фигура 2а).

Всички кохорти имаха значително увеличен брой циркулиращи PRN плюс В клетки 2 седмици след имунизацията, които бяха главно В клетки на паметта (MBC) (допълнителна фигура 3а). Не наблюдавахме разлики между кохортите (допълнителна таблица 2 и допълнителна фигура 3b). В сравнение с кохортата Tdap-IPV, кохортата, обучена с BCG, показва подобрени нормализирани на изходно ниво log1{{10}} кратни промени (W2/D0) за IgG отговори за PT, FHA и PRN. Подобен модел се наблюдава при сравняване на тези отговори с групата BCG плюс Tdap (фиг. 2а). Ние също така наблюдавахме повишени коклюш-специфични концентрации на IgG в BCG-обучената кохорта 2 седмици след ваксинацията (допълнителна фигура 2b), въпреки че разликата в абсолютните стойности беше по-слабо изразена от разликата в увеличенията, които са спрямо изходното ниво при D0.

Освен това, субектите в кохортата, обучена с BCG, показват значително повишени общи отговори на MBC, включително MBC с превключване на клас IgG (фиг. 2b и допълнителна фигура 4). Субекти в кохортата, обучена с BCG, също показват повишена секреция на IFN в отговор на стимулация с трите коклюшни антигена. Обратно, наблюдавани са значителни увеличения за един коклюшен антиген в Tdap-IPV кохорта (PT) и два коклюшни антигена в BCG плюс Tdap кохорта (PT и FHA, Фигура 2с и Допълнителна Фигура 5). Ние също така наблюдавахме тенденция, при която увеличенията в производството на IFNg бяха по-високи в кохортата, обучена с BCG, отколкото в другите кохорти, въпреки че това не достигна статистическа значимост (допълнителна таблица 2 и допълнителна фигура 5b). Специфичните за коклюш IL-22 и IL-17 отговори са слаби за всички кохорти (допълнителна таблица 1). Като цяло, тези констатации сочат засилени отговори на коклюш-специфични антитела, повишени общи IgG-превключени MBC отговори и по-широки коклюш-специфични IFN отговори в BCG-обучената кохорта в сравнение с другите две кохорти.

Изследвахме връзките между увеличенията в първичните резултати, които бяха подобрени в кохортата, обучена с BCG. За този проучвателен анализ, корелациите между антитела, В-клетки и цитокини бяха изчислени за всяка кохорта. BCG-обучената кохорта показва много значими и количествено по-силни положителни корелации между тези отговори, докато Tdap-IPV и BCG плюс Tdap кохортите показват по-слаби или обратни корелации, като най-силният модел съответства на промените в IFN отговорите (Фиг. 3a). Коефициентите на корелация между отговорите в обучените с BCG са значително по-високи от тези в контролните кохорти, като общо сочат към индукция на по-високо координиран адаптивен имунен отговор, специфичен за коклюш в обучената с BCG кохорта (фиг. 3b).

Производството на IL-1 и IL-6 цитокини е свързано със специфични за коклюш адаптивни имунни отговори

Кохортата, обучена с BCG, показа засилен общ IgG-превключен MBC и специфични за коклюш IFN отговори. Освен това, в сравнение с Tdap-IPV и BCG плюс Tdap кохорти, BCG-обучената кохорта също показва по-високи отговори на коклюшни антитела. Тъй като BCG ваксинацията при хора може да увеличи производството на цитокини от циркулиращите имунни клетки в отговор на хетероложна стимулация, седмици до месеци след ваксинацията27, ние оценихме дали тези BCG-индуцирани цитокинови отговори са свързани с промени в специфичните за коклюш имунни отговори след Tdap-IPV ваксинация. Две седмици и 3 месеца след BCG ваксинацията имаше значително засилен антимикобактериален отговор, характеризиращ се с повишено производство на IL-22 и IFN в сравнение с изходното ниво на BCG ваксинация (допълнителна фигура 6a, b).

Като цяло, BCG-обучената кохорта не показва повишено производство на хетероложен имунитет или обучени цитокини, свързани с имунитета, както беше наблюдавано по-рано (допълнителни фигури 6 и 8)21. Въпреки това, тъй като индукцията на производството на цитокини варира между индивидите, ние изчислихме промените между 2 седмици след BCG и 3 месеца след BCG в сравнение с изходното ниво на BCG (допълнителни фигури 7 и 9). Корелациите на Pearson бяха изчислени, за да се определи силата на връзката между тези измервания във всяка времева точка. Три месеца след BCG ваксинацията, т.е. на изходното ниво на Tdap-IPV, цитокиновите отговори на in vitro стимулация са силно корелирани. Хетероложните цитокинови отговори, свързани с имунитета, са отрицателно корелирани с обучени цитокинови отговори, свързани с имунитета, и сред тях корелациите между IL-6 и IL-1 са най-силни (фиг. 4), както беше описано по-рано16. Моделите на корелация 2 седмици след BCG ваксинацията са сходни за хетероложни цитокини, свързани с имунитета, но корелациите между обучени цитокини, свързани с имунитета, са много по-слаби, с изключение на отговорите на IL-10. Взети заедно, тези резултати сочат координирана вродена имунна активация 3 месеца, но не и 2 седмици след BCG имунизация в групата, обучена с BCG.

След това проучихме дали вариациите в цитокиновите отговори на BCG-обучената кохорта са свързани с промени в адаптивните имунни крайни точки на TdapIPV. Изследвахме промените в производството на цитокини 2 седмици и 3 месеца след BCG ваксинацията. Установихме, че увеличенията на свързаните с хетероложния имунитет цитокини са склонни да бъдат слабо и отрицателно корелирани с първичните крайни точки както на 2 седмици (допълнителна фигура 10), така и на 3 месеца след BCG ваксинация (фиг. 5а). Обратно, повишенията на цитокини, свързани с обучен имунитет, 3 месеца след BCG ваксинация, особено IL-1 /IL-6 в отговор на LPS стимулация, са значително положително корелирани с отговорите на PRN и FHA антитела, производството на IFN в отговор на PT стимулация и общи IgG-превключени MBC отговори (фиг. 5b, c).

В съответствие с това, ние не наблюдавахме промени в относителното изобилие на броя на периферните кръвни клетки (допълнителна фигура 11а), нито промените в клетъчното изобилие 3 месеца след ваксинацията с БЦЖ корелират положително с крайните точки за коклюш (допълнителна фигура 11b). Увеличаването на производството на IL-1 в отговор на LPS стимулация (IL1b. LPS) 3 месеца след BCG ваксинацията показва силна връзка с множество Tdap-IPV отговори и е избрано, за да се определи каква част от вариациите на всеки отговор могат да обяснят . Обяснената обща вариация (предсказан Rsq) за всеки резултат беше изчислена и промените в IL-1 биха могли да обяснят до 60 процента от вариацията на отговора (фиг. 5d). Като цяло тези резултати подчертават, че обучените цитокинови отговори, свързани с имунитета, 3 месеца след BCG ваксинацията са свързани с повишения в отговорите на коклюш-специфични антитела и производството на IFN, както и с общите IgG-превключени MBC отговори.

ДИСКУСИЯ

Индукцията на обучен имунитет при хора настъпва седмици до месеци след BCG ваксинация14 и може да повлияе на отговора на последваща имунизация при хора16,17. Тук показваме, че обученият имунитет, който е индуциран от BCG ваксинация 3 месеца преди, но не едновременно с бустерна доза Tdap-IPV, усилва коклюшните IgG реакции и модулира коклюш-специфичните клетъчни отговори. Няколко проучвания са изследвали взаимодействащите ефекти на BCG и други ваксини, като повечето от тези проучвания съобщават за положителен ефект на BCG върху имунните отговори срещу коклюш20,21,29,30. Въпреки това, доколкото ни е известно, нито едно проучване досега не е изследвало времето на ваксиниране с BCG върху отговора на коклюш или е изследвало кои характеристики на BCG-индуцирания отговор на обучен имунитет са свързани с повишената чувствителност към ваксината.

Субектите и в трите кохорти са показали антикоклюшни хуморални и PRN плюс В клетъчни отговори 2 седмици след ваксинацията с TdapIPV. Въпреки че отговорите на PRN антитела бяха много по-високи в кохортата, обучена с BCG, ние не наблюдавахме подобен модел в PRN-специфичните В-клетъчни отговори. Това може да се обясни с по-бързо индуциране на антитела в групата, обучена с BCG, което се натрупва с течение на времето поради дългия им полуживот.

Въпреки това, тъй като концентрациите на антитела не са измерени преди 2 седмици след ваксинацията, не е възможно да се оценят разликите в кинетиката между кохортите. Наред с увеличените отговори на PRN антитела, ние също открихме, че отговорите на FHA и PT антитела са по-високи в кохортата, обучена с BCG. За съжаление не успяхме да измерим PT- и FHA-специфични В-клетъчни отговори поради високото неспецифично свързване на FHA и PT с В-клетки. Все пак е обещаващо, че общите отговори на IgG MBC са били повишени в кохортата, обучена с BCG и че тези увеличения са били свързани с повишения в отговорите на антителата. Ние също така открихме, че отговорите на IFN в отговор на рестимулация на коклюшен антиген са повишени в кохортата, обучена с BCG. Въпреки че тези промени бяха относително малки, наблюдавахме тенденция, при която промените W2–D0 бяха по-високи, отколкото в другите кохорти. По-нататъшни проучвания с повече субекти могат да помогнат за валидирането на този модел, който е потвърден в изследване с мишки19. По подобен начин е доказано, че неонаталната BCG ваксинация потенцира Th1 отговорите към тетаничен токсоид31.

Увеличаването на коклюшните антитела, общите IgG MBC отговори и коклюшните IFNg отговори са силно свързани помежду си в групата, обучена с BCG, което предполага координирано активиране на ефекторни и паметови функции. Освен това, повишенията на коклюшните антитела, общите IgG-превключени MBC отговори и IFN в отговор на PT рестимулация в групата, обучена с BCG, са свързани с вродени отговори, по-специално IL-1 и IL-6. Тези резултати са в съответствие с предишно изследване върху хора от нашата група, където изследвахме ефекта на BCG върху ваксинацията срещу грип17. Значението на пътя на IL-1 /IL-6 като биомаркер на обучен имунитет също беше подчертано в модел на експериментална вирусна инфекция след ваксинация срещу жълта треска16. Като цяло не наблюдавахме корелации между определени микробни стимули и първичните резултати, което предполага, че цялостните промени в пътищата на отговор на цитокини, а не някое конкретно състояние на стимулация, са свързани с повишена реакция към ваксинация срещу коклюш. Докато очакваме преобладаващият IL-6 и IL-1 отговор на микробна стимулация да произлиза от моноцити и дендритни клетки16, В клетките могат също да допринесат за производството на цитокини32 и не можем да изключим потенциалния им принос.
Ключов въпрос е колко дълго индуцираният от BCG обучен имунитет продължава след ваксинацията. In vitro признаци на BCG-индуциран трениран имунитет при хора са идентифицирани още 2 седмици и до 1-година след ваксинацията14. Клиничните проучвания при хора, които са имали за цел да преведат тези констатации в реакция in vivo, са ограничили прозореца на наблюдение до 5 седмици след BCG ваксинацията15-17. Наблюдавахме по-слаба индукция на обучените цитокини, свързани с имунитета IL-6 и IL-1, отколкото в предишни проучвания16, както беше съобщено по-рано21. Вариациите от партида до партида в производството на BCG ваксината могат да повлияят на индукцията на обучен имунитет и могат да обяснят ефекта, който наблюдавахме в това проучване 33.

Освен това са наблюдавани вариации между BCG щамовете, които оказват влияние върху тяхната имуногенност и клинична ефикасност34-36. Въпреки това, ние все пак демонстрираме, че хетероложните IL-1 и IL-6 отговори 3 месеца след BCG ваксинацията, т.е. в момента на Tdap-IPV ваксинацията, но не и 2 седмици след BCG ваксинацията, са свързани с повишен коклюш хуморален и клетъчен имунитет. Тези констатации предполагат, че тренираният имунитет продължава да се развива през последните 2 седмици след BCG ваксинацията и подчертават, че изходната функционална „отзивчивост“ на циркулиращите вродени имунни клетки може да бъде критична за развитието на по-мощен отговор на ваксината.

Това проучване демонстрира, че предшестваща BCG ваксинация може да подобри реакцията към антигените на aP ваксината. Изненадващо, ние не наблюдавахме този ефект за TET и DIPH. Това може да се обясни с факта, че всички възрастни са получили предварителна бустер ваксинация с Td-IPV, но не и с aP на 9-годишна възраст, както се препоръчва в националната имунизационна програма. В съответствие с това, ние открихме, че изходните концентрации на антитела на aP антигени са силно корелирани между субектите в нашето проучване, но не са корелирани с DIPH и TET, което предполага, че хуморалният имунитет към тези компоненти не е синхронизиран с aP антигените (допълнителен Фиг. 12). Изходните нива на DIPH и TET антитела са силно взаимно корелирани, което е в съответствие с тяхното съвместно приложение във ваксини. По този начин, вариациите в съществуващия имунитет срещу различни компоненти на ваксината могат да играят роля в способността на BCG ваксинацията и обучения имунитет да повлияят на отговора към Tdap-IPV.

Although our study was not designed to investigate vaccine efficacy, a major question is whether the enhanced antibody response that we observed in the BCG-trained cohort may translate into better clinical protection. There is much debate about the correlates of protection against pertussis37. Nonetheless, PT antibodies have previously been used to correlate with clinical protection against disease (>25 IU/ml)29. Използвайки този праг, беше постигната почти пълна серопротекция 2 седмици след TdapIPV в кохортите, обучени с BCG и BCG плюс Tdap, докато част от субектите в кохортата Tdap-IPV не бяха серопротектирани (допълнителна фигура 13).

Освен антителата, Т-клетъчният имунитет и по-специално Th1 и Th17 отговорите също са подчертани като важни за защита срещу коклюш при животински модели 2,38. Ние открихме, че кохортата, обучена с BCG, показва увеличен IFN в отговор на повторно стимулиране на коклюшен антиген, което е показател за Th1 имунитет и следователно може да предполага подобрена клинична защита срещу коклюш. И накрая, настоящите имунологични крайни точки, насочени към количествено определяне на специфичния за коклюш адаптивен имунитет, като Т-клетъчен, В-клетъчен или хуморален отговор, все още не са валидирани като имунологични корелати на защита. Има няколко възможности за запълване на тази празнина в знанията, например чрез провеждане на епидемиологични проучвания или чрез използване на наскоро установения модел на контролирана човешка инфекция за B.pertussis39.

Ограничение на нашето проучвателно проучване е, че изследваната популация се състои от възрастни, които са били имунизирани в ранна детска възраст с целноклетъчна DTP ваксина, за която е известно, че влияе на адаптивния отговор към коклюш десетилетия след имунитета и влияе върху индукцията на Т-клетъчен имунитет при отговор на бустер ваксинация40. По този начин ще бъде важно да се определи дали нашите открития се отнасят за деца, родени в ерата на рутинна педиатрична ваксинация с aP. Освен това, тъй като включихме само жени, ще бъде важно да определим дали съществуват разлики с мъжете. В това проучвателно проучване ние измерихме крайните точки за имуногенност срещу коклюш, включително отговори на антитела, общи и PRN плюс В-клетъчни отговори и антиген-специфични Т-клетъчни отговори. P-стойностите не са коригирани за многократно тестване поради целевия характер на оценените имунни отговори. Важно е, че това проучване е проведено върху доброволци от западноевропейски (холандски) произход и бъдещи проучвания трябва да проучат дали подобни ефекти могат да бъдат открити в популации с различен генетичен произход. Друго ограничение е, че е измерена само подгрупа от цитокини. Въпреки че това беше подходящо за конкретните хипотези, които имахме за цел да тестваме, по-всеобхватно, безпристрастно профилиране на цитокини и други отговори може да доведе до нови прозрения.

В заключение, в настоящото проучване ние съобщаваме, че BCG ваксинацията, приложена 3 месеца преди Tdap-IPV ваксинацията, значително повишава имунитета срещу коклюш и че биомаркерите на обучен имунитет са най-надеждните корелати на тези повишени отговори на ваксинация. Ще са необходими допълнителни проучвания за валидиране, за да се оценят тези констатации в различни изследвани популации и са необходими допълнителни имунологични и генетични изследвания за механично валидиране на ролята на пътищата IL-1 и IL-6. Като цяло, очертаването на основната вродена имунна функция, която може да бъде модулирана от BCG, ще бъде от съществено значение за разбирането как да се насочат индуцираните от ваксината адаптивни имунни отговори към превъзходна имуногенност и защита срещу заболяване.

МЕТОДИ

Клинично изпитване

Това едноцентрово, рандомизирано отворено изпитване е извършено в медицинския център на университета Radboud (Ниймеген, Холандия) от 203 март 15 г. до 20юли 1621 г. Протоколът на изследването е регистриран при клинични изпитвания. gov (NCT02771782) и е одобрен от Комитета по медицинска етика на Arnhem-Nijmegen. Доброволците бяха наети с помощта на табла за обяви и в университета Radboud в Ниймеген и получиха умерено възнаграждение. Бяха включени доброволци, които не са били ваксинирани преди това с BCG или наскоро с ваксини срещу коклюш. Критериите за изключване са (i) предишна ваксинация с BCG или скорошна ваксинация с ваксини, съдържащи коклюш, (ii) алергия към неомицин, полимиксин или алергична реакция към предишна ваксинация с ваксини срещу дифтерия, тетанус, коклюш или полиомиелит, (iii) използване на системни лекарства, различни от орални контрацептиви, и (iv) бременност или анамнеза за заболявания в резултат на имунен дефицит. Размерът на кохортата беше определен въз основа на предишни проучвания, извършени от нашата група, в които изследвахме ефектите от BCG ваксинацията върху вродените имунни отговори16. Рандомизирането в групите на изследването беше извършено със софтуерен алгоритъм. Всички субекти са имали анамнеза за първично лечение с целоклетъчен коклюш през първата година от живота си. Бяха включени седемдесет и пет жени доброволки. След получаване на писмено информирано съгласие, кръвта беше събрана в епруветки с етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA) или литиев хепарин (LiHep) и бяха приложени ваксинации. Пълна кръвна картина беше получена с помощта на хематологичен анализатор Sysmex XN-450. Субектите получават BCG Danish 1331 (Staten Serum Institut, Копенхаген, Дания; 0,1 ml интрадермално) и Tdap-IPV (Boostrix Polio, GlaxoSmithKline; 0,5 ml интрамускулно). Серумите се съхраняват при -20 градуса до анализа и цяла кръв се обработва за допълнителен анализ, както е описано по-долу. Насоките на Консолидираните стандарти за докладване на изпитания (CONSORT) бяха използвани за изготвянето на този ръкопис (допълнителна фигура 14).

Серологичен анализ

Серумите бяха анализирани за концентрации на PT-, FHA-, PRN-, TET- и DIPH-специфични IgG антитела, като се използва мултиплексен имуноанализ, базиран на флуоресцентни топчета25. Антигените бяха ковалентно свързани с различни цветно кодирани активирани карбоксилирани микросфери MicroPlex (перли) (Luminex, Остин, Тексас, САЩ). Следните антигени бяха използвани за свързване: високо пречистен PT (Нидерландски институт по ваксини), FHA (Kaketsuken, Кумамото, Япония), P.69 PRN, експресиран и пречистен от E. coli конструкция41, дифтериен токсоид (Холандски институт по ваксини) и тетанус токсин (T3194, Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ). След етап на промиване в PBS, 12,5 × 106 карбоксилирани зърна/mL се активират в PBS, съдържащ 2,5 mg 1-етил3-({{20}} диметил аминопропил)-карбодиимид хидрохлорид (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Масачузетс, САЩ) и 2,5 mg N-хидроксисулфосукцинимид (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Масачузетс, САЩ). Антигените за свързване се разреждат в PBS до концентрация от 10 ug PT, FHA или PRN, 100 ug DT или 25 ug TET на 12,5 × 106 активирани гранули и се инкубират в продължение на 2 часа при стайна температура на тъмно под постоянно въртене. След три етапа на промиване, антиген-свързаните гранули се съхраняват на тъмно в PBS, съдържащ 0,03 процента (тегло/обем) натриев азид и 1 процент (тегло/обем) говежди серумен албумин при 4 градуса до употреба. Серумите, разредени 1/200 и 1/4000 в PBS, съдържащи 0,1 процента (обем/обем) Tween 20 и 3 процента (тегло/обем) BSA, се инкубират с антиген-свързани перли в 96-ямкова филтърна плака за 45 минути при стайна температура при 750 pm на тъмно. Референтни серуми в серия от разреждания, серуми за контрол на качеството и празни проби бяха включени във всяка плака.

Вътрешният референтен стандарт за коклюш беше калибриран спрямо 1-ви IS на СЗО, част 06/140 и серийно разреден 4-кратно в 6 ямки (1/200 до 1/204800). Вътрешният референтен стандарт за DIPH и TET беше калибриран спрямо WHO NIBSC DI-3 и TE-3 и серийно разреден 4-кратно в 8 ямки (1/50 до 1/819200). След инкубацията ямките се промиват 3 пъти с PBS, инкубират се с белязано с R-фикоеритрин козе анти-човешко IgG антитяло (Jackson Immunoresearch Laboratories, West-Grove, PA, USA) за 30 минути и се промиват. Перлите бяха включени в PBS и средният интензитет на флуоресценция (MFI) беше получен на Bio-Plex LX200. MFI беше преобразуван в IU/mL чрез интерполация от 5-параметрична логистична стандартна крива с помощта на софтуер Bioplex Manager 6.2 (Bio-Rad Laboratories, Херкулес, Калифорния, САЩ) и експортиран в Microsoft Excel.

PBMC Изолиране, стимулация и откриване на цитокини

PBMCs бяха изолирани чрез центрофугиране с градиент на плътност на Ficoll и ресуспендирани при 5 × 106 /ml в културална среда RPMI (среда на Roswell Park Memorial Institute; Invitrogen, Калифорния, САЩ), допълнена с гентамицин, Glutamax (GIBCO) и пируват. Общо, 100 ul бяха аликвотирани на ямка в плаки с обло дъно 96-ямки (Corning) и стимулирани с един от RPMI (отрицателна контрола), липополизахарид на Escherichia coli (LPS; 10 ng/ml, Sigma-Aldrich), обработен с ултразвук Mycobacterium tuberculosis H37Rv (5 ug/ml), убит чрез топлина Staphylococcus aureus (1 × 106 /ml, клиничен изолат), убит чрез топлина Candida albicans (1 × 106 /ml, щам UC820) и убит чрез топлина Bordetella pertussis ( 1 ug/ml, щам B1917), PT (2 ug/ml), PRN (4 ug/ml, ReagentProteins, PFE-031) и FHA (2 ug/ml). PT и FHA бяха любезно предоставени от AM Buisman от Националния институт за обществено здраве и околна среда (RIVM, Bilthoven, Холандия). Клетките се инкубират при 37 градуса и 5 процента CO2 в продължение на 24 часа за откриване на IL-1, IL-6, IL-10 и TNF или 7 дни за IFN, IL{{31} } и IL-17. Супернатантите се съхраняват при -20 градуса. Цитокините бяха измерени в супернатанти на PBMC култура с помощта на комплекти за ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) от R&D системи (IL-1, TNF, IL17, IL-22) или Sanquin (IL-6, IL -10, IFN ) съгласно инструкциите на производителя.

B-клетъчна поточна цитометрия

Оцветяването на В клетки се извършва директно върху цяла кръв с панел за оцветяване на антитела (допълнителна таблица 3), включително флуоресцентно белязан PRN за откриване на антиген-специфични В клетки. За маркиране на PRN-специфични В клетки, PRN (ReagentProteins, PFE-031) се конюгира с флуоресцеин (FITC комплект за маркиране на антитела, Pierce) съгласно протокола на производителя (PRN-FITC). Общо 1-2 ml прясно взета цяла кръв, събрана в LiHep епруветки, се разрежда в FACS буфер (PBS плюс 0.{{10}}9 процента NaN3 плюс 0,2 процента говежди серумен албумин, Calbiochem) и клетките се пелетират и след това се промиват два пъти с FACS буфер. Клетките се ресуспендират в FACS буфер и след това се оцветяват с коктейл от антитела за фенотипиране на В клетки за 15 минути, фиксират се (FACSLysing, BD Biosciences) и след друго промиване с FACS буфер се анализират в рамките на 1 час след оцветяването. Поточна цитометрия на PRN-антиген-специфични В клетки в цяла кръв беше извършена на LSRII (BD Biosciences) поточен цитометър със стандартизирани настройки на инструмента42. Данните от поточната цитометрия бяха анализирани с Infinicyte (Версия 2.0, Cytognos). На проба, 2 × 106 клетки бяха придобити в лимфоцитната врата (допълнителна фигура 1а). Лимфоцитите бяха затворени след отстраняване на дублетите и остатъците. В клетките бяха идентифицирани като CD45 плюс CD19 плюс и бяха идентифицирани PRN-FITC-специфични В клетки. Подмножествата на B клетки бяха идентифицирани с помощта на адаптирана стратегия за стробиране43. Опитахме се да открием PT-специфични В клетки чрез поточна цитометрия, но бяхме неуспешни поради високия фон, причинен от неспецифично оцветяване.

Статистика

Стойностите на цитокини и антитела бяха лог10-трансформирани, за да се отчете тяхното изкривено разпределение. Анализът на отговорите на първичния или вторичния резултат беше анализиран в регресионен модел със смесени ефекти, използвайки пакета „lme4“ 44 R. За всеки резултат формулата за модела (в R нотация) е:

Сравненията бяха изчислени с пакета „средства“ 45 R и ние изследвахме два контраста. Първо, проучихме дали първичните крайни точки са значително различни в сравнение с изходното ниво на ваксинация Tdap-IPV във всяка кохорта (ефектите след ваксинацията бяха определени като W2–D0 във всяка кохорта, допълнителна таблица 1). След това изследвахме разликите между кохортите в големината на тези промени (диференциални ефекти, Допълнителна таблица 2, дефинирани като (W2c1 – D{{10}}c1) – ​​(W2c2 – D0 c2), където c1 и c2 се отнасят за различни кохорти за дадено сравнение). Промените в хетероложните или обучени имунни цитокини в групата, обучена с BCG, бяха анализирани по подобен начин. P-стойностите се отчитат с помощта на метода на степените на свобода на Kenward-Roger. Статистическите параметри се отчитат директно във фигурите и легендите на фигурите. Поради проучвателния дизайн на изследването и оценените целеви имунни отговори, не е извършена корекция на множество тестове. Бяха извършени корелации по двойки с log10-кратни стойности на промяна спрямо базовата линия. Оценката на дисперсията, обяснена чрез измервания на цитокини върху първичните променливи на изхода, беше извършена с помощта на R пакета 'caret' 46. За да се отчете потенциалното пренастройване, беше извършено 10 пъти повторение, 4-кратно кръстосано валидиране. Ние анализирахме титри на серопротективни антитела срещу PT, TET или DIPH с точен тест на Fisher. Връзките между статуса на серопротекция и кохортата са определени чрез изследване на остатъците от тест хи-квадрат. Праговите стойности за серопротекция спрямо РТ са 25 IU/ml18 и 0,1 IU/ml за DIPH и TET37).

Резюме на отчета

Допълнителна информация относно дизайна на изследването е налична в Резюме на докладите за научни изследвания в природата, свързано с тази статия.

НАЛИЧНОСТ НА ДАННИ

Данните, които подкрепят констатациите от това проучване, са достъпни от съответния автор при разумно искане.

НАЛИЧНОСТ НА КОД

R-кодът, който подкрепя констатациите от това проучване, е достъпен от съответния автор при разумно искане.

ПРЕПРАТКИ

1. Тан, Т. и др. Коклюш по целия свят: последни епидемиологични тенденции от 2000 до 2013 г. Pediatr. заразявам. дис. J. 34, e222–e232 (2015).

2. Warfel, JM, Zimmerman, LI & Merkel, TJ Ацелуларните ваксини срещу коклюш предпазват от заболяване, но не успяват да предотвратят инфекция и предаване в модел на нечовешки примати. Proc. Natl Acad. Sci. САЩ 111, 787–792 (2014).

3. Huang, LM et al. Отговори на първична и бустерна доза от ацелуларни, компонентни и целоклетъчни ваксини срещу коклюш, започнати на 2-месечна възраст. Vaccine 14, 916–922 (1996).

4. Klein, NP, Bartlett, J., Rowhani-Rahbar, A., Fireman, B. & Baxter, R. Отслабваща защита след пета доза ацелуларна ваксина срещу коклюш при деца. Нов англ. J. Med. 367, 1012–1019 (2012).

5. Misegades, LK et al. Асоциация на коклюш в детска възраст с получаване на 5 дози ваксина срещу коклюш по време след последната доза ваксина, Калифорния, 2010 г. JAMA 308, 2126–2132 (2012).

6. Hendrikx, LH, Berbers, GA, Veenhoven, RH, Sanders, EA & Buisman, AM IgG отговори след бустер ваксинация с различни ваксини срещу коклюш при холандски деца на 4 години: ефект от съдържанието на антиген във ваксината. Vaccine 27, 6530–6536 (2009).

7. Misiak, A. et al. Добавянето на TLR7 агонист към ацелуларна коклюшна ваксина усилва Th1 и Th17 отговорите и защитния имунитет в миши модел. Vaccine 35, 5256–5263 (2017).

8. Dunne, A. et al. Нов агонист на TLR2 от Bordetella pertussis е мощен адювант, който насърчава защитния имунитет с ацелуларна ваксина срещу коклюш. Мукозен имунол. 8, 607–617 (2015).

9. Sugai, T. et al. CpG-съдържащ олигодезоксинуклеотид като ефективен адювант, противодействащ на Th1/Th2 имунния отговор във ваксината срещу дифтерия-тетанус-коклюш. Vaccine 23, 5450–5456 (2005).

10. Colditz, GA et al. Ефикасността на BCG ваксината в профилактиката на туберкулозата. Мета-анализ на публикуваната литература. JAMA 271, 698–702 (1994).

11. Kristensen, I., Aaby, P. & Jensen, H. Рутинни ваксинации и оцеляване на децата: последващо проучване в Гвинея-Бисау, Западна Африка. BMJ 321, 1435–1438 (2000).

12. Hirve, S. et al. Неспецифични и полови диференциални ефекти на ваксинациите върху оцеляването на децата в селските райони на Западна Индия. Vaccine 30, 7300–7308 (2012).

13. Aaby, P. et al. Рандомизирано проучване на BCG ваксинация при раждане на деца с ниско тегло при раждане: благоприятни неспецифични ефекти в неонаталния период? J. Инфектирайте. дис. 204, 245–252 (2011).

14. Netea, MG et al. Обучен имунитет: програма за вродена имунна памет при здраве и болест. Наука 352, aaf1098 (2016).

15. Walk, J. et al. Резултати от контролирана инфекция с малария при хора след BCG ваксинация. Нац. Общ. 10, 874 (2019).

16. Arts, RJW et al. BCG ваксинацията предпазва от експериментална вирусна инфекция при хора чрез индуциране на цитокини, свързани със зърнест имунитет. Клетъчен гостоприемник микроб 23, 89–100 e105 (2018).

17. Leentjens, J. et al. BCG ваксинацията повишава имуногенността на последващата ваксинация срещу грип при здрави доброволци: рандомизирано, плацебо-контролирано пилотно проучване. J. Инфектирайте. дис. 212, 1930–1938 (2015).

18. Zimmermann, P. & Curtis, N. Влиянието на BCG върху отговорите на ваксината - систематичен преглед. Expert Rev. Vaccines 17, 547–554 (2018).

19. Broset, E. et al. BCG ваксинацията подобрява DTaP имунните отговори при мишки и е свързана с по-ниска честота на коклюш в екологични епидемиологични проучвания. EBioMedicine 65, 103254 (2021).

20. Aaby, P., Andersen, A., Ravn, H. & Zaman, K. Едновременното прилагане на BCG и ваксинации срещу дифтерия-тетанус-коклюш (DTP) може да намали детската смъртност повече от схемата на СЗО за BCG първо и след това DTP. Повторен анализ на данните от демографското наблюдение от селските райони на Бангладеш. EBioMedicine 22, 173–180 (2017).

21. Blok, BA et al. Взаимодействащи, неспецифични, имунологични ефекти на bacillus calmette-guerin и тетанус-дифтерия-коклюш инактивирани полиомиелитни ваксини: проучвателно, рандомизирано проучване. Clin. заразявам. дис. 70, 455–463 (2020).

22. Aaby, P., Ravn, H., Fisker, AB, Rodrigues, A. & Benn, CS Свързана ли е дифтерия-тетанус-коклюш (DTP) с повишена смъртност при жените? Мета-анализ, тестващ хипотезите за полово-диференциални неспецифични ефекти на DTP ваксината. прев. R. Soc. Троп. Med. Hyg. 110, 570–581 (2016).

23. van der Lee, S. et al. Повишен процент на придобиване на Bordetella pertussis при юноши по време на епидемията от 2012 г. в Холандия и доказателства за продължителна персистиране на антитела след инфекция. Евро наблюдение. https://doi.org/10.2807/1560-7917. ES.2017.22.47.17-00011 (2017).

24. Berbers, G. et al. Циркулация на коклюш и лоша защита срещу дифтерия сред възрастни на средна възраст в 18 европейски страни. Нац. Общ. 12, 2871 (2021). 25. van Gageldonk, PG, van Schaijk, FG, van der Klis, FR & Berbers, GA Разработване и валидиране на мултиплексен имуноанализ за едновременно определяне на серумни антитела срещу Bordetella pertussis, дифтерия и тетанус. J. Immunol. Методи 335, 79–89 (2008).

26. Schure, RM et al. Т-клетъчни отговори преди и след петата поредна ацелуларна ваксинация срещу коклюш при 4--годишни холандски деца. Clin. Ваксина Имунол. 19, 1879–1886 (2012).

27. Mathurin, KS, Martens, GW, Kornfeld, H. & Welsh, RM CD4 Т-клетъчно медииран хетероложен имунитет между микобактерии и поксвируси. J. Virol. 83, 3528–3539 (2009).

28. Lertmemongkolchai, G., Cai, G., Hunter, CA & Bancroft, GJ Bystander активирането на CD8 плюс Т клетки допринася за бързото производство на IFN-гама в отговор на бактериални патогени. J. Immunol. 166, 1097–1105 (2001).

29. Zimmermann, P. et al. Влиянието на неонаталната имунизация Bacille Calmette-Guerin (BCG) върху отговорите на хетероложната ваксина при кърмачета. Vaccine 37, 3735–3744 (2019).

30. Ritz, N., Mui, M., Balloch, A. & Curtis, N. Неспецифичен ефект на ваксината Bacille CalmetteGuerin върху имунния отговор към рутинни имунизации. Vaccine 31, 3098–3103 (2013).

31. Libraty, DH et al. Неонаталната БЦЖ ваксинация е свързана с усилен Т-хелпер 1 имунен отговор към хетероложни ваксини за кърмачета. Изпитвания Vaccinol. 3, 1–5 (2014). 32. du Plessis, WJ et al. Функционалният отговор на В клетките към антигенна стимулация: предварителен доклад за латентна туберкулоза. PLoS ONE 11, e0152710 (2016).

33. Biering-Sorensen, S. et al. Вариации в растежа на производството на BCG ваксината и връзката с имунния отговор. Наблюдателно проучване в рамките на рандомизирано проучване. Ваксина 33, 2056–2065 (2015).

34. Ru, H. et al. Влиянието на геномния регион на разликата 4 (RD4) върху вирулентността на микобактериите и ефикасността на BCG. Отпред. клетка. заразявам. Microbiol. 7, 239 (2017). 35. Cho, T. et al. Преглед на BCG ваксината и други подходи към ликвидиране на туберкулозата. тананикам Ваксина. Имунодруго. 17, 2454–2470 (2021).

36. Brosch, R. et al. Геномна пластичност на BCG и влияние върху ефикасността на ваксината. Proc. Natl Acad. Sci. САЩ 104, 5596–5601 (2007).

37. Plotkin, SA Корелати на защитата, предизвикана от ваксинация. Clin. Ваксина. Immunol. 17, 1055–1065 (2010).

38. Ross, PJ et al. Относителният принос на Th1 и Th17 клетките в адаптивния имунитет към Bordetella pertussis: към рационалния дизайн на подобрена ацелуларна ваксина срещу коклюш. PLoS Pathog. 9, e1003264 (2013).

39. de Graaf, H. et al. Изследване на колонизацията и имунитета на Bordetella pertussis: протокол за стационарно контролиран модел на човешка инфекция. BMJ Open 7, e018594 (2017).

40. da Silva Antunes, R. et al. Th1/Th17 поляризацията продължава след ваксинация срещу коклюш с цели клетки, въпреки многократните ацелуларни бустери. J. Clin. разследване. 128, 3853–3865 (2018).

41. Hijnen, M., van Gageldonk, PG, Berbers, GA, van Woerkom, T. & Mooi, FR Факторът на вирулентност на Bordetella pertussis P.69 пертактин запазва своите имунологични свойства след свръхпроизводство в Escherichia coli. Protein Expr. Пуриф. 41, 106–112 (2005).

42. Калина, Т. и др. EuroFlow стандартизация на настройките на инструмента за флоуцитометър и протоколи за имунофенотипизиране. Левкемия 26, 1986–2010 (2012).

43. Blanco, E. et al. Свързано с възрастта разпределение на нормални подгрупи В-клетки и плазмени клетки в периферната кръв. J. Allergy Clin. Immunol. 141, 2208–2219. e2216 (2018).

44. Bates, D., Machler, M., Bolker, BM & Walker, SC Монтиране на линейни модели със смесени ефекти с помощта на lme4. J. Stat. Софтуер 67, 1–48 (2015).

45. Lenth, R. Emmeans: оценени пределни средни, известни още като средни на най-малките квадрати (2018).

46. ​​Кун, М. Изграждане на прогнозни модели в R с помощта на пакета caret. J. Stat. Софтуер 28, 1–26 (2008).

БЛАГОДАРНОСТИ

Бихме искали да благодарим на Anne-Marie Buisman (RIVM) за доставката на PT и FHA антигените, които бяха използвани за експерименти за повторно стимулиране на PBMC. Благодарим на всички доброволци, които участваха в опита. Тази работа беше подкрепена от Националния институт по обществено здраве и околна среда (RIVM), Холандия (SPR проект S112200). MGN беше подкрепен от ERC Advanced Grant (#833247) и грант от Спиноза от Холандската организация за научни изследвания.

АВТОРСКИ ПРИНОС

Концептуализация: BAB, MGN, RvC и DAD; методология: ES, MJE, GAMB, PGMvG, BAB и LCJdB; разследване: ES, MJE, GAMB, PGMvG, BAB, LCJdB и JG; формален анализ: JG; писане - оригинална чернова: JG и DAD; писане рецензия и редактиране: всички.

КОНКУРЕНТНИ ИНТЕРЕСИ

MGN има патент в нанобиологията за инхибиране на обучен имунитет, лицензиран за TTxD, и патент в нанобиологията за стимулиране на обучен имунитет, лицензиран за TTxD. Всички други автори не съобщават за потенциални конфликти. Всички автори са подали формуляра на ICMJE за разкриване на потенциални конфликти на интереси.

ДОПЪЛНИТЕЛНА ИНФОРМАЦИЯ

Допълнителна информация Онлайн версията съдържа допълнителен материал, достъпен на https://doi.org/10.1038/s41541-022-00438-4.

Кореспонденцията и исканията за материали трябва да се адресират до Dimitri A. Diavatopoulos.

Препечатките и информацията за разрешенията са достъпни на http://www.nature.com/reprints

Бележка на издателя Springer Nature остава неутрална относно претенциите за юрисдикция в публикуваните карти и институционалните връзки.

Свободен достъп

Тази статия е лицензирана съгласно Creative Commons Attribution 4.0 Международен лиценз, който позволява използване, споделяне, адаптиране, разпространение и възпроизвеждане във всякакъв носител или формат, стига да посочите подходящото признание на оригиналния автор(и) ) и източника, осигурете връзка към лиценза Creative Commons и посочете дали са направени промени. Изображенията или други материали на трети страни в тази статия са включени в лиценза Creative Commons на статията, освен ако не е посочено друго в кредитната линия към материала. Ако материалът не е включен в лиценза Creative Commons на статията и предвидената от вас употреба не е разрешена от законови разпоредби или надвишава разрешената употреба, ще трябва да получите разрешение директно от притежателя на авторските права.

For more information:1950477648nn@gmail.com