Сърдечни и бъбречни ефекти на чернодробна цироза при растящ животински модел

edmund.chen@wecistanche.com

ВъведениеЧернодробната цироза е резултат от прогресивното заместване на нормалния паренхим с фиброза, образуване на възли и развитие на признаци и симптоми на портална хипертония и органна недостатъчност. При децата водещата причина за цироза, изискваща чернодробна трансплантация, е билиарната атрезия1,2. Цирозата може също да доведе до прояви в други органи, като сърце3, бели дробове4, мозък5 ибъбреци 6. Беше потвърдено, че пациентите с портална хипертония са увеличили както циркулиращите, така и ендотелните вазодилататори7—като азотен оксид (NO)8—, поради комбинация от увредена чернодробна функция и изпускане на вазодилататори през портосистемни шънтове9. Този процес допринася за развитието на спланхнична артериална вазодилатация, което води до развитие на хипердинамичен синдром с намален централен кръвен обем, последван от индуцирано от барорецепторите активиране на системата ренин-ангиотензин-алдостерон (RAAS) и симпатиковата нервна система (SNS)10 . Това явление на активиране причинявабъбречнавазоконстрикция, която е неразривно свързана с развитието на хепато-бъбречен синдром11.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ФУНКЦИЯ

При нормални условия,бъбречна функцияе силно зависим от кръвната перфузия и тъканната оксигенация, които се регулират главно от азотен оксид (NO) и азотен оксид синтаза (NOS). NO се произвежда от NOS, присъстващ в три форми: невронална (nNOS), ендотелна (eNOS) и индуцируема от цитокини (iNOS)12. eNOS обикновено се експресира в тъканите и произвежда NO във физиологични количества. По време на исхемично-реперфузионно увреждане, NO, произведен от eNOS, подобрява микроциркулацията чрез насърчаване на вазодилатация и инхибиране на тромбоцитната агрегация13. По подобен начин очевидната хиповолемия при пациенти с цироза води до задържане на вода и натрий отбъбрекс последващо увеличаване на плазмения обем, което в допълнение към механизмите на вазоконстрикция насърчава увеличаване на сърдечния дебит и претоварване на сърцето14. Смята се, че това е патофизиологичният механизъм на цирозната кардиомиопатия, състояние, което се среща при почти 50 процента от пациентите с цироза15, характеризиращо се с притъпена контрактилна чувствителност към стрес и/или променена диастолна релаксация с електрофизиологични аномалии, без предишно сърдечно заболяване. Цирозата е свързана с хистологични аномалии в кардиомиоцитите, а именно оток, лека дифузна фиброза, ексудация, ядрена и цитоплазмена вакуолизация, необичайна пигментация и вентрикуларна дилатация и хипертрофия16-18. Циротичната кардиомиопатия е етиологично независима от цирозата и е замесена в развитието на усложнения като чернодробна нефропатия16.

Всъщност, набъбречнаи сърдечните ефекти на цирозата са сравнително добре дефинирани при възрастни, въпреки че не е известно дали тези находки са подобни при деца с цироза. Освен клиничните проучвания, използването на експериментални модели за изследване на чернодробната цироза и нейните ефекти е привлекателно. Моделът на лигиране на общия жлъчен канал (BDL) при плъхове, както при възрастни, така и при растящи животни, представя няколко предимства, като ниска цена, лесна манипулация и грижа за животните, както и простота на хирургическата процедура. Нашата група стандартизира този модел при новородени и отбити плъхове, което е доказано, че е надежден модел на билиарна цироза при развиващи се организми17-19. Малко проучвания са изяснилибъбречнаи сърдечни прояви на чернодробна цироза в млади организми, симулиращи деца с билиарна атрезия. Следователно целта на настоящото изследване беше да се оценибъбречнаи сърдечни последици от BDL в модел на отбити плъхове, чрез използване на биохимични, хистологични, хистоморфометрични и молекулярни анализи.

Ключови думи:Жлъчни пътища, екстрахепатална, чернодробна цироза, модели, бъбреци, бъбреци

МетодиЗа животните се полагат грижи в съответствие с критериите, описани в „Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, изготвено от Националната академия на науките. Имаше два протокола от изследването, които бяха прегледани и одобрени откомисията по етика на животните към нашата институция. Бяха използвани петдесет и две отбити плъхове Wistar от двата пола (Rattus norvegicus Albinus, Rodentia, Mammalia), на възраст 21 дни, с тегло 50-70 g. Всички животни бяха настанени при специфични условия, свободни от патогени, държани в пластмасови клетки (размери: 49 × 34 × 16 cm) с две котила, върху постеля от дървени стърготини и подложени на 12--часов цикъл светло-тъмно, при температура 22 степен ± 2 градуса, среда с контролирана влажност (55 процента) и свободен достъп до пречистена вода и храна (Nuvilab CR-1 търговска храна, Quimtia, Colombo, PR, Бразилия). Клетките се сменяха два пъти седмично. Животните се аклиматизират в помещението за изпитване най-малко три дни преди експериментите. Клинични признаци като консумация на храна, изправяне на задните косми, секреция на хардерианова жлеза (която възниква, когато животните са раздразнени или тревожни), диария и летаргия, бяха наблюдавани и записвани веднъж седмично по време на всички експериментални периоди. Плъховете, които показват клинични признаци на силна болка преди края на експерименталния протокол, незабавно са евтаназирани отпредозиране с изофлуран (Isoforine®, Cristália, Itapira, SP, Бразилия).Животните бяха разделени на две групи: експериментална (n=32) и контролна (n=20). В експерименталната група, животните претърпяха лигиране на общия жлъчен канал (BDL) и бяха разделени на четири подгрупи с осем плъха всяка, според времето, изминало от BDL до евтаназията: ● Група 1: евтаназия две седмици след BDL; ● Група 2: евтаназия четири седмици след BDL; ● Група 3: евтаназия шест седмици след BDL; ● Група 4: евтаназия осем седмици след BDL. Контролните животни бяха разделени на четири подгрупи с по пет плъха всяка, като възрастта им съответстваше на животните в експерименталната група.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ДИАЛИЗА

Анестезия и хирургияВсички изследователи са били подходящо квалифицирани и компетентни чрез обучение в използваните хирургични процедури. Плъховете бяха анестезирани с интраперитонеална инжекция на кетамин хидрохлорид (Ketalar®) при 30 mg/kg и дексмедетомидин (Precedex®) при 10mg/kg, с допълнителна инхалация на изофлуран по време на хирургическата интервенция процедура. Адекватната дълбочина на анестезията се проверява периодично чрез липсата на ноцицептивен отговор на върха на опашката и интердигиталното прищипване. Такъв ноцицептивен отговор може да бъде или всяко реактивно движение или рефлекс (обикновено рефлекс на отдръпване на педала), или забележимо повишаване на сърдечната честота или честотата на дишане. В случай на неадекватна аналгезия се извършва допълнително интраперитонеално приложение на 15 mg/kg кетамин. Процедурата се състоеше от 2- cm разрез по средна линия в горната част на корема, започващ непосредствено под мечовидния израстък. Червата и черният дроб бяха екстериоризирани, за да се даде възможност за визуализация на жлъчните пътища. Използвайки mon nylon 6.0, беше извършено двойно лигиране на общия жлъчен канал, последвано от разделяне между двете връзки. Коремът беше затворен с непрекъснат единичен шев с помощта на Mononylon 4.0. След това животните бяха почистени и поставени в режим на възстановяване под аналгезия, с вода и храна, доставяни ad libitum.

След завършване на експерименталния протокол, плъховете бяха претеглени и евтаназирани чрез предозиране с изофлуран (Isoforine®, Cristália, Itapira, SP, Бразилия), следвайки насоките на Комитета по етика при използване на животни на нашата институция. Извършена е широка надлъжна лапаротомия, за да се разкрие коремната аорта, и е взета артериална кръв за биохимични тестове. След стернотомия сърцето беше отстранено. Черен дроб ибъбрекбяха събрани проби за молекулярни, хистологични и хистоморфометрични анализи. Обем на сърцето: сърцата на животните бяха отстранени (на кръстовището с големите съдове) от гръдния кош и поставени в нормален физиологичен разтвор за измиване на кръвта от сърдечните кухини. След това сърцето се потапя в контейнер, пълен с формалдехид, и общият обем на органа се изчислява въз основа на обема на течността, изместена от контейнера

Биохимични изследванияИзмерват се серумните нива на урея и креатинин на всички животни.Хистологични и хистоморфометрични анализиЗа хистологичен анализ пробите се държат 24 часа в 10% формалдехид. След фиксиране, материалът беше подложен на дехидратация, последвано от вграждане в парафин, и 4-µm-дебели хистологични срезове бяха оцветени с хематоксилин-еозин (HE) за общи морфологични изследвания и picrosirius червено за идентифициране на колагенови влакна. Хистологичните слайдове бяха изследвани под светлинен микроскоп и прегледани на сляпо от двама патолози. Анализът на чернодробния паренхим се извършва в срезове, оцветени с HE, за да се проверят промените, стимулирани от BDL. Хистологичните слайдове бяха анализирани на сляпо от двама патолози под оптичен микроскоп, като се има предвид степента на дуктуларна пролиферация. За броя на жлъчните канали бяха анализирани пет произволно избрани полета на слайд, съдържащ поне едно портално пространство. Анализираните портални пространства бяха очертани с помощта на компютърна мишка.

Относнобъбрек,набъбречнапаренхимът се приготвя в напречни срезове, оцветени с HE и оценени за наличие на билирубинова импрегнация вбъбречнатубули и цитологични промени (хидропична дегенерация, загуба на ядра и граници на плазмената мембрана). Бяха анализирани пет произволно избрани полета на слайд. Въз основа на тези констатации всяко поле беше класифицирано според следните критерии: 1. Липсва; 2. Лека билирубинова импрегнация; 3. Умерено импрегниране с билирубин: a. без цитологични промени; b. с цитологични промени; 4. Интензивно импрегниране с билирубин: a. без цитологични промени; b. с цитологични изменения.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА НЕДОСТАТЪЧНОСТ

Що се отнася до сърцето, след фиксиране за кратко време в 10 процента неутрален буфериран формалин, сърцето се разрязва по средата, непосредствено под предсърдно-вентрикуларните клапи. След това двете половини се поставят отново в 10 процента неутрален буфериран формалин за фиксиране чрез потапяне. Впоследствие те бяха вградени в парафинови блокове, от които бяха приготвени слайдове с парафинова тъкан с дебелина 4- μm. Тези слайдове, поредица от напречни сечения през вентрикулите, бяха оцветени с HE и пикросириус червено. Морфометричният анализ беше извършен на пет слайда от всяко сърце. Количествените данни са получени с компютъризирана система за анализ на изображения (NIS-Elements Advanced Research). Измерени са следните параметри: дебелина на свободната стена на лявата и дясната камера (200x увеличение); и вътрешни диаметри на дясната и лявата камера (400x увеличение).

Беше анализирано отлагането на колаген в миокардната тъкан. Натрупването на колаген в миокардната тъкан се оценява в слайдове, оцветени със Сириус червено. Този анализ е извършен по два различни метода. Периваскуларният колаген се определя количествено чрез оценка на процента на оцветена тъкан (колагенови влакна) в рамките на обща ограничена област, със стойности, изразени като процент колаген/μm2. Бяха уловени три произволни полета на вентрикул, съдържащи поне един съд. Площите на съдовете за измерване бяха очертани с помощта на компютърна мишка. Използван е графичен ресурс за етикетиране на структурите, които трябва да бъдат количествено определени (колагенови влакна). Площите на колагена и пространството на съдовете се измерват в квадратни микрометри. Площта на колагена беше разделена на площта на областта, очертана в пространството на съда, и получената стойност беше изразена като процент на колаген (т.е. част от площта). Интерстициалният колаген се анализира с помощта на полуколичествена скала. Четири случайни полета на всеки слайд бяха заснети под 200x увеличение. Наличието на оцветена тъкан (интерстициални колагенови влакна) на поле беше оценено съгласно следната скала: ● 0: липсва; ● 1: лек; ● 2: умерено; ● 3: тежко.

Молекулярен анализЕкспресиите на NOS и eNOS в сърдечни ибъбречнатъканите бяха анализирани чрез метод на количествена обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция (RT-PCR), съгласно предишните публикации от нашата лаборатория 21, 22.статистически анализиЗа морфометрични данни и данни за сърдечен обем, връзката между тези данни и теглото на животното беше изчислена и използвана за статистически сравнения. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на софтуера Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 18.0 за Windows (SPSS, Съединени щати). Тестът на Shapiro-Wilk беше използван, за да се определи дали групите данни имат гаусово разпределение. Непрекъснатите количествени данни бяха анализирани чрез t-тест, еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) и постхок теста на Tukey съответно за две и три или повече групи. Непараметричните данни бяха анализирани чрез теста на Mann-Whitney за сравняване на две групи и чрез Kruskal Wallis и пост-хок теста на Dunn за сравняване съответно на три или повече групи. Двустранна стойност от По-малко или равно на 0.05 се счита за статистически значима.

РезултатиШест животни от опитните групи (18,7%) са умрели по време на експеримента. В края на експеримента всяка подгрупа имаше минимум пет оцелели животни. Всички BDL животни показаха дилатация на общия жлъчен канал като следствие от дисталната обструкция, която се засилваше през времето, с очевидни промени в чернодробния паренхим, натрупване на асцит и спленомегалия. Резултатите от биохимичните тестове, както и морфометричните оценки на телесното тегло, сърдечния обем и съотношението на сърдечния обем към телесното тегло, са показани на Фиг. 1. Няма разлики между серумните нива на урея и креатинин при контролните животни и тези с цироза изследвания период. Установено е, че сърцата на животни с цироза са по-големи от тези на контролните шест седмици след BDL (p= 0.042).

ДискусияДокато миокардните и реалните последици от цирозата са клинично и експериментално добре дефинирани при възрастни, при децата те трябва да бъдат напълно изяснени. Много проучвания показват, че децата с билиарна атрезия в напреднал стадий на цироза се развиватбъбречнадисфункция1, а наскоро и миокардна дисфункция' главно при стрес. Целта на това проучване е да се характеризират бъбречните и сърдечните промени, предизвикани от билиарна цироза при млади организми, като се използва техниката на лигиране на общия жлъчен канал при отбити плъхове. Предишни проучвания показват, че жлъчното лигиране при възрастни мишки и плъхове е добър модел за изследване на сърдечните192 и бъбречните2 последици от цироза. Групата е провела предишни проучвания с използване на BDL при отбиване на плъхове и е установила подчертано и бързо развитие на хистологични и клинични признаци на цироза при тези животни9,20. Въпреки техническите трудности при справянето с отбиването на плъхове, като малкия размер на структурите, ронливостта на тъканите (главно чернодробни дялове), чрез интензивно обучение бяха постигнати ниски нива на смъртност, свързани с хирургическата процедура. Въпреки това, с удължаването на времето след BDL (особено след четири седмици), прогресията на цирозата е причина за нарастващата смъртност. По подобен начин се очаква миокардните и бъбречните дисфункции при плъхове да стават по-очевидни, колкото по-дълго е времето след BDL. Анализът на сърдечния обем позволи индивидуализирано измерване на миокардната тъкан, като се изключи вътрешното пространство на камерите. Сърцата на животни с цироза бяха по-големи от тези на контролите, но се виждаха

тенденция към намаляване след осем седмици. Това предполага, че сърцето с цироза първоначално развива хипертрофия, но след определен момент мускулните стени започват да се стесняват и съответно намалява контрактилната сила. Хистоморфометричната оценка подкрепи тези констатации. Съотношението между вътрешния диаметър на дясната и лявата камера и общото телесно тегло остава стабилно при контролните животни, докато растат. При BDL животни имаше първоначално намаляване на вътрешния диаметър на двете вентрикули, което предполага миокардна хипертрофия. При по-късните групи животни обаче вентрикулните камери показват тенденция към разширяване, което предполага сърдечна недостатъчност. В контролните групи дебелината на стената на вентрикула изглежда намалява с нарастването на животното, стабилизирайки се в крайна сметка. Експерименталните групи, от друга страна, не показват това физиологично намаляване. Това е ясна индикация за отрицателните ефекти на цирозата върху растящото сърце. В това проучване също беше оценено дали тези сърдечни хистоморфометрични промени са последвани от миокардна фиброза. Всъщност беше открито прогресивно периваскуларно отлагане на колаген в лявата камера и количеството интерстициален колаген беше постоянно по-високо при всички експериментални животни спрямо съответните им контролни групи.

Наскоро ефектите от взаимодействията на възпалителната ос на черния дроб и канабиноидния 2 рецептор (CB2-R) бяха изследвани в експериментален модел на чернодробна кардиомиопатия. Беше показано, че активирането на CB2-R намалява серумните нива на TNF-алфа и подобрява сърдечната дисфункция, миокардното възпаление и оксидативния стрес, подчертавайки значението на възпалителните медиатори в патологията на чернодробната кардиомиопатия21. Възможно е да се заключи, че в младите организми възниква подобен възпалителен процес, водещ по-късно до отлагане на периваскуларен и интерстициален колаген, който вероятно има роля в цирозната миокардна дисфункция. В други скорошни проучвания беше показано, че сърдечната хронотропна дисфункция се причинява главно от повишен сърдечен синтез на NO22. NO модифицира сърдечната функция чрез гуанилил циклаза-зависими и независими механизми. По подобен начин, въпреки че общата експресия на NOS не е променена от жлъчно лигиране, първоначално се наблюдава намаляване на експресията на eNOS в сърцето в сравнение с контролните животни. С напредването на цирозата експресията на този ген се увеличава, феномен, който е изследван в много проучвания22-24. Беше демонстрирано, че NO в резултат на активността на eNOS има благоприятен ефект22-24. Следователно е възможно някои защитни или механизми за обратна връзка, които се опитват да намалят вредните ефекти на цирозата в сърцето, да доведат до увеличаване на експресията на гена eNOS в късните фази на чернодробното заболяване.

Успоредно с това, в настоящото проучване се наблюдава, че цирозата води до бъбречни последици на хистологично и молекулярно ниво. Theбъбречнаефекти на BDL при възрастни плъхове са показани по-рано, с увреждане на бъбречната функция, отразено чрез повишаване на нивата на урея и креатинин, забелязани две седмици след индуцирането на холестаза, въпреки че няма хистологични промени вбъбречнапаренхим са отбелязани22. Интересното е, че в настоящото проучване, отбитите плъхове показват различен бъбречен отговор, с нормални серийни нива на урея и креатинин, въпреки хистологичните промени вбъбрек, което показва интензивно клетъчно импрегниране на билирубин, образуване на вътреклетъчни тапи, хидропична дегенерация, загуба на ядра и липса на граници на плазмената мембрана. Следователно изглежда, чебъбречна функциясе запазва при деца с цироза в сравнение с възрастни с цироза. В съответствие с тези открития, клиничната практика показва, че бъбречната дисфункция е по-честа и интензивна при възрастни с цироза, отколкото при деца23. Това е причината, поради която моделът на резултата в краен стадий на чернодробно заболяване (MELD), използван за класиране на възрастните, подходящи за чернодробна трансплантация, взема предвид серийните нива на креатинин, докато резултатът в краен стадий на чернодробно заболяване при деца (PELD) не взема предвид нивата на креатинин сметка24. Някои проучвания, използващи BDL модел на възрастен плъх, корелират оксидативния стрес и генерирането на свободни радикали с бъбречно увреждане, предизвикано от цироза25,26. По подобен начин в нашия модел се наблюдават промени в експресията на NOS ген в бъбреците. Общата експресия на NOS при BDL животни е по-висока, отколкото при контролите след две седмици и има тенденция да бъде по-висока, отколкото при контролите в другите времеви точки. Що се отнася до експресията на eNOS, тя е по-висока при всички експериментални животни в сравнение с контролите. Като се има предвид, че бъбречната активация на iNOS корелира сбъбречнадисфункция при възрастни плъхове, подложени на BDL27, е възможно да се заключи, че това повишено активиране на eNOS при млади животни е свързано с относително по-добротобъбречнатолерантност и към по-леките функционални последици в сравнение с възрастните. Както бе споменато по-горе, активирането на eNOS е свързано с благоприятни ефекти при други обстоятелства.

ИзводиДоказано е, че индуцираната от BDL цироза на черния дроб води до прогресивни хистологични и хистоморфометрични промени в сърцето ибъбрецина млади животни и това може да бъде добър модел за по-добро изясняване на цирозната нефропатия и кардиомиопатия при деца. Освен това, промените в експресията на гените NOS и eNOS в сърцето ибъбрекпредполагат, че NO играе важна роля в генезиса на миокардните и бъбречните последици от цирозата.