Бензилирани дихидрофлавони и алкалоиди, получени от изохинолин, от кората на Diclinanona Calycina (Annonaceae) и тяхната цитотоксичност

За повече информация, свържете се сtina.xiang@wecistanche.com

Резюме: Diclinanona calycina RE Пържени картофи, популярни като "enviro", са видове от семейство Annonaceae, ендемични за Бразилия. В нашето продължаващо търсене на биоактивни съединения от растенията Annonaceae Amazon, кората на D.calycina беше изследвана чрез класически хроматографски техники, които дадоха тринадесет съединения (алкалоиди и флавоноиди), описани за първи път в D. calycina, както и в рода Diclinanona. Структурата на тези изолирани съединения е установена чрез обстоен анализ с помощта на 1D/2D-NMR спектроскопия в комбинация с MS. Изолираните алкалоиди бяха идентифицирани като принадлежащи към подкласовете: прост изохинолин, thali онлайн (1); апорфин, анонаин (2); оксоапорфин, лириоденин (3); бензилтетрахидроизохинолини, (S)-(плюс)-ретикулин(4); дехидро-оксоноретикулин (3,4-дихидро-7-хидрокси-6-метокси-1-изохинолинил)(3-хидрокси-4-метоксифенил)-метанон)(5 );( плюс )-1S,2R-ретикулин Ng-оксид (6); и ( плюс )-1S,2S-ретикулин N-оксид (7); тетрахидро протоберберин, корексимин (8); и павин, биснорагмонин (9). Докатофлавоноидипринадлежат към бензилиранитедихидрофлавони, изорамнетин (10), дихаманетин (11) и смес от уваринол (12) и изоуваринол (13). Съединение 5 е описано за първи път в литературата като естествен продукт. Цитотоксичната активност на основните изолирани съединения беше оценена срещу ракови и неракови клетъчни линии. Сред тестваните съединения, най-обещаващите резултати са открити за бензилираните дихидрофлавони дихаманетин (10) и сместа от уваринол (12) и изуваринол (13), които показват умерена цитотоксична активност срещу тестванитеракова клеткалинии(<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I). Дихаманетин (11) показва цитотоксична активност срещу HL-60 и HCT116 с IC50 стойности от 15,78 ug·mL-I (33,70 umol·LI) и 18,99 ug∶mL-（40,56 umol. L-）, съответно, докато сместа от уваринол（12） и изоуваринол (13) демонстрира цитотоксична активност срещу HL-60, с IC5 стойност от 9,74 ugs.mL-1, и HCT116, с IC50 стойност 17,31 ug. mL-I. Тези цитотоксични активности могат да бъдат приписани на присъствието на една или повече хидроксибензилови групи, присъстващи в тези молекули, както и на позицията, в която тези групи са свързани. Цитотоксичните активности на ретикулин, анонаин и лириоденин са установени по-рано, като лириоденинът е най-мощното съединение.

Ключови думи: Diclinanona calycina; алкалоиди и бензилирани дихидрофлавони; цитотоксична активност

Кликнете, за да научите повече за продуктите

1. Въведение

Annonaceae е голямо семейство от тропически и субтропични дървета и храсти, включващо около 112 рода и 2440 вида [1]. Няколко вида са известни със своите ядливи плодове и лечебни свойства ]2]. Предишното фитохимично изследване с някои видове Annonaceae доведе до изолирането и характеризирането на различни класове вторични метаболити, като монотерпени, дитерпени, тритерпени, лигнани,флавоноиди, фенилпропаноиди, получени от азарон, ацетогенини и главно типични алкалоиди, получени от изохинолин [3-7]. Някои от тези вторични метаболити, изолирани от видове Annonaceae, показват важна биологична активност, като противовъзпалителни и инхибиращи уреазата свойства [8,9], трипаноцидни [10,11], лайшманицидни [11,12], антималарийни [4,13] , антимикробно [4,14,15], антиоксидантно и антиревматично действие [9,15] и по-специално цитотоксична активност срещу различни човешки туморни клетъчни линии [4,6,11,16-21].

Въпреки че семейство Annonaceae се счита за примитивно и добре проучено семейство, с неговите видове са проведени малко фитохимични и/или фармакологични изследвания[3]. Фитохимичните и/или фармакологичните изследвания са фокусирани главно върху видовете от родовете Annona, Asimina и Cananga, поради голямото им икономическо значение, както и върху някои видове от родовете Duguetia, Guatteria и Xylopia[5]. Въпреки големия ръст през последните 20 години във връзка с фитохимичните и фармакологичните изследвания, броят на изследваните видове все още е много малък в сравнение с голям брой признати видове. Понастоящем, според научните бази данни Web of Science, Scopus и SciFinder, само около 15 процента от описаните видове Annonaceae имат съответното фитохимично и/или фармакологично изследване.

Сред малко проучените видове са тези, принадлежащи към род Diclinanona Diels. Този род принадлежи към племето Annoneae от подсемейство Annonoideae и се среща само в тропическа Южна Америка (главно в района на Амазонка). Това е род, състоящ се само от три вида, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas и Diclinanona tessmannii Diels, които се срещат като дървета [22-24].D.calycina (синоним Xulopia calycina Diels) е от 8 до 30 m високо дърво, популярно известно като "envireira" и "enviro", разпространено в басейна на Амазонка в Бразилия, Перу и Венецуела [23]. D.calycina е повърхностно подобен на Xylopia за цветята си с удължени и тесни венчелистчета, но е различен за своите дървесни, неразкриващи се, кълбовидни и дебелостенни монокарпи [23,24].

Предишни проучвания с D. calycina съобщават само за фармакологични изследвания. Първото изследване описва изследване на антимикробната активност на метанолни, хлороформени и водни екстракти срещу микроорганизмите Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus и Candida albicans с помощта на метода на гел-дифузия [25]. Вторият докладва изследването на антимикробната активност на органични (дихлорометан: метанол 1:1) и водни екстракти срещу микроорганизма Enterococcus faecalis с помощта на микродилюционен бульон (MDBA) и дисков дифузионен анализ (DDA)[26]. По този начин, в нашето непрекъснато търсене на нови биоактивни природни продукти от Annonaceae от тропическите гори на Амазонка, това проучване имаше за цел да изследва фитохимичните и фармакологичните свойства на кората на D.calycina. В този доклад тринадесет съединения (девет алкалоида и четири бензилиранидихидрофлавони) са изолирани и идентифицирани за първи път в D.calycina, както и в рода Diclinanona. В допълнение, цитотоксичността на основните съединения е изследвана срещу B16-F10, HepG2, K562 и HL{{ 4}} туморни клетъчни линии с помощта на анализа Alamar blue.

2. Резултати и дискусия

2.1. Структурно изясняване на съединенията

След като се установи наличието на азотсъдържащи съединения в метаноловия екстракт с помощта на реактив на Драгендорф, той беше подложен на киселинно-алкална обработка съгласно методологията на Costa et al. [12] което води до алкалоидни и неутрални фракции. Висока концентрация на азотсъдържащи съединения се наблюдава в алкалоидната фракция, която беше подложена на хроматографски анализ. Последователните хроматографски разделяния, както е описано в раздела Екстракция и изолиране, доведоха до изолирането и идентифицирането на тринадесет химични съставки (1-13, Фигура 1), девет алкалоида, получени от изохинолин 1-9, и четири бензилирани дихидрофлавони 10-13. Структурите на тези изолирани съединения (Фигура 1) са установени чрез обширен анализ, използвайки 1D и 2D NMR спектроскопия в комбинация с MS (допълнителни данни), както и сравнение с данни от литературата.

Съединение 5 беше получено като кафяв аморфен прах и даде положителен тест за реагента на Драгендорф. Той показа протонирана молекула при m/z328 [M плюс H]' в LR-ESI(плюс)MS-съвместима с молекулната формула C18H1NO5. 'H и 13C-NMR спектрите на 5 (Таблица 1) са в съответствие с тези на ретикулин (4) [27, с изключение на отсъствието на свързаната с азот метилова група (CH3-N) и сигнала на метиновата група в позиция 1, която беше заменена със сигнал при δc 165.1 в типичния 13C-NMR спектър на иминовата група, конюгирана с карбонилна група при bc 192.8. В 'H-NMR спектъра, три водорода в ниско поле при δH 6.88（1H,d, J=8.4 Hz, H-5'）,5H7.57（1H,d, J{{33} }.0Hz, H-2'）и δH 7,60（1H, dd, J=8.4 и 2,0 Hz, H-6'） , разкри наличието на система за свързване ABX. Два синглетни сигнала при 6H 6.90(1H,s, H-8) и 6.71(1H,s, H-5) показват наличието на 1,2,4,5-тетразаместен фенилов пръстен. В допълнение, H-NMR спектърът на 5 също показва сигнали за две метокси групи, резониращи при bH 3,93 (3H, s) и 6H 3,95 （3H, s）, и сигнали за две метиленови групи, резониращи при δμ 2,79（2H,t, J=7.8 Hz） и 6H 3.89(2H,t,/=7.8 Hz), приписвани съответно на H-4 и H-3 (Таблица 1) . Тези данни показват, че алкалоид 5 има бензилтетрахидроизохинолинов скелет [28-30].

Тези групи бяха установени въз основа на картата на корелация с две и три връзки 'H-13C от HMBC-NMR експеримента (Фигура 2 и Таблица 1). Този анализ разкри, че водородът при δH 3.89 （H-3）показва трилентова 'H-13C корелация с въглеродите при 6c130.1（4a） и δc165.{ {42}}（C-1）и корелация с две връзки lH-13C с въглерода при δc 25.4(C-4), потвърждаваща наличието на иминна група в молекулата. От друга страна, сигналите при δH 7.57 （H-2'） и δH 7.60（H-6'）показват корелация с три връзки lH-13C с въглеродите при δc 124.3（ C-6'）,5c 151,4（C-4'）и δc192.8（C-7）,и 5c116.0（C-2'）,6c 151.4 (C-4') и c 192.8(C-7'), съответно, установявайки карбонилната група в молекулата (Фигура 2 и Таблица 1). Следователно, въз основа на тези NMR данни, съединение 5

е установен като бензилтетрахидроизохинолин алкалоид 34-дихидро-7-хидрокси-6-метокси-1-изохинолинил)(3-хидрокси-4-метоксифенил)-метанон, който е наречен дехидро-оксоноретикулин. Този алкалоид е описан за първи път в литературата като естествен продукт. Първият и единствен запис е описан от Dörnyei et al. през 1982 г. 【31】 като продукт от синтетичен произход. Само данните от 'H-NMR са описани с някои неопределени множествености. По този начин пълните разпределения за всички 1H- и 13C-NMR химични отмествания бяха установени чрез корелационни експерименти с една връзка (HSOC) и две и три връзки (HMBC)' H-13C-NMR и бяха описани в Маса 1.

Съединения 6 и 7 бяха идентифицирани съответно като бензилтетрахидроизохинолиновите алкалоиди (плюс)-1S,2R-ретикулин-N-оксид и (плюс)-1S,2S-ретикулин-N-оксид. H-NMR данните за тези алкалоиди бяха сравнени с данните, описани от Lee et al. [28] при използване на същия деутериран разтворител (CD3OD) и са наблюдавани някои несъответствия (Таблица 1), главно по отношение на H-1, H-8 и H, C-NO. Няма 13C-NMR данни, описани за тези алкалоиди в литературата. Въз основа на ограничените 1H- и 13C-NMR данни, както и неяснотите, наблюдавани за тези молекули, бяха проведени 1D и 2D NMR експерименти с 'H и 13C, за да се определят техните правилни назначения и множествености.

Правилната позиция на водорода H{{0}} и H-1 на двата изомера 6 и 7 беше установена въз основа на корелационната карта на трите връзки 'H-13C от HMBC - ЯМР експеримент （Фигура 2）. За изомер 6 анализът разкри, че водородът при δH 5.78（H-8）показва корелация с три връзки 'H-13C с въглеродите при 6c 79.8（C-1）,δc120 .6（4a） и δc 149.4 （C-6）, докато водородът при δH 4,13 （H-1）показва корелация с три връзки 'H-13C с въглеродите при c 60.7（C-3）,6c 115.7 （C-8）,δc 120.6（C-4a） и 131.2 （C-1'）, като по този начин се установява правилни позиции на водородните атоми H-8 и H-1 за изомер 6. Това приписване може да бъде допълнително потвърдено от анализа на водорода при δH 6.76（H-5）, който показва три връзки H-13C корелация с въглеродите при δc 27,0（C-4）, δc 127,1（C-8a） и δc 145,7 （C-7） (Фигура 2）). За изомер7 анализът разкри, че водородът при δH 6.30 （H-8）показва корелация с три връзки 'H-13C с въглеродите при δc 79.4（C-1）,δc 122.8（ 4a） и δc 148.9 （C-6）, докато водородът при δH 4.46 （H-1）показва корелации с три връзки H-13C с въглеродите при δc 62.9 （C{ {82}}）,5c 115.5（C-8）, bc 122.8（C-4a） и 131.4（C-1'）, като по този начин се установяват правилните позиции на водородните атоми H -8 и H-1 за изомер 7. Това приписване беше потвърдено и от анализа на водорода при δH 6,71 （H-5）, който показа три връзки lH-13C корелации с въглеродите при δc26.3（C-4）, δc 126.9（C-8a） и 6c 146.1（C-7）(Фигура 2). Експериментът NOESY също беше проведен, за да се установи правилната стереохимия на изомерите6 и 7. В този експеримент силната корелация на NOE на H-1（δH 4.13）и H, CN(5 3.15) показа, че -ориентация на кислорода в изомер 6. От друга страна, не може да се намери очевидна NOE корелация между H-1(6H 4.46) и HAC-N(5H 3.20) в експеримента 2D-NOESY за 7, показваща -ориентацията на кислорода в изомер 7 (Фигура 2). Тези малки разлики в химичните отмествания на тези изомери се наблюдават ясно поради стереохимията на азота, засегнат от и позициите на кислорода. Сравненията на 'H- и 13C-NMR данните, получени за съединения 6 и 7 с данни за молекули с близки структури като хексапеталин А и хексапеталин В [30] подкрепят данните, описани в Таблица 1 без неяснота.

Съединенията 1-4 и 8-13 бяха идентифицирани като талифолин (1) [32], анонаин (2) [33]лириоденин (3)[10,34], (S)-( плюс )-ретикулин ( 4)[27], корексимин (8) [34,35], биснорагмонин (9)[36], изохаманетин (10) [37], дихаманетин (11) [37] и смес от уваринол (12) и изоуваринол (13) [37] въз основа на техните спектроскопски профили и сравнение със стойности в литературата. lH- и 13C 1D и 2D-NMR спектрите, както и масспектрите на всички изолирани съединения, са налични като допълнителни материали.

От хемофенетична (нов термин за растителна хемосистематика/хемотаксономия на растенията) гледна точка е важно да се отбележи, че наличието на С-бензилирани флаванони и С-бензилирани дихидрохалкони са специален тип флавоноиди, получени от добре известния флаванон пиноцембрин и са описани по-специално във видовете от рода Uoaria, принадлежащи към семейство Annonaceae [3, 38-42]. Наличието на тези съединения в D. calycina предполага тясна хемофенетична връзка с Uoaria. От друга страна, трябва да се извършат допълнителни изследвания с други части на растението, както и други видове Diclinanona, за да се потвърди тази хемофенетична връзка. Флаваноните и халконите са широко разпространени във висшите растения, но добавянето на бензилови групи е доста рядко и изглежда е ограничено в Annonaceae до род Uoaria [3,39-42] и сега до род Diclinanona. Бензиловите групи вероятно възникват от C6-C1 пътя, но о-хидрокси функционалността е необичайна. Отсъствието на заместители в B-пръстена във всички тези флавоноиди на Uoaria и Diclinanona може да бъде свързано с предишното наблюдение относно флавоноидите на Popowia cauliflora [38].

Алкалоидите, получени от изохинолин, изолирани и описани в тази работа, вече са регистрирани в няколко вида Annonaceae в различни родове. Някои от тях, като лириоденин и анонаин, се считат за хемофенетични маркери и присъствието на тези алкалоиди в D.calycina допълнително засилва връзката на тези хемофенетични маркери в семейство Annonaceae [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Струва си да се спомене, че според Zidorn [44] хемофенетичните изследвания се дефинират като изследвания, целящи да опишат набора от специализирани вторични метаболити в даден таксон, както вече се наблюдава в няколко публикувани работи [5-7,15,20 ,27,33-35,43-46]. По този начин хемофенетичните изследвания допринасят за фенетичното описание на таксоните, подобно на анатомичните, морфологичните и кариологичните подходи, които вече са признати за много важни за установяването на "естествени" системи и които продължават да бъдат от изключително значение за описание на класифицирани организми с помощта на съвременни молекулярни методи [44].

2.2. Цитотоксичен анализ

In vitro цитотоксичната активност на изолираните съединения (Таблица 2), с изключение на съединения 2, 3, 5 и 8 (поради техния нисък добив), беше оценена спряморакова клеткалинии HL-60 (човешка промиелоцитна левкемия), MCF-7(човешки аденокарцином на гърдата), HepG2 (човешки хепатоцелуларен карцином), HCT116 (човешки карцином на дебелото черво) и неракова клетъчна линия MRC{{5} }(човешки белодробен фибробласт) с помощта на Alamar blue анализ след 72 часа инкубация.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 ug.mL-1). Дихаманетин (11) показа цитотоксична активност срещу HL-60 и HCT116 със стойности на IC50 от 15,78 ug·mL-1（33,70 μmol·L-1） и 18,99 ug·mL-1（40,56 umol.L-1）, съответно. Сместа от уваринол (12) и изоуваринол (13) демонстрира цитотоксична активност срещу HL-60, със стойност на ICs0 от 9,74ug∶mL-1, и HCT116, със стойност на ICs0 от 17,31 ug∶mL{ {30}}. Сред бензилираните дихидрофлавони, само изорамнетин (10) показва цитотоксична активност срещу HepG2 с IC50 стойност от 19,79 ugs:mL-1(54,65 umol.L-1). Според литературата бензилираните дихидрофлавони са описани с цитотоксични свойства [39-42]. Сред описаните в тази работа изорамнетин (10), дихаманетин (11) и уваринол (12) са описани в цитотоксични свойства vitro срещу човешки туморни клетъчни линии на карцином на назофаринкса (KB) и P-388 лимфоцитна левкемия (PS) със стойности на IC50 съответно 5,3 и 4,1, 4,8 и 1,8 и 5,9 и 9,7 ug.mL-1 [39,40]. Тези различни дейности могат да бъдат приписани на присъствието на една или повече хидроксибензилови групи, присъстващи в молекулите, както и на позицията, в която тези групи са свързани. Необходимо е обаче допълнително проучване, за да се потвърди това наблюдение.

In vitro цитотоксичната активност на производните на изохинолин алкалоиди анонаин (2), лири-аденин (3) и (S)-(плюс)-ретикулин (4) е описана наскоро от Menezes et al.[2{{16] }}], Souza et al. [6] и Costa et al. [43] с акцент върху лириоденин, който демонстрира мощна цитотоксична активност срещу ракови клетъчни линии B{{10}}F10(миши меланом), HepG2 (човешки хепатоцелуларен карцином), HL{{13 }} (човешка промиелоцитна левкемия) и K562 (човешка хронична миелоцитна левкемия） със стойности на IC5s0 под 10,0 μmol.L-1【43】. Анонаинът показа умерена активност срещу B16-F10, HepG2, HL60 , и K562 с IC50 стойности по-ниски от 19,0 umol.L-1[20]. (S)-( плюс )-Ретикулин показа умерена активност само срещу HepG2 с IC50 стойности от 15,35 μmol L-1【 6,20】.

3. Материали и методи

3.1. Общи експериментални процедури

Оптичните ротации в метанол (MeOH) се записват с поляриметър P{{0}} (Jasco, Токио, Япония) при 589 nm. 1D и 2D NMR експерименти са получени в CDCI. (хлороформ-d) или CDCl плюс капка от CD, OD (метанол-du и CD, COCD3(ацетон-d6) при 298 K на AVANCE I HD NMR спектрометър (Bruker, Billerica, MA, USA), работещ при 11,75 T (Hand 13C при 500 и 125 MHz, съответно) и на Bruker AVANCE I 600 NMR спектрометър, работещ при 14,1 T('H и 13Cat 60{) {63}} и съответно 150 MHz). Всички lH- и 13C-NMR химични отмествания （δ）са представени в ppm спрямо сигнала на тетраметилсилан при 0.00 ppm като вътрешна референция и константите на свързване (D) са дадени в Hz. NMR спектрометърът е оборудван с 5- mm многоядрена сонда за обратна детекция (1D и 2D NMR експерименти) с z-градиент. Една връзка (HSQC) и две и корелационните експерименти с три връзки (HMBC)1H-13C-NMR бяха оптимизирани за средна константа на свързване JcH и LRJ(cH съответно от 140 и 8 Hz. За анализ с масова спектрометрия с ниска разделителна способност (LC-MS) проби от изолираните съединения бяха ресуспендирани в метанол (HPLC клас), създавайки запас k разтвори (1 mg·mL-1). Аликвоти (5 uL) от изходните разтвори бяха допълнително разредени до 5 ug·mL-и анализирани чрез директна инфузия в троен квадруполен масспектрометър, модел TSO Quantum Access (Thermo Scientific, Сан Хосе, Калифорния, САЩ), оборудван с електроспрей йонизация (ESI) или източници на химическа йонизация при атмосферно налягане (APCI). ESI-MS условия: напрежение на разпръскване, 5 kV; обвивен газ, 10 произволни единици (arb); спомагателен газ, 5arb;почистващ газ,0arb;капилярна температура, 250 градуса; капилярно напрежение, 40 V; тръбна леща, 70 V; обхват на масата, m/z 100 до 1000. Условия на APCI-MS: разряден ток, 5 μA; температура на изпарителя, 350 градуса; налягане на газа в обвивката, 25 произволна единица （arb）; налягане на йонния газ, 0.0 arb; налягане на спомагателния газ, 10 arb; капилярна температура 250 градуса С; офсет на тръбната леща,70 V; офсет на скимера,0 V; масов диапазон, m/z 100 до 1000. Като сблъсък газ беше използван аргон и MS/MS спектрите бяха получени при използване на енергии на сблъсък в диапазона от 25 до 30 eV. Силикагел 60 (Sigma-Aldrich, San Luis, Мисури, САЩ, 70-230 меша) се използва за колонна хроматография (CC), докато силикагел 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Германия, 0,25 mm, алуминий) се използва за аналитична и препаративна обработка с тънка хроматография (PTLC) (Macherey-Nagel, 1.00 mm, стъкло). Съединенията се визуализират чрез излагане на UV254/365 светлина, чрез пръскане с р-анисалдехиден реагент, последвано от нагряване върху гореща плоча и чрез пръскане с реактив на Драгендорф.

3.2. Растителен материал

В настоящото изследване ботаническият материал (кора) на D.calycina е събран на 27 май 2017 г. в резервата Adolpho Ducke (географски координати: 02 градуса 53'36.1S и 59 градуса 58'28.9"W), Манаус, щат Amazonas , Бразилия и идентифициран от проф. д-р Антонио Карлос Уебър, таксономист на растенията от Департамента по биология на Universidade Federal do Amazonas (DB/UFAM).Екземпляр номер 10 810 е депозиран в Хербариума на DB/UFAM. достъп (образец) е регистриран в Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) със запис A70EDCD.

3.3. Извличане и изолиране

Кората на D.calycina първоначално се суши при стайна температура в продължение на 24 часа и след това се суши в пещ с циркулация на въздуха в продължение на 48 часа при температура от 40 градуса и впоследствие се пулверизира в мелница с четири ножа (Marconi, Piracicaba, SP , Бразилия), за да се получи прахообразният материал (1340 g). След това беше извършена изчерпателна мацерация с хексан (8 × 4 L), последвана от МеОН (8 × 4 L). Получените екстрактни разтвори се концентрират в ротационен изпарител при понижено налягане (40-50 степен), за да се получат хексановите (24.85 g) и МеОН (199.43 g) екстракти, съответно.

TLC анализът, разкрит с реагента на Dragendorff, показва високо присъствие на алкалоиди в MeOH екстракта. Следователно, аликвотна част от МеОН екстракт (188.30 g) първоначално се подлага на киселинно-алкална екстракция, за да се получат алкалоидни (5.46 g) и неутрални (4.47 g) фракции. Впоследствие част от алкалоидната фракция (5.0g) се подлага на хроматографска колона със силикагел (CC), предварително обработена с 10 процента разтвор на NaHCO3 [12], елуиран с хексан (100 процента), хексан-CHCl, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 и 10:90, v/o), CH2Cl2 (100 процента), CH2Cl 2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 и 10:90,0/u), EtOAc (100 процента), EtOAc-MeOH (95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80 и 10:90, v/o), и накрая MeOH, даващи 250 фракции (30 mL всяка). След TLC оценка с използване на смес от CH2Cl2-MeOH в пропорции 95:05, 90:10, 85:15 и 80:20 като елуираща система (v/o), подобните проби бяха обединени, за да се получат 16 фракции (F1 до F16).

Фракция F5 (181,2 mg) от първоначалната CC, елуирана с хексан-CH,Cl2 (50:50 до 10:90, v/o) беше подложена на нов силикагел CC, като се използва същата методология по-горе, елуирана с хексан (100 процента), хексан -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 и 10:90,v/o), CH,Cl ,(100 процента), CHCl2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 и 10:90 ,o/), EtOAc (100 процента), EtOAc-MeOH (85:15, 70:30, 50:50, 30:70 и 15:85, /o), и МеОН (100 процента), което дава 118 фракции ( 15 mL всяка), които бяха обединени в 12 субфракции (F5.1 до F5.12), според оценката на TLC анализ, използвайки смес от CH2Cl2-MeOH в пропорции 95:05 и 90:10. Субфракция F5 .1 (28,9 mg), елуиран с хексан (100 процента), се подлага на препаративна тънкослойна хроматография, елуиран с CH,Cl-MeOH (95:05, v/v, две елуирания), което дава 2 (1,4 mg) и 3 (1,7 mg), съответно. Подфракции F5.4 (21.5 mg) елуирани с хексан-CH,C(80:20,vo), F5.5 (16.7 mg) елуирани с хексан-CH,Cl(80:20.70:30.60;40. и 50:50 ,v/) и F5.6(15.4 mg) елуиран с хексан-CHCl2 (50:50, 40:60 и 30:70, v/o) се събират (53.6 mg) и също се подлагат на препаративна TLC елуирана с СН,С1-МеОН (95:05, v/u, две елуирания) за добив на 3 (8.9 mg).

Фракция F6(2099,1 mg) от първоначалната СС, елуирана с хексан-CHCl(10:90,v/)), CH2Cl, (100 %), и CH,Cl2-EtOAc (90:10 до 10:90, o/o) се подлага на нов силикагел CC, използвайки същата методология по-горе, елуиран със същите системи от разтворители, даващи 140 фракции (30 mL всеки). След TLC оценка с използване на смес от CH2Cl2-MeOH в съотношения 95:05, 90:10 и 85:15 като елуентна система (o/o), подобните проби бяха събрани, за да се получат 13 субфракции (F6 .1 до F6.13). Субфракция F6.6 (1541.3 mg) беше подложена на нов силикагел CC, използвайки същата методология по-горе, елуиран със същите системи от разтворители, давайки 120 фракции (30 mL всяка), които бяха анализирани чрез TLC (използвайки същата методология по-горе), осигурявайки 12 нови подфракции (F6.6.1 до F6.6.12). Субфракция F6.6.2 (17.0 mg), елуирана с хексан-CH,Cl (60:40 и 50:50, v/v) се подлага на препаративна TLC, елуирана с CH2Cl2-MeOH (90:10, v/o, едно елуиране), което води до 3 (1,4 mg). Субфракция F6.6.3 (643,3 mg) елуирана с хексан-CH2Cl2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90, o/v), CH2Cl2 (100 процента) и CH2Cl2-EtOAc (90:10 и 80:20,o/o) беше подложен на препаративна TLC, елуиран с CH2Cl2-MeOH (90 :10, vfo, едно елуиране), което дава нова субфракция F6.6.3.1 (161.8 mg), която се подлага на нова препаративна TLC, елуирана с EtOAc-MeOH (90:10, v/o, едно елуиране), което дава 4(148.2 mg). Субфракция F6.6.4 (90.2 mg), елуирана с CH2Cl2-EtOAc (70:30 и 60:40,o/o) се подлага на препаративна TLC, елюирана с CH2CI-MeOH (90:10, v/o, едно елуиране), което дава съответно 1 (1.4 mg) и 4 (50.1 mg). Субфракция F6.6.5 (83.4 mg), елуирана с CH,Cl-EtOAc (60:40 и 50:50, o/o), също беше подложена на препаративна TLC, елуирана с CH,Cl2-MeOH (90:10, ufo, едно елуиране), което дава отново 1 (1.5 mg) и 4 (45.5 mg), съответно. Субфракция F6.6.6 (101.4 mg), елуирана с CH,Cl2-EtOAc (50:50 и 40:60, v/)) се подлага на препаративна TLC, елуирана с CH,Cl-MeOH (90: 10, vfo, едно елуиране), което дава 8 (3,4 mg) и друга субфракция F6.6.6.1 (48,8 mg). Тази субфракция (F6.6.6.1) се подлага на препаративна TLC, елуирана първоначално с EtOAc-MeOH (85 :15, vo, едно елуиране) и отзад CHCI-MeOH (90:10, v/v, едно елуиране), което отново води до 4 (37,4 mg). За тази процедура, хроматографската плака първоначално се елуира с подвижната фаза EtOAc-MeOH (85:15, v/o, едно елуиране). След това елуиране, хроматографската плака се изсушава, за да се отстрани отново разтворителят и впоследствие се подлага на ново елуиране с подвижната фаза CH,Cl,-MeOH (90:10, vf, едно елуиране), за да се получи 4. Субфракция F6.6.7 ( 109,0 mg), елуиран с CH,Cl2-EtOAc(40:60,30:70,20:80 и 10:90,vfo) се подлага на препаративна TLC, елуиран с CH,Cl2-MeOH (90:10, обем, едно елуиране), давайки друга субфракция F6.6.7.1 (24,8 mg), която беше подложена на нова препаративна тънкослойна хроматография, елуирана първоначално с EtOAc-MeOH (85:15, обем/о, едно елуиране) и след това CH2Cl2-MeOH (90:10, vfo, едно елуиране), което води до 9 (11,1 mg). Процедурата за изолиране, използвана за 9, беше същата като описаната по-рано за 4. Субфракция F6.6.10 (92.0 mg), елуирана с EtOAc-MeOH (60:40 и 50:50, v/o) беше подложена на препаративна TLC, елуирана с CH, Cl,-MeOH (90:10, v/o, едно елуиране), което дава съответно 5 (1.7 mg) и 6 (7.8 mg). Субфракция F6.6.11 (326.0 mg), елуирана с EtOAc-MeOH (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90, v/o) се подлага на препаративна TLC, елуирана с CHCI- МеОН (90:10, v/o, едно елуиране), даващо съответно 1 (2,4 mg) и 7 (12,5 mg).

Фракция F7 (692,4 mg) от първоначалния CC, елуиран с EtOAc (100 процента) и CHCl2-EtOAc (95:05, 90:10, 85:15 и 75:25, ofo) се подлага на нов силикагел C Използвайки същата методология, както е описана за първоначалната CC със същите системи от разтворители, даващи 110 фракции (30 mL всяка). След TLC оценка с използване на смес от CH2Cl2-MeOH в съотношения 95:05, 90:10 и 85 :15 като елуираща система (o/o), подобните проби бяха събрани, за да се получат 12 субфракции (F7.1 до F7.12).F7.8(147.4 mg), елуирани с CH,Cl2- EtOAc (50:50, 40:60 и 30:70, v/o процента) се подлага на препаративна TLC, елуиран с CHCI-MeOH (95:05, vfo, едно елуиране), което дава 10 (5,4 mg) и 11( 120,6 mg), съответно. F7.9(144.2 mg), елуиран с CHCl2-EtOAc (30:70, 20:80 и 10:90, v/o процента), също беше подложен на препаративна TLC, елуиран с CH,Cl,-MeOH( 95:05, обем, едно елуиране), което дава 11 (91,2 mg) и смес от 12 и 13 (39,4 mg), съответно.

Талифолин (1): кафяв аморфен прах; H-NMR и 13C-NMR в съответствие с литературата [32]; LR-ESI(плюс)-MS [М плюс Н]* плюс m/z 208.

Анонаин (2): Кафяв аморфен прах; 1H-NMR и 13C-NMR в съответствие с литературата [33]; LR-ESI(плюс)-MS [М плюс Н] плюс m/z 266.

Лириоденин (3): Жълти кристали (CH,Cl-MeOH 3:1);1H-NMR и 13C-NMR в съответствие с литературата [10,34]; LR-ESI(плюс)-MS [М плюс Н] плюс m/z 276.

(S)-(плюс)-Ретикулин(4): Кафяв аморфен прах; []p25 плюс 71,60(c 0.05 g/100 mL, МеОН); 1H-NMR и 13C-NMR в съответствие с литературата [27;LR-ESI(плюс)-MS [М плюс Н] плюс m/z 30.

3,4-дихидро-7-хидрокси-6-метокси-1-изохинолинил)(3-хидрокси-4-метоксифенил)-метанон (дехидро-оксоноретикулин)(5 ): кафяв аморфен прах; 'Н и 13C-NMR данни, виж Таблица 1; LR-ESI(плюс)-MS [М плюс Н] плюс m/z 328.

( плюс ){{0}}S,2R-ретикулин N-оксид(6): кафяв аморфен прах; [ lp25 плюс 136.4 (с0.146 g/100 mL, МеОН); 13C-NMR данни от една ръка, вижте Таблица 1; LR-APCI(плюс)-MS [M плюс H] плюс m/2346

( плюс ){{0}}S,2S-ретикулин N.-оксид (7): кафяв аморфен прах; []p25 плюс 394.5 (c 0.03g/100 mL, MeOH); 'Н и 13C-NMR данни, вижте таблица 1; LR-APCI(плюс)-MS [M плюс H] плюс m/z346.

Корексимин (8): Светложълт аморфен прах;[]p25 плюс 201.1(c 0.08g/100mL, MeOH)'H-NMR и 13C-NMR в съответствие с литературата[34,35];LR- ESI(плюс)-MS [М плюс Н] плюс m/z 328.

Bisnorargemonine (9): Кафяв аморфен прах; 1H-NMR и 13C-NMR в съответствие с литературата [36]; LR-APCI(плюс)-MS [М плюс Н] плюс m/z 328.

Изохаманетин (10): светложълт аморфен прах; [ p25-12.4(c 0.5 g/100 mL, MeOH)'H-NMR и 13C-NMR в съответствие с литературата [37; LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Дихаманетин (11): Жълт аморфен прах; []D25-10.7(c 0.5g/100 mL, MeOH);1H-NMR и 13C-NMR в съответствие с литературата [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.

Смес от уваринол (12) и изоуваринол (13): жълт аморфен прах; H-NMR и 13C-NMR в съответствие с литературата [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]- m/z 573.

3.4. In vitro цитотоксичен анализ

3.4.1.Клетки

HL-60 (човешка промиелоцитна левкемия), MCF-7 (аденокарцином на човешката гърда), HepG2 (човешки хепатоцелуларен карцином), HCT116 (човешки карцином на дебелото черво) и MRC-5 (човешки белодробен фибробласт) клетъчните линии са получени от American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) и са култивирани, както е препоръчано от ръководството на ATCC за животински клетъчни култури. Всички клетъчни линии бяха тествани за микоплазма, като се използва комплект за оцветяване на микоплазма (Sigma-Aldrich), за да се потвърди използването на клетки, свободни от замърсяване.

3.4.2. Тест за цитотоксичност

За анализ на цитотоксичност, клетъчната жизнеспособност се определя количествено чрез метода Alamar blue, както е описано по-рано [{{0}}]. За всички експерименти клетките се поставят в 96-ямкови плаки. Химическите съставки се разтварят в диметилсулфоксид (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Бразилия) и се добавят към всяка ямка и се инкубират в продължение на 72 часа. Доксорубицин (доксорубицин хидрохлорид, чистота по-голяма или равна на 95 процента, лаборатория IMA SAIC, Буенос Айрес, Аржентина) беше използван като положителна контрола. В края на лечението, 20 μL изходен разтвор (0,312 mg/mL) на резазурин (Sigma-Aldrich Co.) се добавя към всяка ямка Абсорбции при 570 nm и 600 nm се измерват с помощта на SpectraMax190 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Полуинхибиторна концентрация (IC50) се получава чрез нелинейна регресия с 95 процента доверителни интервали (CI95 процента) с помощта на софтуера GraphPad Prism (Интуитивен софтуер за наука; Сан Диего, Калифорния, САЩ).

4. Изводи

Фитохимичното изследване на кората на D.calycina доведе до изолирането и идентифицирането на тринадесет съединения (1-13); девет алкалоида, получени от изохинолин (1-9) и четирифлавоноиди(10-13). Алкалоидите принадлежат към следните подкласове: прост изохинолин, тали онлайн (1); апорфин, анонаин (2); оксоапорфин, лириоденин (3); бензил-тетрахидроизохинолини, (плюс)-ретикулин(4), дехидро-оксоноретикулин(3,4-дихидро-7-хидрокси-6-метокси-1-изохинолинил)({{13} }хидрокси-4-метоксифенил)-метанон)(5), 1S,2R-ретикулин Ng-оксид(6) и 1S,2S-ретикулин N.-оксид (7); тетрахидро протоберберин, корексимин (8); и павин, биснорагмонин (9). Докато флавоноидите принадлежат към бензилираните дихидрофлавони, изорамнетин (10), дихаманетин (11) и смес от уваринол (12) и изоуваринол (13). Изолираните съединения са описани за първи път в D.calycina, както и в род Diclinanona.

Цитотоксичната активност на изолираните съединения (с изключение на анонаин, лириоденин, 1,2-дихидро-оксоноретикулин и корексимин) е оценена срещу рак (HL-60, MCF-7, HepG2 и HCT116) и неракови (MRC-5) ​​клетъчни линии. Сред тях най-обещаващите резултати са наблюдавани за бензилираните дихидрофлавони дихаманетин (10) и

сместа от уваринол (12) и изоуваринол (13), която показа умерена цитотоксична активност срещу изследваните ракови клетъчни линии (<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). Дихаманетин (11) показва цитотоксична активност срещу HL-60 и HCT116 с IC50 стойности от 15,78ug·mL-1 （33,70 μmol-L-1） и 18,99 ug·mL-I（40,56 μmol .L-1）, съответно, докато сместа от уваринол （12） и изоуваринол (13) демонстрира цитотоксична активност срещу HL-60, с IC50 стойност от 9,74 ug∶mL-I, и HCT116, с IC50 стойност от 17,31 ug·mL-1. Тези резултати върху туморните клетъчни линии също са описани за първи път за бензилираните дихидрофлавони. Цитотоксичните активности на ретикулин, анонаин и лириоденин са установени по-рано, в които лириоденинът е най-мощното съединение.

Резултатите, получени в тази работа, показват, че видовете от семейство Annonaceae са обещаващ източник на биологично активни съединения с цитотоксични свойства и предполагат продължаване на тяхното изследване в други модели на биологични анализи.

Препратки

1. Couvreur, TLP; Pirie, MD; Chatrou, LW; Saunders, RMK; Su, YCF; Richardson, JE; Erkens, RHJ Ранна еволюционна история на семейството на цъфтящите растения Annonaceae: Стабилна диверсификация и бореотропно георазпръскване. J. Biogeogr. 2011, 38, 664–680. [CrossRef]

2. Corrêa, MP Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas; IBDF Ministério da Agricultura: Рио де Жанейро, Бразилия, 1984 г.

3. Льобьоф, М.; Кейв, А.; Bhaumik, PK; Mukherjee, B.; Mukherjee, R. Фитохимията на Annonaceae. Фитохимия 1982, 21, 2783–2813. [CrossRef]

4. Rupprecht, JK; Hui, Y.-H.; McLaughlin, JL Annonaceous acetogenins: Преглед. J. Nat. произв. 1990, 53, 237–278. [CrossRef]

5. Лусио, ASSC; Алмейда, JRGDS; Да-Куня, EVL; Tavares, JF; Filho, JMB Алкалоиди на Annonaceae: Поява и компилация от техните биологични дейности. В Алкалоидите; Knolker, H.-J., Ed.; Elsevier: Амстердам, Холандия, 2015 г.; Глава 5; Том 74, стр. 233–409. [CrossRef]

6. Souza, CAS; Nardelli, VB; Паз, WHP; Пинейро, MLB; Родригес, ACBC; Bomfifim, LM; Soares, MBP; Безера, DP; Чаар, JS; Кулен, HHF; et al. Фенилпропаноиди, получени от азарон и алкалоиди, получени от изохинолин, от кората на Duguetia pycnastera (Annonaceae) и тяхната цитотоксичност. Quim. Нова 2020, 43, 1397–1403. [CrossRef]

7. Араухо, MS; Силва, FMA; Кулен, HHF; Costa, EV Алкалоиди, получени от изохинолин от кората на Guatteria olivacea (Annonaceae). Biochem. Syst. Ecol. 2020, 92, 104105. [CrossRef]

8. Ngouonpe, AW; Mbobda, ASW; Хапи, GM; Мбиантча, М.; Татуедом, ОК; Али, MS; Lateef, M.; Tchouankeu, JC; Kouam, SF Натурални продукти от лечебното растение Duguetia staudtii (Annonaceae). Biochem. Syst. Ecol. 2019, 83, 22–25. [CrossRef]

9. Сантос, RC; Соуза, AV; Андраде-Силва, М.; Круз, KCV; Касуя, CAL; Кардосо, CAL; Виейра, MC; Formaggio, ASN Антиоксидантно, антиревматично и противовъзпалително изследване на екстракт и дицентринон от Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benth. & Кука. f. J. Ethnopharmacol. 2018, 211, 9–16. [CrossRef]

10. Коста, Е.В.; Пинейро, MLB; Соуза, ADL; Barison, A.; Кампос, Франция; Валдес, RH; Уеда-Накамура, Т.; Диас Фильо, BP; Nakamura, CV Трипаноцидна активност на оксоапорфин и пиримидин- -карболинови алкалоиди от клоните на Annona foetida Mart. (Annonaceae). Молекули 2011, 16, 9714–9720. [CrossRef]

11. Силва, ДБ; Тули, ЕКО; Милита, GCG; Коста-Лотуфо, LV; Pessoa, C.; Мораес, Мисури; Албакърки, С.; Siqueira, JM Антитуморните, трипаноцидни и антилейшманиални дейности на екстракт и алкалоиди, изолирани от Duguetia furacea. Фитомедицина 2009, 16, 1059–1063. [CrossRef] [PubMed]

12. Коста, Е.В.; Пинейро, MLB; Xavier, CM; Силва, JRA; Амарал, ACF; Соуза, ADL; Barison, A.; Кампос, Франция; Ferreira, AG; Мачадо, GMC; et al. Пиримидин- -карболин и други алкалоиди от Annona foetida с антилейшманиална активност. J. Nat. произв. 2006, 69, 292–294. [CrossRef]