Глава 5 Промени в ензимната активност по време на ензимната ферментация

Глава 5 Промени в ензимната активност по време на ензимната ферментация

 

Протеаза, липаза исупероксид дисмутаза (SOD)са основните функционални ензими наМикробни ензимни здравословни храни. Сред тях,протеазаиграе роля вНасърчаване на хидролизата на протеина в хранатав човешкото тяло. В допълнение, той може също да разложи някои умиращи клетки, да премахне мръсотията върху повърхността на кожата и порите и да играе роля в ексфолиацията, така че се използва широко в продуктите за баня. Липазата действа върху естерната връзка между мастните киселини и глицерола, а субстратът на хидролиза обикновено е естествени масла. Следователно, той се наблюдава в много храни за отслабване и здравни продукти. Много жени са изключително загрижени по темата за отслабването, поради което ензимите бързо стават популярни по целия свят.Ензимите са богати на липаза, което означава, че те имат висока стойност на изследванията и перспективи за приложение.Копкае специален метален ензим, който катализира реакцията на дисмутация наСупероксидни анионни радикали, по този начинПремахване на супероксидни анионни радикалив тялото. Той е защитна бариера за организмите, така че се използва широко в медицинската област.
Тази глава приема Apple ензим като пример. Като се започне от началния етап на ферментация,Дейности на супероксид дисмутаза, амилаза, липаза, протеаза и целулаза в експерименталната група и контролната група се измерват на всеки 15 дни за цялостно и систематично отразяват променящата се тенденция на ензимната активност по време на целия процес на ферментация.

Нови билки Cistanche

Щракнете, за да получите повече подробности

 

Подкрепяща услуга на Wecistanche-най-големият износител на Cistanche в Китай:
Имейл: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/тел: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 Материали и методи

5.1.1 Материали

(1) Експериментални материали

Измийте пресни ябълки със стерилна вода при стерилни условия, изсушете ги естествено на стерилна операционна маса, обелете ги и ги нарежете за по -късна употреба. Добавете бялата захар и ябълките към стерилизиран стъклен буркан при масово съотношение 1: 1. Активирайте бактериите, необходими за експеримента и ги инокулирайте в ензима според оптималната схема (този етап на работа е пропуснат за контролната група), запечатайте я и я поставете на хладно и сухо място. След 3 месеца ферментация на стайна температура, вземете проба, за да получите цялата ензимна течност, съдържаща пулпата и я филтрирайте. Вземете супернатантата като експериментална проба. След като пробата се центрофугира при 10, 000 rpm за 15 минути във високоскоростна центрофуга, тя се използва за измерване на съответните данни. Заслужава да се отбележи, че в процеса на изработване на ензими, за да се избегне ненужно замърсяване, всички наши операции бяха проведени при стерилни условия.

(2) Основни инструменти
Инструментите, необходими за експеримента, са същите като 3.1.1 (2).

 

5.1.2 Методи

(1) Определяне на активността на супероксид дисмутаза (SOD) [66]
Разтворът на пирогалол е предварително загрял във водна баня с постоянна температура от 25 градуса за определен период от време. Съгласно таблица 5.1, към епруветката са добавени подходящо количество буфер, дестилирана вода и същия обем на разтвора на солна киселина или пирогалол. Водната баня с постоянна температура беше настроена на 25 градуса за 2 0 мин. След като смесената течност бързо се разклаща, тя веднага се инжектира в кюветата. Стойността на абсорбцията A0 на пробата се измерва на всеки 30 секунди при дължина на вълната 325Nm с помощта на спектрофотометър.

Tab.5.1 Добавете количеството на съседния бензен три фенолни реагенти за определяне на скоростта на автокисляване

 

Методът за определяне на активността на SOD е основно същият като горната операция. Единствената разлика е, че преди да добавите пирогалол, {{0}}. 5 ml ензимна проба разтвор на различни концентрации трябва да се добави първо. В същото време се добавя същия обем на дестилирана вода. Измерената абсорбция е ASOD. The inhibition rate and SOD enzyme activity are calculated according to formula 5.1 and formula 5.2: Inhibition rate (%)=(△A0-△ASOD)/△A0×100 (5.1) Enzyme activity (U/mL)=inhibition rate/50% × V1/V2×n (5.2) Къде: V1 е общият обем на разтвора, ml; V2 е обемът на разтвора на ензимната проба, ML; △ A0 е скоростта на авто-окисляване на пирогалол; △ ASOD е скоростта на промяна на стойността на абсорбцията на пробата; N е разреждането множествено (2) определяне на активността на амилазата Това проучване използва колориметричния метод на йод-нишета, за да определи активността на амилазата. Специфичните етапи на експлоатация се отнасят до „Националната процедура за клинична лаборатория“ [67]. Той е разделен главно на следните две точки:

 

① Подготовка на разтвора
Буфериран скотестен разтвор ({{0}}. 4G/L): точно тежи 9 г натриев хлорид, 22,6 г безводен дискозиев водороден фосфат и 12,5 г. разтворът кипи; Точно претегляйте 0,4 g разтворимо нишесте, разтворете го в 10ml дестилирана вода, смесете равномерно и се приспособявайте към паста; Инжектирайте разтвора на нишестета, регулиран към паста в горния разтвор на кипяне, и измийте чашата многократно, докато нишестето се прехвърля напълно в разтвора на врящата вода. След като разбърквате равномерно със стъклен прът, охладете до стайна температура, добавете 5ml 37% разтвор на формалдехид на коса и разредете до 1L с дестилирана вода. Стойността на pH на разтвора е 7,0 ± 0,1 и се поставя в хладилника за употреба.
Йоден запасен разтвор (0. 1 mol/L): точно тегло 1,7835g калиев йод и 22,5 g калиев йодид в чист 500ml
Чаша, бавно и равномерно добавете 4,5 ml концентрирана солна киселина, разбърквайки непрекъснато по време на процеса на добавяне, разреждайте се към скалата с дестилирана вода и разбъркайте равномерно. Поставете го в хладилника за употреба и го съхранявайте в бутилка с кафяв реагент.
Разтвор на йод на прилагане ({{0}}. 01mol/L): Вземете определено количество разтвор на йод (0,1 mol/L), разредете го 10 пъти с дестилирана вода, поставете го в хладилника за употреба и го съхранявайте до 1 месец.

② Експериментални стъпки за работа
Вземете ензимния разтвор и го разредете 10 пъти с физиологичен физиологичен разтвор и работете съгласно таблица 5.2. Смесете добре, дължината на вълната на спектрофототъра е 660 nm, а светлинният път на колориметричната чаша е 10 мм. Нула с дестилирана вода и прочетете абсорбцията на всяка тръба. Изчислете активността на амилазата въз основа на основната формула на изчисление 5.3.

 

Tab.5.2 Стъпки за работа на определяне на амилазата

 

(3) Определяне на липазната активност

Методът за определяне се провежда в съответствие с QB/T {{0}} [68]. 2% ензимен тестов разтвор се приготвя с 0. 0 25 mol/L фосфатен буфер (рН 7.5), фенолфталеинът се използва като индикатор и мастните киселини се титруват със стандартен разтвор на натриев хидроксид. Активността на липазата се изчислява въз основа на обема на натриевия хидроксид, консумиран в експеримента. Правилото е: при рН 7,5 и температура на околната среда от 40 градуса, 1 ml течен ензимен разтвор хидролизира липаза за 1 min, за да се получи 1 μmol мастна киселина, която е една липазна активност, изразена като U/mL. Then, the lipase activity was calculated according to formula 5.4: enzyme activity (U/mL)=(BA) × c/0.05 × 50 × 1/15 × n=200/3 × (BA) × c × n (5.4) Where: B is the volume of sodium hydroxide standard solution consumed, mL; A е обемът на стандартен разтвор на натриев хидроксид, консумиран в празната контролна група, ML; С е концентрацията на стандартен разтвор на натриев хидроксид, Mol/L; 0.05 е коефициентът на конверсия на концентрацията на стандартния разтвор на натриев хидроксид; 50 е съдържанието на мастни киселини в разтвора на натриев хидроксид; 15 мин е времето за реакция; n е разреждането множествено.

(4) Определяне на протеазна активност

Вижте GB/T 23527-2009 [69] с леки модификации.
① Подготовка на стандартната крива
Вземете 1ml тирозин стандартен разтвор с различни концентрации на маса, които са 0, 1 0, 20, 30, 40 и 50 mg/L и добавете 5ml 0,4Mol/L разтвор на натриев карбонат и 1ml разтвор на фолинов реагент към него. Реагирайте в продължение на 20 минути при температура 40 градуса. След приключване на реакцията, отстранете реакционния разтвор и измерете стойността на абсорбцията на разтвора при дължина на вълната 680 nm, като използвате спектрофотометър. Начертайте стандартна крива на тирозин с концентрация на тирозин като хоризонтална ос и стойност на абсорбцията като вертикална ос.

Нови билки Cistanche със силна антиоксидантна сила

② Определяне на протеазна активност
Експериментална група: Вземете 1ml разтвор на казеин с концентрация 10 g/L и го смесете равномерно с 1ml от разтвора на пробата, който трябва да бъде тестван, и реагирайте за 10 минути при околна температура от 40 градуса; Филтрирайте и получете филтрата след изправяне, приемайте 1ml от филтрата, 5ml разтвор на натриев карбонат и 1ml фолинов реагент, смесете равномерно и реагирайте в продължение на 20 минути при температура на околната среда от 40 градуса; Използвайте спектрофотометър, за да измервате стойността на абсорбцията на разтвора при дължина на вълната 680 nm.
Празна контролна група: Вземете 1ml от разтвора на пробата, който трябва да бъде тестван, добавете трихлороцетна киселина, реагирайте напълно, за да инактивирате протеазата, а други методи на работа са същите като експерименталната група.

Изчислете протеазната активност съгласно Формула 5.5:
Протеазна активност (u/ml)=ak × 4/10 (5.5), където: a е абсорбцията на ензимния разтвор в експерименталната група; K е количеството тирозин, когато абсорбцията е равно на 1; 4 е общият обем на реакционния разтвор, ML; 10 е времето за реакция, мин.

(5) Определяне на целулазната активност [70]

Активността на целулазата в ензимите обикновено се изразява от количеството на глюкозата, освободено от определено количество ензимен разтвор за единица време. Принципът за използване на метода на филтърната хартия за измерване на целулазната активност е, че целулазата може да разгради целулозата във филтърната хартия за получаване на вторични метаболити като глюкоза, а глюкозата може да реагира с 3, 5- динитросалицилова киселина, за да образува жълт комплекс. Цветът на тази реакция е сравнително ярък, който може да определи количеството на глюкозата и други произведени редуциращи захари.

 

①3, 5- Колориметрично средство за динитросалицилова киселина
Accurately weigh 10g of 3,5-Dinitrosalicylic acid with a melting point of 168-169 degree , dissolve it with distilled water, add 20g of sodium hydroxide and 200g of potassium sodium tartrate, continue heating until the solid is completely dissolved, dilute to 500mL with distilled water, add 2g of redistilled phenol and 0,5 g безводен натриев сулфит, разбърквайте непрекъснато по време на процеса на добавяне, докато се разтвори напълно, спрете да се нагрявате, след като се смесват равномерно, охладете до стайна температура, прехвърлете всички в обемна колба от 1000ml, филтрирайте се, раздвижете се от супернатантата и съхранявайте в кафява бутилка.②enzymatic хидролиза
Точно пипета {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1.5, 2.0ml разтвор на ензимна проба в 2ml оцетен буферен разтвор на оцетна киселина-ацетат с рН стойност 4,5. След 5 минути водна баня с постоянна температура на 40 градуса, добавете 6 парчета хартия за филтър за хроматография с площ съответно 1 × 1 cm2 и веднага започнете времето, за да направите времето за реакция точно до 60 минути. Веднага се прехвърлете във вряща водна баня за реакция в продължение на 10 минути и целулазата губи своята активност.

 

 

③ цветна реакция
Вземете разтвора на ензимната проба, добавете 3ML от 3, 5- колориметричен агент на динитросалицилова киселина, приготвен в ①, загрейте във вряща водна баня в продължение на 15 минути, извадете, охладете на стайна температура, добавете 10 ml дестилирана вода, смесете равномерно, използвайте спектрофотометър при дължина на вълната от 550NM, регулирайте празна контролна група в нула и измервайте неговата абсорбация.
④ Рисуване на стандартна крива на глюкоза
Пригответе точно стандартен разтвор на глюкоза с концентрация от 1 mg/ml и използвайте дестилирана вода, за да направите стандартен разтвор на глюкоза с обем 0, 0. 2, 0. 4, 0. 6, {0. 3ML от 3, 5- колориметричен агент на динитросалицилова киселина, приготвен в ① за извършване на реакция на развитие на цветовете. Начертайте стандартната крива с концентрация на глюкоза като хоризонтална ос и абсорбция като вертикална ос.
⑤Колкулация
Използвайте стойността на абсорбцията A след развитие на цвета с ензимен разтвор и след това изчислете количеството на освобождаване на глюкоза m според стандартната крива на глюкозата и изчислете според формула 5.6:
Целулазна активност (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6), където: m е количеството на освобождаване на глюкоза, UG; T е ензимното време на хидролиза, min; M е съдържанието на ензима в реакцията, UG/mL.