CD8 и CD4 Т клетъчни популации в човешки бъбреци

edmund.chen@wecistanche.com

Резюме:Предистория: На граничните места и във вътрешните органи Т-клетките на паметта, резидентни в тъканите (TRM), допринасят за имунната бариера срещу патогени като вируси, бактерии, гъбички и рак. Информацията за наличието и функцията на тези клетки в човешкия бъбрек обаче е оскъдна. За да разберем по-добре Т-клетъчно медиираната имунологична защита в този орган, ние имахме за цел да определим фенотипни и функционални аспекти на CD8 и CD4 Т клетки, присъстващи в здрави и алографтбъбрек тъкан. Методи: Използвайки многоканална цитометрия, ние оценихме фенотипа и функцията на Т клетките в проби от здрава бъбречна тъкан (n=5) ибъбрекалотрансплантирана тъкан (n=7) и сравнява тези аспекти с Т клетки в периферна кръв от здрави контроли (n=13). Резултати:Бъбректъканните проби съдържат значителни количества CD8 и CD4 Т клетки. За разлика от циркулиращите клетки,бъбрекТ клетките често експресират CD69 и CD103 и по-често циклизират активно. Освен това, почти всичкибъбрекТ клетките експресират CXCR3 и често експресират CXCR6 в сравнение с Т клетките в кръвообращението. подчертано,бъбрекТ клетките произвеждат по-големи количества IFN от циркулиращите клетки и често са полифункционални. Заключение: Функционални Т клетки с характерните черти на TRM се намират в човекабъбрекносни кърпи. Тези клетки са по-често активно циклични и често експресират CXCR3 и CXCR6.

Ключови думи:тъканно резидентни лимфоцити; Т-клетки; CD8; CD4; CD69; CD103; бъбрек; алографт

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНО/БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ

1. ВъведениеРезидентните Т клетки на паметта (TRM) продължават да съществуват в тъканите, за да осигурят дългосрочна локализирана защита срещу патогени. За разлика от рециркулиращите Т клетки, TRM популациите не могат да бъдат открити в периферната кръв и се различават значително от рециркулиращите Т клетъчни популации по отношение на техния фенотип, функция и метаболизъм [1]. Наистина, това не е изненадващо, като се има предвид фактът, че различни системи от органи, като белите дробове, са изложени на по-високи натоварвания от различни патогени, отколкото в случая с кръвообращението, което обикновено е изолирано от външния свят [2].Тъканното задържане на TkM продължава с години и се медиира от механизми, които включват оста на сфингозин-1-фосфатен рецептор1 (S1PR1)-сфингозин 1-фосфат (SP1). S1PR1 е рецептор, експресиран от Т клетки, който медиира егресията от вторични лимфоидни органи при свързване с биоактивната сигнална молекула SP1, която е важен медиатор на Т клетъчния трафик. Тази ос може да бъде прекъсната от CD69, свързан с мембраната c-тип лектин, който антагонизира експресията на S1PR1, като по този начин медиира задържането. Освен това, при мишки експресията на S1PR1 се индуцира от транскрипционния фактор Krüppel-подобен фактор 2 (KLF2), за който е установено, че е регулиран надолу в TRM, като по този начин също инхибира изхода на лимфоцити [3]. От своя страна е показано, че понижаването на KLF2 се медиира от хомолога на транскрипционния фактор на Blimpl в Т клетки (Hobit), който се експресира по TpM-специфичен начин в миши Т клетки [4]. Освен това, някои TRM също експресират CD103 (интегрин Е), при което TRM може да бъде идентифициран с помощта на CD69 и CD103 експресия [1].

Докато знанията за TRM фенотипа и функцията се увеличават за различни човешки тъкани, малко се знае за тези аспекти вбъбрек. Тук Т клетките са изложени на различен набор от патогени като бактерии, издигащи се от долните пикочни пътища и ренотропни вируси като полиомавирус BK (BKPyV). Наистина, наскоро описахме как човешките бъбреци съдържат подгрупа от Т клетки, експресиращи CD69 и/или CD103, сред които има CD8 Т клетки, специфично насочени към BKPyV протеините вирион протеин1 (VP1) и голям Т антиген (LTAG) протеин [5]. Ние и други също демонстрирахме наличието на CD69/CD103-експресиращи свързани с лигавицата инвариантни Т (MAIT) клетки вбъбректъкан [6,7].

За да разберем по-добре какъв вид Т клетки съставляват локализирания имунен отговор в този орган, използвахме многоканална поточна цитометрия, за да изследваме фенотипа и функцията набъбрекTRMs, изолирани от донорбъбрекматериал от реципиенти на бъбречна трансплантация (RTR) и от здравибъбректъкан в съседство с бъбречни светлоклетъчни карциноми, за да видите как тези популации се сравняват с Т клетъчните популации в кръвообращението.Намерихме този човекбъбректъканта съдържа значителни количества CD4 и CD8 Т клетки, експресиращи само CD69, CD69 и CD103, или нито един от тези маркери. Открихме, че CD69-CD103- клетки вбъбректъкан се различават съществено от Т клетките в кръвообращението и могат да представляват TRM популация, на която липсват каноничните TRM маркери. Освен това, ние показваме, че бъбречните Т клетки по-често циклизират активно, както се съди по повишената експресия на Ki-67, в сравнение с кръвта. Открихме също, че CD8 и CD4 Т клетките вбъбректъканта почти винаги експресира CXCR3 и често експресира CXCR6. Тези констатации предполагат ролята на тези хемокинови рецептори в привличането и поддържането на популации Т-клетки на паметта, резидентни в бъбреците.

2. Материали и методи

2.1. Пациенти и пробиПробите са получени от Biobank Renal Diseases на Амстердам UMC местоположение AMC. В тази Biobank проби от пациенти, като кръв ибъбректъкани, се събират и съхраняват от здравословен животбъбрекдонори и RTR, които се проследяват преди и след бъбречна трансплантация. Това проучване е проведено в съответствие с принципите, посочени в Декларациите от Хелзинки и Истанбул и всички участници са предоставили писмено информирано съгласие преди да се запишат в Biobank. Освен това, остатъчната тъкан от пациенти, претърпели туморна нефректомия (бъбречна тъкан, отдалечена от тумора), беше дарена от Отделението по патология и също се съхраняваше в Biobank. Тези тъкани са обработени анонимно съгласно Кодекса на поведение на Федерацията на холандските медицински научни дружества (Човешки тъкани и медицински изследвания: Кодекс на поведение за отговорна употреба, 2011 г. www.federa.org).

2.2. Мононуклеарни клетки на периферната кръв (PBMCs)Кръвни проби са получени от цитомегаловирус (CMV)-серонегативни здрави контроли (живибъбрекдонори преди операция, n= 13). Характеристиките на участниците в това проучване са показани в таблица 1. PBMCs бяха изолирани от кръв с натриев хепарин чрез центрофугиране в стандартен градиент на плътност и впоследствие криоконсервирани до деня на анализа.

2.3. Бъбречна тъканПроби от здрава бъбречна тъкан (n {{0}}) бяха получени от бъбреци, които бяха отстранени хирургично поради бъбречноклетъчен карцином (отдалечена нетуморна тъкан от контралатералния полюс на бъбрека) и трансплантирана бъбречна тъкан (n {{1 }}) е получен от експлантирани бъбречни алографти след неуспешна трансплантация. Тези проби се наричат ​​съответно здрави и проби от трансплантиран бъбрек. Резени от бъбречна кора се нарязват на 1- mm кубчета с McElwain Tissue Chopper (Ted Pella, Redding, CA, USA), прехвърлят се в 50 ml епруветки и се промиват със студен PBS, докато спре кръвта видимо присъстваше и супернатантата беше бистра. Добавя се предварително загрята (37 градуса) среда за смилане, 40 mL на 10 g тъкан (ДНКаза тип IV (50 KU/mL) (Sigma Aldrich, Zwiindrecht, Холандия), колагеназа тип IV (0,5 mg/mL) (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, САЩ), BSA (60 mg/mL) (Sigma Aldrich), 20 uL/mL фетален телешки серум (FCS, VWR International BV, Амстердам, Холандия), TRIS (0,025 M) (Merck BV, Амстердам, Холандия), пеницилин-стрептомицин (Biochrom GMBH, Берлин, Германия) в HBSS (Westburg BV, Leusden, Холандия)) и се инкубира в шейкър за 20 минути при 37 градуса. Топлата суспензия се прехвърля в C-тръба (Miltenvi, Bergisch Gladbach, Германия) и се подлага на програмата M_spleen_04.01 на GentleMacs (Miltenyi). Храносмилателната среда се дезактивира със студен PBS и получената клетъчна суспензия преминава през клетъчна цедка, за да се получи едноклетъчна суспензия, която се подлага на центрофугиране в стандартен градиент на плътност съгласно протокола на производителя (Lymphoprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, Осло, Норвегия ). Изолираните мононуклеарни клетки (бъбречни МНК) бяхакриоконсервирани до деня на анализа в IMDM, допълнен с 20 процента FCS, 000036 v/v процента -меркаптоетанол, 5 процента DMSO, пеницилин и стрептомицин.

2.4. Поточна цитометрияИзмерванията бяха извършени на LSRFortessa поточен цитометър (BD Biosciences). За всяка проба бяха анализирани 2×106 PBMCs или 0,5×106 до 10×106 бъбречни MNCs. Обемът на всяка реакция на оцветяване е относителен към броя на клетките и концентрациите на антителата остават постоянни. Клетките се инкубират с повърхностните антитела (допълнителна таблица S1) в продължение на 30 минути при 4 градуса на тъмно. Мъртвите клетки бяха изключени с помощта на фиксируемото багрило за жизнеспособност eFluor455UV (eBioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Моноклонални антитела с вътреклетъчни мишени (допълнителна таблица S1) бяха добавени след фиксирането и пермеабилизирането на клетките, като се използва наборът за оцветяване на FoxP3/транскрипционен фактор (eBioscience Inc.). Следват се публикуваните методи за поточна цитометрия и клетъчно сортиране за имунологични цели [8]. Стратегията за стробиране, използвана за фенотипния анализ, може да бъде намерена в допълнителна фигура S1. По-рано показахме, че нито един от анализираните маркери не е повлиян от метода на храносмилане, използван за изолиране на бъбречни МНК [7].

Ограниченията на тъканните проби доведоха до изключване на проби от панели за завеси. Броят на CD3 плюс клетките, анализиран за проба в здрави PBMCs, здрави бъбречни MNCs и TX бъбреци, може да се намери на фигура S3. Пробите на MNC са анализирани само когато съдържат над 50 процента живи клетки в рамките на лимфоцита, както е оценено чрез жизнеспособността две, а базираните на CD69/CD103 Т-клетъчни подгрупи се характеризират допълнително само ако техният общ брой клетки надвиши 50.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА НЕДОСТАТЪЧНОСТ

2.5. Тест за стимулиранеPBMC и бъбречните MNC бяха стимулирани, както е описано по-горе [7, 9]. PBMCs и бъбречни MNCs се размразяват в присъствието на DNAse I (200 KU/mL), промиват се и се оставят да се възстановят за една нощ в нетретирани, кръглодънни, 96-ямкови плаки (Corning) в културална среда (RPMI, допълнена с 10 процента FCS и пеницилин-стрептомицин) при концентрация от 20 × 106/mL （100 μL/ямка）.

На следващата сутрин бяха добавени форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA, 10 ng/mL; Sigma Aldrich) и йономицин (1 ug/mL; Sigma Aldrich) за стимулиране на клетките. Само средата беше добавена като отрицателна контрола. Всички инкубации се извършват в културална среда в присъствието на CD28 (клон 15E8; 2 ug/mL), CD29 (клон TS 2/16; 1 ug/mL), брефелдин А (10 ug/mL, Invitrogen) и GolgiStop ( BD Biosciences) в краен обем от 200 uL за 4 часа при 37 градуса и 5 процента CO2.

Впоследствие клетките се инкубират в продължение на 30 минути с повърхностните антитела (допълнителна таблица S2). Мъртвите клетки бяха изключени с помощта на фиксируемо багрило за жизнеспособност eFluor780 (bioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Моноклонални антитела за вътреклетъчно оцветяване (Таблица S1) бяха добавени след фиксиране и пермеабилизиране на клетките, като се използва комплектът реагенти Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences). Клетките се промиват два пъти и се анализират на LSRFortessa поточен цитометър. Стратегията за стробиране, използвана във функционалния анализ, може да бъде намерена в допълнителна фигура S2. За да се определи полифункционалността на всяка Т-клетъчна подгрупа, средният брой функции на всяка популация се изчислява по следната формула: ((процент клетки, произвеждащи 1 цитокин]*1) плюс ([процент клетки, произвеждащи 2 цитокина]*2) плюс ([процент клетки, произвеждащи 3 цитокини]*3) плюс ([процент клетки, произвеждащи 4 цитокини]*4) плюс ([процент клетки, произвеждащи всички 5 цитокини]*5))/100.

2.6.Анализ на данни

Данните бяха анализирани с помощта на FlowJo версия 10 (FlowJo, Ashland, OR, USA). Всички графики и фигури са създадени с помощта на Graphpad Prism версия 8.00 за Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Същата програма е използвана и за статистическия анализ на данните. Непараметричният тест Mann-Whitney-U беше използван за определяне на значимостта на несдвоени проби. За сравняване на сдвоени проби беше използван тестът за подписан ранг на Wilcoxon. p-стойности<0.05 were="" considered="" statistically="">

3. Резултати

3.1. Различна експресия на CD8 и/или CD4 и маркери за пребиваване на тъкани от Т клетки в здрава бъбречна тъканПърво, сравнихме експресията на CD4 и CD8 от CD3-положителни Т клетки в периферна кръв с клетки, открити в здрава бъбречна тъкан. CD4-CD8 плюс (CD8) Т клетки се откриват значително по-често в бъбречната тъкан, отколкото в кръвта ((средно) 25 процента спрямо 38 процента ) (Фигура la). За разлика от това, CD4*CD{{9} }(CD4)T клетките са открити с по-високи честоти в кръвта, отколкото в бъбречната тъкан ((70 процента срещу 52 процента) Фигура la). Като цяло, CD4 Т клетките се наблюдават по-често в здрава бъбречна тъкан, отколкото CD8 Т клетки (Фигура 1b).

След това изследвахме експресията на маркерите за пребиваване в тъканите, CD69 и CD103, в CD8 и CD4-дефинирани Т клетъчни подгрупи. Както се очаква, CD69 и CD103 на практика не се експресират от клетки в периферната кръв (Фигура 1в). В здрава тъкан фенотипите CD69-CD103-, CD69 плюс CD103-, CD69tCD103 плюс и CD69-CD103 плюс се изразяват с 46 процента, 45 процента, 6,6 процента и 1,8 процента от CD8T клетките, съответно 61 процента, 38 процента, 0,44 процента и 0,43 процента от CD4T клетките (Фигура lc). В заключение, CD8, но по-специално CD4 Т клетки, бяха открити в значителни количества в здрава човешка бъбречна тъкан. Освен това, експресията на CD69 и CD103, маркери за тъканно пребиваване, беше открита предимно сред Т клетките, открити в здрава тъкан, а не в кръвта.

3.2. Различни модели на експресия на общи маркери, определящи подмножество от Т клетки в здраве/от бъбречна тъкан

CD45RA, тирозин фосфатаза, CCR7, хемокинов рецептор, за който е известно, че медиира трафика на Т клетки към вторични лимфоидни органи, и CD28 и CD27, и двата костимулаторни рецептори, силно включени в активирането на Т клетките, са всички маркери, традиционно използвани за идентифициране на функционални Т клетъчни подгрупи J1{ {53}},1л. Искахме да проучим до каква степен разпределението на тези подгрупи в кръвта се различава от разпределението в бъбречната тъкан. Както се очакваше, най-големите подгрупи CD8 Т клетки, открити в кръвообращението (т.е. тези, отнасящи се до По-големи или равни на 5 процента от общата популация) бяха тези с CD45RA плюс CCR7 плюс CD28 плюс CD27 плюс (наивни Т клетки или TN, ( медиана) 13 процента), CD45RA-CCR7 плюс CD28 плюс CD27 плюс (T-клетки с централна памет или TcM, 6 процента), CD45RA-CCR7-CD28 плюс CD27 плюс (TEv1,30 процента), CD45RA-CCR7-CD28 плюс CD27-(Tau2,10 процента), CD45RA-CCR7-CD28-CD27*(TEy3,6 процента) , CD45RA-CCR7-CD28-CD27-(TM4,6 процента ) и CD45RA плюс CCR7-CD28-CD27-(TEMRA 10 процента) фенотип. В здрава тъкан почти никакви (0,6 процента) CD8 Т клетки не са открити с TN фенотип и само няколко (0,8 процента) показват Tax фенотип. Обратно, CD8 Т клетките, открити в здрава бъбречна тъкан, са съставени от значителни TEv1-(22 процента),TEM2-(12 процента), Tpx3-(18 процента),TEx{ {65}} (23 процента) и TEyRA (11 процента) Т клетъчни популации (Фигура ld и Фигура S4). Когато се разглеждат CD4 Т клетки в кръвта, най-големите популации са тези, експресиращи Ty-(35 процента), TcM-(25 процента), TEMl-(16 процента), TFM2-(9 процента) и популация с неуточнен по друг начин фенотип CD45RAtCCR7-CD28 плюс CD27* (0,4 процента) (Фигура 1d и Фигура S4). В здрава бъбречна тъкан малко CD4 Т клетки експресират TN- (3 процента) или TcM -(3 процента) фенотип. Вместо това, значителен брой клетки с TEM1-(22 процента), TEM2-(40 процента) или TEM4 (14 процента) фенотип бяха открити в здрава тъкан (Фигура ld и Фигура S4) . В заключение, разпределението на CD45RA/CCR7/CD28/CD{101}}дефинирани CD8 и CD4 Т клетъчни подгрупи се различава значително между кръвта и здравата бъбречна тъкан.

3.3. CD8 и CD4 Т-клетките в здравата човешка бъбречна тъкан по-често включват активно циклични клеткиСлед това проучихме дали има разлики в експресията на маркери, типични за профил на цитотоксичен ефектор-памет, между CD8 и CD4 Т клетъчни популации в кръвта и бъбречната тъкан. Първо, разгледахме експресията на T-box транскрипционните фактори T-bet и eomeso-dermin (Eomes). Тези транскрипционни регулатори са пряко включени в генерирането на острофазови ефекторни клетки, индуциращи експресията на молекули като интерферон-у и гранзим В, и в генерирането на вторични реакции на паметта. Както се очакваше, експресията на T-bet беше честа сред циркулаторните CD8 Т клетки (54 процента), докато циркулаторните CD4 Т клетки рядко експресираха този транскрипционен фактор (13 процента). Интересното е, че за CD4 Т клетки, T-bet експресията е значително по-висока сред Т клетките, открити в здрава бъбречна тъкан, отколкото в кръвообращението (53 процента срещу 13 процента). Известна експресия също се открива често сред циркулаторните CD8 Т клетки (59 процента), докато отново е рядка сред циркулаторните CD4 Т клетки (15 процента). Въпреки това, експресията на Eomes е по-честа сред CD4 Т клетките в бъбречната тъкан (32 процента), отколкото в кръвта (Фигура 2a, b).

След това изследвахме експресията на гранзим В, серинова протеаза, за която е известно, че медиира апоптозата след инжектиране в цитоплазмата от цитотоксични Т клетки. В съответствие с предишни доклади, експресията на T-bet и гранзим В беше открита в значителни количества в циркулиращи CD8 Т клетки (28 процента). Неговата експресия обаче е рядка сред циркулиращите CD4 Т клетки (1 процент), За CD8 Т клетки експресията на гранзим В е подобна в бъбречната тъкан и циркулиращите популации (28 процента и 23 процента) (Фигура 2в). Интересно е, че по-високите честоти на експресия на T-bet и Eomes, открити в бъбречни CD4 Т клетки, не съответстват на по-висока честота на експресия на гранзим В в това отделение (5 процента). След това разгледахме експресията на KLRG1, коинхибиторен рецептор, за който е известно, че се експресира предимно от цитотоксични ефекторни клетки с остра фаза и клетки с ефекторна памет. KLRG1 се експресира често от циркулиращи CD8 Т клетки (54 процента), но не и от CD4 Т клетки ( 10 процента). Не са открити разлики между анатомичните отделения в експресията на KLRG1l за CD8 или CD4 Т клетки. И накрая, изследвахме израза на Ki -67, маркер, обозначаващ активно циклични клетки. В съответствие с предишни наблюдения, експресията на Ki-67 сред циркулиращите CD8 и CD4 Т клетки е рядка (съответно 1% и 2%). Интересното е, че сред CD8 Т клетките, но особено сред CD4 Т клетките, експресията на Ki-67 се открива значително по-често в Т клетките в бъбречната тъкан (съответно 3 процента и 11 процента) (Фигура 2е). В заключение, CD4 Т клетки бяха открити в здрава човешка бъбречна тъкан, но не и CD8 Т клетки в това отделение, по-често експресирани T-bet и Homes. Това обаче не се превърна в по-честа експресия на гранзим В от бъбречни CD4 Т клетки. Освен това, въпреки че общият брой на цикличните клетки е нисък, бъбречната тъкан съдържа значително по-активно циклични CD8 и CD4 Т клетки, отколкото циркулацията.

3.4. CD8 и CD4 Т клетки в здрава бъбречна тъкан са почти всички CXCR3-позицияСлед това потърсихме разлики в експресията на други маркери, типични в циркулиращите популации на не непосредствено цитотоксични клетки на паметта, както беше показано по-рано за циркулиращи Т клетъчни популации. Първо разгледахме експресията на IL-7R, експресирана предимно върху наивни и рано диференцирани клетки на паметта в кръвообращението, където участва в поддържането на хомеостатична пролиферация [10,12,13]. В периферната кръв IL-7Ra се експресира често от CD8 Т клетки (84 процента) и CD4 Т клетки (98 процента). CD8 и CD4 Т клетките в здрава бъбречна тъкан експресират този маркер значително по-рядко от циркулиращите Т клетки (съответно 71 процента и 76 процента) (Фигура 2f).

След това изследвахме експресията на различни други хемокинови рецептори. Интересното е, че CXCR3, хемокинов рецептор, участващ в трафика на Т-клетки към възпалени тъкани [14-17], се експресира от изключително голям брой CD8 и CD4 Т клетки в бъбречна тъкан (99 процента и 91 процента, съответно) и значително по-рядко от циркулиращи Т клетки (съответно 58 процента и 26 процента) (Фигура 2g). И накрая, ние определихме експресията на CXCR6, за която е известно, че е замесена във формирането на TRM популации [18-22]. Докато CXCR6 се експресира само от малка популация от циркулиращи CD8 Т клетки (16 процента), а на практика не от циркулиращи CD4 Т клетки. значително по-голям дял от CD8 и CD4 Т-клетки в бъбречната тъкан експресират тази молекула (съответно 40 процента и 40 процента) (Фигура 2h). В заключение, маркерите, обикновено свързани с не веднага диференцирано състояние в кръвообращението, вероятно -7Ra, CCR7, CD28 и CD27, са значително по-рядко експресирани от бъбречни CD8 и Т клетки в сравнение с тези в кръвта. контрастно, бъбречните Т клетки по-често експресират CXCR6 и почти винаги експресират CXCR3.

3.5. Разликите във фенотипа между здрави бъбречни и алотрансплантирани Т клетки са минималниСлед това искахме да проучим дали тези находки остават в тъкан от трансплантирани бъбречни алографти, които са получени за различни клинични показания (Таблица 1).По отношение на броя на CD8 и CD4 Т клетките в здрава и алографтна тъкан не са наблюдавани разлики (Фигура 3а). Въпреки това, забелязахме незначителна тенденция към повече CD4T клетки и по-малко CD8T клетки в здрава тъкан, отколкото в алографтна тъкан (Фигура 3b). Освен това, когато разглеждаме експресията на CD69/CD103 и CD45RA/CCR7/CD28/CD27-дефинирани подгрупи, няма разлики в разпределението на CD69/CD103- или CD45RA/CCR7/CD28/CD27- бяха отбелязани дефинирани подгрупи, независимо от CD8/CD4 фенотипа (Фигура 3d и Фигура S5). Когато изследвахме честотите на експресия на маркерите, по-типични за цитотоксични циркулиращи Т клетки, не открихме разлики в експресията на T-bet, KLRG1 или гранзим B между здрави бъбречни или алографтни Т клетки (Фигура 3a, gh). Ние открихме, че експресията на Eomes се наблюдава по-рядко в CD4 Т клетките на алографтната тъкан, отколкото в здравите тъканни Т клетки (Фигура 3f). Не са наблюдавани разлики в експресията на другите маркери. (Фигура 3-l и Фигура S5b-d). В заключение, освен по-ниската честота на експресия на Eomes сред алотрансплантирани CD4 Т клетки, клетъчните популации не се различават между изследваните популации.

3.6. CD69-CD103-T клетките в бъбречната тъкан са различни от циркулиращите клеткиКато се има предвид сходният фенотипен състав на CD8 и CD4 Т клетките, открити в здрава бъбречна тъкан и в тъкан на бъбречен алографт, ние обединихме данни от двете проучвателни групи, за да проучим допълнително характеристиките на тези клетки според CD69 и CD103 експресията. Тъй като CD69-CD103 плюс клетки винаги се откриват при много ниски честоти (<50 events),="" we="" excluded="" these="" cells="" from="" further="" analyses.="">Първо, ние изследвахме разликите в тези подгрупи според ко-експресията на CD69/CD103 в бъбречните Т-клетъчни популации (Фигура 4 и Фигура S6). Интересното е, че както за CD8, така и за CD4 Т клетките бяха отбелязани съществени разлики в разпределението на CD45RA/CCR7/CD28/CD27-дефинирани подгрупи сред CD69-CD103-,CD69 плюс CD{ {14}}и CD69*CD103* подгрупи. За CD8 Т клетките, CD69-CD103-клетките съдържат значителна популация от TeyRA клетки (21 процента), която е много по-малка сред подгрупите CD69 плюс CD103- и CD69 плюс CD103 (5,8 процента и 2,2 процента, съответно). Вместо това, тези последни популации съдържат много по-големи TEy3 (съответно 13 процента, 30 процента и 32 процента) и TEy4 (съответно 8 процента, 19 процента и 33 процента) субпопулации. За CD4 Т клетки са наблюдавани няколко TEyRA клетки сред CD69-CD103-, CD69*CD103- и CD69 плюс CD103* подгрупи (2,6 процента, 0 процента и 1,7 процента, съответно). Вместо това тези клетки съдържат големи субпопулации от TFw1 (26 процента, 24 процента и 10 процента, съответно) и TEy2 ells (съответно 30 процента, 46 процента и 27 процента). Сред CD69 плюс CD103-и по-специално сред CD69*CD103*клетките се наблюдава много по-голяма TEM4 субпопулация (съответно 6 процента, 11 процента и 34 процента).

Предвид тези различия и предишното наблюдение, че бъбречните Т-клетъчни популации едва се състоят от TN и TcM клетки, ние допълнително изследвахме CD69-CD103-клетките, открити в бъбречната тъкан, за да определим до каква степен тези клетки са не само циркулиращите клетки, преминаващи през кръвообращението на бъбреците. За да направим това, сравнихме тези клетки с циркулиращи клетки. CD69-CD103~клетките в бъбречната тъкан се различават значително от тези в кръвообращението: T-bet, Ki-67 и CXCR3 се експресират по-често от бъбречни Т клетки, независимо от CD8/CD4 фенотипа (Фигура 5а-в). Обратно, IL-7R, CCR7, CD28 и CD27 се експресират значително по-рядко от CD69-CD103- бъбречни Т-клетки, независимо от CD8/CD4 фенотипа (Фигура 5d- g). CD69-CD103-CD4 Т клетките в бъбречната тъкан експресират KLRG1 значително по-често, отколкото в кръвта и CD69-CD103-CD8 Т клетките в бъбречната тъкан експресират Eomes значително по-често от в кръвта.

След това искахме да видим как коекспресията на CD69 и CD103 повлиява маркерите на функционалния потенциал. Първо, разгледахме маркери, свързани с цитотоксичен потенциал. Въпреки че бяха отбелязани разлики между отделните субпопулации, не бяха наблюдавани последващи модели за T-bet и Eomes в CD8 Т клетки, когато CD69 или CD103 бяха коекспресирани (Фигура 6a, b). За разлика от това, в CD4 Т клетките тези транскрипционни фактори се увеличиха заедно с Коекспресия на CD69 и CD103 (Фигура 6a, b). Когато разглеждахме KLRG1, забелязахме, че за CD8 Т клетки, експресията на KLRG1 намалява заедно с коекспресията на CD69/CD103. За CD4 Т клетки се наблюдава подобна тенденция. Въпреки това, тук само CD69-CD103-клетки експресират KLRG1 с по-висока честота от CD69 плюс CD103- и CD69 плюс CD103* клетки (Фигура 6в). Честотите на експресия на гранзим B също намаляват заедно с маркерите за пребиваване в тъканите, като неговата честота на експресия е най-ниска сред CD69 плюс CD103* клетки, както в CD8, така и в CD4 Т клетки (Фигура 6d). Експресията на Ki-67, която е по-висока сред бъбречните Т клетки в сравнение с Т клетките в кръвта, не се различава според коекспресията на CD69 или CD103 (Фигура 6е).

След това изследвахме маркери, обикновено свързани с нецитотоксичен профил на паметта според коекспресията на CD69/CD103. Експресията на IL-7Ra, CCR7 и CD28 е най-висока в CD69-CD103- популациите, с тенденция в дефинирането на експресията заедно с коекспресията на CD69/CD103 (Фигура 6f-h ). След това разгледахме експресията на CXCR3 и CXCR6. И двата хемокинови рецептора най-често се експресират от CD69tCD103t клетки, независимо от CD8/CD4 фенотипа, и показват възходяща тенденция с коекспресия на CD69/CD103. Само за CXCR6, тази тенденция е статистически значима, засягайки както CD8, така и CD4 разказва (Фигура 6j,k). В заключение, CD69-CD103- клетките в бъбречната тъкан се различават съществено от клетките в кръвообращението и може да засягат друга TBv популация, която не е белязана от CD69 или CD103 експресия. Единственият маркер, който се различава последователно, независимо от CD8/CD4 фенотипа, по отношение на коекспресията на CD69 и CD103, беше CXCR6.

3.7.Т-клетките в бъбречната тъкан По-често произвеждат интерферон, отколкото Т-клетките в кръвтаИ накрая, ние изследвахме капацитета за производство на цитокини чрез CD8/CD4-дефинирани Т клетъчни популации в бъбречна тъкан. Първо, сравнихме производството на интерферон-у (IFNy), фактор на туморна некроза (TNF), интерлевкин-2 (IL-2), фактор, стимулиращ колониите на гранулоцити-макрофаги (GM-CSF) и IL-17 чрез стимулирани CD8/CD4-дефинирани Т клетъчни популации, открити в кръвта, към тези в здрава бъбречна тъкан (Фигура 7a-e). Интересно е, че само IFNy се експресира последователно от по-голям дял Т клетки в здрава бъбречна тъкан, в сравнение с Т клетките в кръвта, независимо от CD8/CD4 фенотипа (Фигура 7а). Разликите бяха забелязани и на ниво индивидуално подмножество. По-конкретно, TNF и GM-CSF се произвеждат по-често от CD4 Т клетки в бъбречна тъкан (Фигура 7b.c). По отношение на полифункционалността (т.е. броя на едновременно произведените цитокини), беше установено, че CD4 Т клетките в бъбречната тъкан са по-полифункционални от CD4 клетките в кръвта (Фигура 7f).

След това разгледахме разликите в капацитета за производство на цитокини между стимулирани Т клетки от здрава и алографтна тъкан. Не са открити разлики в производството на отделни цитокини или в редица едновременно произведени цитокини между Т клетки от здрава или алотрансплантирана бъбречна тъкан (Фигура S7). Тъй като CD69 се експресира при стимулиране на Т клетки, ние изследвахме само разликата между CD103-отрицателни и CD103-експресиращи CD4 и CD8 Т клетки (Фигура 7g-). Когато сравнявахме CD4 и CD8 Т клетки, експресиращи CD103 с клетки, които не експресират CD103 в бъбречна тъкан, забелязахме, че CD8 и CD4 CD103 клетки експресират повече IFNy отколкото CD103-клетки (Фигура 7g). Освен това, въпреки че IL-1ZA-продуциращите клетки са с нисък брой сред CD103 плюс CD8 и CD4 Т клетките в бъбречната тъкан, те постоянно се откриват по-често в тази популация в сравнение с популацията на CD103-. В заключение, повече Т' клетки в бъбречната тъкан произвеждат IFNy в сравнение с циркулиращите Т клетки, независимо от CD8/CD4 фенотипа. Наистина, най-високият процент на IFNy-продуциращи клетки е открит сред CD103-експресиращите CD4 и CD8 бъбречни Т-клетки. В допълнение, Т клетките в бъбречните алографти не се различават от тези в здравата бъбречна тъкан по отношение на тези параметри.

4. Обсъждане

В настоящото проучване се обърнахме към разнообразието от Т-клетъчни подгрупи, според експресията на CD8 и CD4, и маркерите за тъканно пребиваване, CD69 и CD103, в човешки бъбреци и в сравнение с тези с кръвта. Значителен брой CD8 и CD4 Т клетки наистина бяха открити в бъбречната тъкан. Освен това, тези Т клетки в бъбреците съдържат значителен брой CD69*CD103-клетки. CD69 плюс CD103 плюс клетки също бяха открити, но предимно сред CD8 Т клетките и на практика не съществуваха сред CD4 Т клетките. Подобна находка засягаше TRM на белите дробове по-рано [23]. Както се очакваше, такива CD69 и CD103-експресиращи популации вместо това почти липсваха в циркулацията. Поразителна разлика при сравняване на Т-клетките в бъбрека с тези в кръвта се отнася до ясното разпределение на традиционните CD45RA/CCR7/CD28/CD27-дефинирани подгрупи. Интересно е, че експресията на CD28 по-често не се експресира, когато Т клетките коекспресират CD69 самостоятелно или в комбинация с CD103. Теоретично това би трябвало да направи тези популации по-малко податливи на костимулиращи сигнали от CD80 и CD86. Други разлики се отнасят до по-висока честота на експресия на CXCR3, CXCR6 и Ki-67. Освен това, бъбречните Т клетки по-често съдържат IFNy-продуциращи клетки и често са полифункционални. Наистина, в бъбреците CD103 плюс Tpys съдържат повече клетки, произвеждащи IFN, отколкото техните CD103-отрицателни двойници. В допълнение, CD103T клетките по-често произвеждат IL-17, въпреки че това се отнася до скромна популация.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНА/БЪБРЕЧНА ИНФЕКЦИЯ

По отношение на по-честата експресия на CXCR3 от CD8 и CD4 бъбречни Т клетки, по-рано беше показано, че оста CXCR3/CXCL10 участва в оформянето на TpM популациите в кожата, черния дроб и лимфоидната тъкан [24-28]. Освен това той участва в трафика към стресирания епител и възпалението в общ смисъл [14-17]. Като се имат предвид високите честоти на CXCR3 сред тези Т клетки в здрава бъбречна тъкан, изглежда, че CXCR3 е замесен в TRM хомеостазата и в бъбречната тъкан и може да не включва непременно възпаление или сигнали за опасност за това. По отношение на CXCR6, оста CXCR6/CXCL16 наистина вече е доказано, че е от съществено значение за трафика на Tpst към различни отделения като белите дробове, кожата, черния дроб и мозъка и може да се отнася до универсален механизъм, който е от съществено значение за насочване и задържане на TRM към и в тъкани, също по отношение на TRM в човешка бъбречна тъкан [18-22].

Farber и колегите подробно са характеризирали и сравнявали CD8 и CD4 TRM популации, живеещи в различни видове човешки тъкани, получени от донори на органи. Те описаха как популациите на TRM в белите дробове, далака, тънките черва и различни вторични лимфоидни тъкани се различават по отношение на транскриптома, но също и по отношение на експресията на различни протеини, включително цитокини, изследвани в настоящото проучване [29-31. Тези изследвания обаче не включват TRM популации в човешкия бъбрек и данни за това

темата е оскъдна. По-рано показахме, че CD8 Т клетки, насочени към полиомавирусни BK VP1 и LTAG протеини, произлизащи от вирус, който има силен тропизъм за бъбречни епителни клетки, се откриват в алографтни бъбреци. Тези специфични за вируса Т-клетки експресират CD69 и CD103 в по-голям брой от техните двойници, открити в кръвообращението на същите пациенти. Освен това, тези Т клетки обикновено експресират CD45RA-CD27-granzyme B-отрицателен фенотип[5]. По-късно други също съобщават за TRM популации в човешка бъбречна тъкан, получена от нефректомия при трансплантация. В тази публикация авторите съобщават, че Т клетките в тези тъкани се отнасят главно до CD8 Т клетки [321. Вместо това открихме, че CD4 Т клетките, всъщност, съставляват най-голямата подгрупа от Т клетки. Въпреки това, ние също открихме, че балансът се измества, макар и не значително, към по-голям брой CD8 Т клетки в алографтна тъкан в сравнение със здравата бъбречна тъкан. Като такова, това несъответствие може да бъде обяснено от различна проучвателна група и може да се окаже, че при здравето имунологичната защита е по-фокусирана върху извънклетъчни заплахи, като бактерии, спрямо повече вътреклетъчни заплахи, като вируси и рак при имунокомпрометирани гостоприемници. Не открихме други разлики в изследваните маркери, между здрави бъбречни и алографтни Т клетки. Въпреки това трябва да се използват по-нататъшни изследвания, използващи техники с по-широк поглед върху транскриптомите, като секвениране на РНК, или протеоми, като масспектрометрия, за да се установи дали това наистина е така.

В допълнение, de Leur et al. описват как TRM в бъбреците често експресира гранзим B, докато ние открихме само малки количества гранзим B както в здрава, така и в алографтна бъбречна тъкан [32]. Въпреки това, ние открихме значителни T-bet и Eomes-експресиращи Т клетки в бъбречната тъкан, което в циркулиращите Т клетъчни популации обикновено наистина се свързва с по-висока експресия на гранзим В [10]. Въпреки че последното може да не е изненадващо, предвид факта, че експресията на гранзим B също е директно индуцирана от T-bet [33,34], тази връзка не е очевидна сред бъбречните Т клетки в настоящото проучване. Както ние и други показахме, че TRM, произхождащи от човешки бели дробове, мозък и кожа [25,26,3536], както и резидентните тъкани MAIT ælls 【6,7】, получени от бъбреците, са с ниско съдържание на гранзим B съдържание, въпреки че често изразява значителни количества T-bet и Eomes, това може да е обща черта на (човешки) TkM. Освен това, в белодробна TRM експресията на гранзим B се наблюдава бързо при стимулиране [35l, което предполага, че това може да се случи и в други TeM. Тук авторите предположиха, че такава „скрита цитотоксичност служи за защита на структурната цялост на тъканите от увреждане от цитотоксични Т клетки.

В заключение, ние показваме, че Т-клетки в бъбречната тъкан присъстват в значителни количества и включват популации, които често експресират CD69 плюс и CD103 плюс, молекули, чрез които Т клетките се прилепват към и персистират в тъканите. Независимо от това, CD69-CD103- Т клетките в бъбречната тъкан изглежда се различават от циркулиращите Т клетки и може да засягат друга отделна TiM популация, вероятно персистираща в бъбреците чрез други механизми, които предстои да бъдат разкрити. Друг вариант може да бъде, че тези CD69-CD103-T клетки се отнасят до популация, която наскоро е излязла от кръвообращението и е придобила само временно нови фенотипни черти поради взаимодействие с бъбречната микросреда. Необходими са допълнителни изследвания на тази популация, за да се изяснят тези възможности. Освен това. CD8 и CD4 бъбречните Т клетки често са били активно циклични и по-често експресират CXCR6. Освен това, популациите CD8 и CD4 изместиха особено висока експресия на CXCR3, силно замесвайки тези хемокинови рецептори, както и CXCR6 в натрупването и персистирането на TRM в човешки бъбреци. Следователно са необходими допълнителни изследвания, за да се подобри нашия образ на Tpv популациите в човешкия бъбрек. Независимо от това, откритията, представени тук, формират солидна първа стъпка към по-подробно характеризиране на Т клетъчните популации в бъбречната тъкан и тяхната роля за здравето и болестите.