Кратко вдишване на севофлуран може да намали образуването на глиален белег след хипоксично-исхемично мозъчно увреждане при новородени плъхове, част 1

Резюме

Предишни проучвания показват, че посткондиционирането със севофлуран може да осигури невропротекция след хипоксично-исхемично увреждане и да подобри функцията на учене и памет в развиващите се мозъци на гризачи.

Хипоксично-исхемичното увреждане се отнася до патологично състояние, причинено от церебрална исхемия, хипоксия, метаболитно разстройство и увреждане на нервните клетки поради нарушения на сърдечно-съдовата и мозъчно-съдовата система. Със социалния прогрес и промените в начина на живот, хипоксично-исхемичните увреждания стават все по-чести. Това състояние може да причини много вреди на човешкото здраве, включително да засегне интелигентността и паметта.

Въпреки че хипоксията и исхемията могат да причинят спад в мозъчната функция, това не означава, че паметта ще бъде отрицателно засегната. Напротив, можем да подобрим паметта и да увеличим ефективността на мозъка чрез правилните методи. Ето няколко начина да подобрите паметта си:

1. Здравословна диета: Въздействието на диетата върху паметта е много важно. Храни, богати на протеини, витамини и минерали, могат да помогнат за поддържане на здрава нервна система и мисловна функция.

2. Спортувайте повече: Физическите упражнения могат да насърчат кръвообращението, да увеличат притока на кислород, да подобрят имунитета на тялото и да намалят риска от заболяване. Чрез упражнения можете да подобрите способността си за памет.

3. Укрепване на самочувствието: Увереността е важен фактор в паметта на човека. Ако вярвате, че можете да изпълните определена задача, лесно ще постигнете желаните резултати, а също така можете ефективно да подобрите паметта си.

Може да се види, че хипоксично-исхемичното увреждане не е състояние, което неизбежно ще навреди на човешката памет. Докато владеем правилните методи и се грижим добре за мозъка си, можем да прегърнем едно здраво бъдеще с положителна нагласа. Вижда се, че трябва да подобрим паметта и Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola е традиционен китайски лекарствен материал, който има много уникални ефекти, един от които е да подобрява паметта. Ефикасността на Cistanche deserticola идва от множеството активни съставки, които съдържа, включително танинова киселина, полизахариди, флавоноидни гликозиди и др. Тези съставки могат да насърчат здравето на мозъка чрез различни пътища.

Щракнете върху познайте 10 начина за подобряване на паметта

Класическият модел на Rice-Vannucci беше използван за предизвикване на хипоксично-исхемично увреждане и новородени (постнатален ден 7) плъхове бяха третирани с 2,4% севофлуран в продължение на 30 минути след хипоксично-исхемично увреждане.

Нашите резултати показват, че посткондиционирането със севофлуран значително подобрява ученето и функцията на паметта на плъхове, намалява астроглиозата и образуването на глиални белези, увеличава броя на дендритните шипове и защитава хистоморфологията на хипокампуса. Механично, посткондиционирането на севофлуран намалява експресията на von Hippel-Lindau на индуцируемия от хипоксия фактор-1 и повишава експресията на DJ-1.

Инжектирането на 1,52 ug от инхибитора на индуцирания от хипоксия фактор-1 YC-1 (Lificiguat) в лявата странична камера 30 минути преди хипоксично-исхемично увреждане обърна неврозащитата, индуцирана от севофлуран. Това откритие предполага, че севофлуран може ефективно да облекчи астроглиозата в хипокампуса и да намали уврежданията на ученето и паметта, причинени от образуването на глиален белег след хипоксично-исхемично увреждане.

Основният механизъм може да е свързан с повишена експресия на DJ-1, намалено убиквитиниране на индуцируем от хипоксия фактор-1 и стабилизирана експресия на индуцируем от хипоксия фактор-1. Това проучване е одобрено от Комитета за грижа за лабораторни животни към Китайския медицински университет, Китай (одобрение № 2016PS337K) на 9 ноември 2016 г.

Ключови думи: мозъчна травма; мозък; Централна нервна система; in vivo; нараняване; модел; пластичност; плъх; възстановяване; регенерация; ремонт Китайска библиотечна класификация № R453; R741; R614.2+1.

Въведение

Неонаталната хипоксично-исхемична енцефалопатия (HIE) е често срещано усложнение в неонаталния период, причинено от много фактори, като неонатална асфиксия, вътрематочен дистрес и хиалинемембранна болест (Douglas-Escobar and Weiss, 2015; Barkhuizen et al., 2017).

HIE е водещата причина за детските смъртни случаи и основният източник на неврологични последствия (Edwards et al., 2010; Descloux et al., 2015). Деветдесет процента от оцелелите от HIE имат дългосрочна неврологична дисфункция, като например нарушения на ученето, когнитивни и двигателни дисфункции и епилепсия (Doi et al., 2012; Davies et al., 2019). Текущото лечение на HIE се фокусира главно върху симптоматично лечение, включително механична вентилация, корекция на хипотонията, добавяне на глюкоза и ограничаване на приема на течности, както е подходящо.

Необходимо е обаче ефективно лечение, способно да обърне или намали дългосрочното увреждане на мозъка (Stankowski and Gupta, 2011; Davidson et al., 2015). Като основна част от ученето и разпознаването, хипокампусът, включително зъбчатият гирус (DG) , CA1 и CA3 региони, участва в трансформирането и интегрирането на периферна информация в нервните центрове (Morris et al., 2012; Jung et al., 2020).

Хипокампусът е свръхчувствителен към хипоксично-исхемично (HI) увреждане, което може да провокира апоптоза на хипокампневрони, да стимулира прекомерна реактивна глиоза и да доведе до образуване на глиални скари (Hopkins and Haaland, 2004; Wang et al., 2012). Пролиферацията на астроцити е от решаващо значение за запечатване на мястото на инфаркта, ремоделиране на структурата на хипокампуса и временно контролиране на локалните имунни отговори по време на острата фаза (Rolls et al., 2009).

Въпреки това, образуването на хипертрофия и глиален белег допринася за аберантна неврогенеза, възпрепятства растежа на дендритния шип и възпрепятства формата на синапса, като допълнително уврежда функциите за учене и разпознаване (Yiuand He, 2006; Wanner et al., 2008; Burda and Sofroniew, 2014; Pekny et al. , 2014; Shi et al., 2017).

Глиалният фибриларен киселинен протеин (GFAP) и хондроитин сулфатните протеогликани, като неврокан, са патологични маркери на астроглиоза и глиални белези, чиято експресия може да бъде регулирана нагоре от силно активирани астроцити (Pekny и Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 2016). По този начин, инхибирането на астроглиоза и глиални белези може да бъде терапевтична цел за HIE и неговите дългосрочни неврологични последствия.

Прилагането на севофлуран е доказано за смекчаване на HI нараняване при гризачи. Проучвания, изследващи значението на посткондиционирането със севофлуран (SPC) за облекчаване на увреждането на HI чрез регулиране на индуцируемия от хипоксия фактор-1 (HIF-1) при възрастни гризачи и новородени плъхове, са идентифицирали няколко потенциални механизма (Wang et al., 2019b; Yanget др., 2019 г.; Ду и др., 2020 г.; Лиу и Гонг, 2020 г.).

Като ключов физиологичен сензор за хипоксия, HIF-1 е транскрипционен фактор със стотици молекули надолу по веригата, включени в механизми на исхемична толерантност, като васкуларен ендотелен растежен фактор и еритропоетин (Na et al., 2015). Доказано е, че хипоксичното посткондициониране намалява активирането на астроцитите и микроглиите след HI в мозъци на новородени плъхове (Teo et al., 2015).

Поради това предположихме, че HIF-1 може да допринесе за намаляване на образуването на глиални белези и астроглиоза. HIF-1 може да съществува конститутивно в невроните, при което бързо увеличава експресията си и се натрупва при хипоксични условия. Въпреки това, когато кислородът се върне към нормалното, експресията на HIF1 не може да се поддържа на достатъчно високо ниво, за да упражнява непрекъснато невропротективен ефект поради кислород-зависимо разграждане от пролил-хидроксилазни протеини и последващо убиквитилиране от von Hippel-Lindau (VHL) протеини (Berra et al., 2003; Джан и др., 2018).

Съобщава се, че DJ-1 (кодиран от Park7) е невропротективен протеин, особено при окислителни условия (Aleyasin et al., 2007, 2010). VHL протеинът физически взаимодейства с DJ-1, както е определено от безпристрастен масспектрометричен екран и потвърдено в модел на болестта на Паркинсон (PD). В допълнение, Parsanejad et al. (2014) показаха, че DJ-1 инхибира VHL-зависимата убиквитилация и стабилизира експресията на HIF-1.

По този начин ние предположихме, че севофлуран стабилизира протеина HIF-1 в хипокампуса чрез регулиране на DJ-1, за да инхибира повсеместното разпространение на HIF-1, като по този начин подобрява дългосрочното учене и функцията на паметта.

За да изследваме ролята на HIF-1 във връзката между севофлуран и астроглиозата, използвахме YC-1 (Lificiguat), като селективен антагонист на HIF-1, за пълно инхибиране на експресията на HIF-1 при посттранскрипционното ниво. В това проучване ние изследвахме ролята на HIF-1a в неврозащитата на SPC-третирани HIE неонатални плъхове.

Материали и методи

Животни
Изследванията при животни са проведени на синаптичния етап на развитие на плъхове, който започва на постнатален ден 7 (P7), съответстващ на периода на растеж на човешки бебета от късна бременност до 3 години след раждането (Jevtovic-Todorovic et al., 2003). Седемдневни плъхове Sprague-Dawley с тегло 12–16g бяха избрани от 20 бременни плъхове (закупени от лабораторията на болница Shengjing, Китайски медицински университет, Китай; съотношение мъжки/женски, 1:1).

Всички плъхове имаха свободен достъп до вода и храна и се поддържаха стандартна влажност и температура в лабораторията с 12-часови цикли светлина/тъмнина (8 сутринта/20:00 часа). Всички експерименти с животни са извършени в съответствие с Насоките на Националния институт по здравеопазване (Bethesda, MD, САЩ) за грижа и използване на лабораторни животни.

Комитетът за грижа за лабораторни животни към Китайския медицински университет официално одобри описаните експерименти (Шенян, Китай; одобрение № 2016PS337K) на 9 ноември 2016 г.

От 25 бременни плъха бяха избрани 249 плъха P7 и произволно разделени на групи въз основа на таблица с произволни числа (Wang et al., 2019a). Нашият окончателен анализ включва общо 201 новородени плъхове; смъртността след лечение с HI е 19%.

Тези 201 новородени плъхове бяха разделени на случаен принцип в четири групи: фалшиви (n=54), HI (n=54), HI + севофлуран (HIS) (n=54) и HIS+ YC{{ 6}} (n=39) групи. Във всяка група 24 плъха бяха използвани за Western blot анализ, 5 бяха използвани за имунохистохимия и оцветяване на Голджи и 10 бяха използвани за поведенчески тестове. Останалите 45 плъха във фалшиви, HI и HIS групи бяха използвани за полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT- PCR).

Експериментален дизайн и излагане на анестезия

Използваният HIE модел беше описан по-рано (Zhao et al., 2007; Grandvuillemin et al., 2017). Въз основа на разстоянието между ануса и репродуктивните органи, сексидентификацията на постнаталните плъхове беше завършена. За да се установи моделът HIE, главата на всеки плъх P7 беше поставена в прозрачна пластмасова тръба, която беше запечатана с памук, преди севофлуранът да бъде освободен (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019).

Лявата обща каротидна артерия на всеки плъх беше постоянно лигирана и между двете връзки артерията беше прерязана; всяка операция е завършена в рамките на 5 минути. Впоследствие плъховете се събудиха незасегнати от анестезия и бяха върнати обратно в клетките на майките си за 2 часа. За прилагане на SPC, плъховете бяха поставени в прозрачна камера (Lingzhi Company, Hangzhou, Китай), свързана с изпарител на асевофлуран; единият канал подпомагаше вентилацията, докато другият пренасяше газовата проба от камерата към монитора.

Камерата се вентилира с 30% O2 и 70% N2 в продължение на 2 часа за фиктивната група, докато 8% O2 и 92% N2 се прилагат в продължение на 2 часа на групата HI. SPC беше установен незабавно след HI: 2,4% севофлуран (1 минимална алвеоларна концентрация) беше инхалиран от плъхове в камера с атмосфера от 30% O2 и 70% N2 и скорост на въздушния поток от 2 L/min за 30 минути. Отоплителният басейн стабилизира температурата в камерата на 37 градуса.

Прилагане на лекарства

Точно 30 минути преди HI, 1,52 ug HIF-1 инхибитор (YC1; Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) беше инжектиран в лявата странична камера (Paxinos and Franklin, 2013) с помощта на спринцовка 5-μLHamilton (Yingweida Technology, Пекин, Китай). Както беше описано по-рано, YC-1 се разтваря в изкуствена церебрална спинална течност при концентрация от 0,304 ug/μL (Shen et al., 2012; Na et al., 2015).

Western blot анализ

P7 плъхове бяха анестезирани с 2% севофлуран и тъканите на хипокампа бяха извлечени от малки на 12, 24 и 48 часа и 28 дни след операцията. След екстракция тъканите веднага се поставят върху лед.

Общите супернатантни протеини бяха изолирани чрез добавяне на радиоимунопреципитационен анализ (Beyotime, Haimen, Китай). Концентрациите на протеин се определят с One BCA Kit (Beyotime).

След това пробите се разделят върху 12,5% натриев додецилсулфат-полиакриламидни гелове и се прехвърлят в нитроцелулозни мембрани. След блокиране с 5% говежди серумен албумин (Sigma-Aldrich) при 4 градуса, мембраната се инкубира с подходящите първични антитела, включително анти-глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH; 1:2000; Cat# 5174S; CellSignaling Technology , Данвърс, Масачузетс, САЩ), анти-DJ-1 (1:1000; Cat# ab18257; Abcam, Cambridge, UK), анти-VHL (1:5000; поликлонален; Cat# ab77262; Abcam), анти -HIF-1 (1:900;поликлонален; Cat# ab2185; Abcam), антиневрокан (1:200;моноклонален; Cat# sc-33663; Santa Cruz Biotechnology, Далас, Тексас, САЩ) , протеин с анти-постсинаптична плътност 95 (PSD95; 1:1000; моноклонален; Кат. № 3409S; Технология за клетъчно сигнализиране), протеин, свързан с антирастеж 43 (GAP43; 1:2000; поликлонален; Кат. № 16971-1-AP; Proteintech Biotechnology , Чикаго, Илинойс, САЩ) и анти-GFAP (1:5000, поликлонално, Cat# ab53554; Abcam).

След това блотовете се инкубират с анти-заешки IgG (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao, Пекин, Китай) или анти-миши IgG (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao) за 2 часа при стайна температура.

Протеиновите петна се визуализират с подобрени реагенти за откриване на хемилуминесценция (SuperSignal West Pico; Pierce, Rockford, IL, USA). Протеиновите ленти бяха количествено определени със софтуер ImageJ (Национални здравни институти). За анализ на Western blots, данните бяха нормализирани към GAPDH.

Имунохистохимия

Двадесет и осем дни след операцията, на плъховете се прилага анестетик, използвайки метода, описан по-горе, перфузиран с 4% формалин и мозъците им се отстраняват за имунофлуоресцентно оцветяване.

Мозъците бяха потопени в 4% параформалдехид при 4 градуса за 48 часа, впоследствие дехидратирани в градуирана серия от етанол и накрая вградени в парафин. След това вградените в парафин тъкани бяха нарязани на срезове с дебелина 2.5-μm с вибратом и получените срезове бяха съхранявани при стайна температура.

Всеки мозък беше нарязан непрекъснато и три прекъснати мозъчни срези бяха избрани за NeuN (невронен маркер), GFAP (астроцитен маркер) и оцветяване с неврокан (глиален белег). За двойно маркиране тъканните срезове бяха инкубирани с две смесени първични антитела, включително кози анти- GFAP(1:250; поликлонален; Cat# ab53554; Abcam), заешки антигени (1:100; Cat#12943; Cell Signaling Technology) и/или миши анти-неврокан (1:200; моноклонален; Cat# sc{{ 10}};Биотехнология на Санта Круз) при 4 градуса през нощта във влажна камера.

Впоследствие срезовете се промиват с 0.1 Mфосфатно буфериран физиологичен разтвор и се инкубират в продължение на 2 часа при стайна температура със съответните вторични антитела, включително анти-заешки IgG, конюгиран с Alexa Fluor-594 (1:200; Живот Technologies, Гранд Айлънд, Ню Йорк, САЩ), анти-миши IgG, конюгиран с Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies), и анти-кози IgG, конюгиран с флуоресцеин изотиоцианат (1:200; Life Technologies).

Контраоцветяването на клетъчните ядра беше приложено с 4',6-диамидино-2-фенилиндол (Beyotime) за 5 минути.

Микроскоп Olympus BX51 (OlympusCorporation, Токио, Япония) беше използван за наблюдение на оцветени срезове. Три зрителни полета на левия хипокампус бяха избрани на случаен принцип от всеки срез за фотография. Софтуерът ImageJ беше използван за оценка на количествената колокализация и следователно за изчисляване на коефициента на припокриване на Manders.

For more information:1950477648nn@gmail.com