Глава 1: Krϋppel-подобен фактор 15 потиска бъбречната гломерулна мезангиална клетъчна пролиферация чрез подобряване на P53 SUMO1 конюгацията
May 12, 2022
За повече информация. контактtina.xiang@wecistanche.com
Резюме
Мезангиална клетка (MC)пролиферацияе ключова патологична характеристика при редица обикновени хорабъбречни заболяваниявключително мезангиален пролиферативен нефрит и диабетни нефропатии. Познаването на реакциите на MC към патологични стимули е от решаващо значение за разбирането на тези болестни процеси. По-рано установихме, че подобен на Krüppel фактор 15 (KLF15), обогатен от бъбреците транскрипционен фактор с цинков пръст, е необходим за инхибиране на пролиферацията на MC. В настоящото изследване ние изследвахме директния целеви ген и основния механизъм, чрез който KLF15 регулира мезангиалната пролиферация. Първо, ние скринирахме малък свързан с убиквитин модификатор 1 (SUMO1) като директна транскрипционна цел на KLF15 и потвърдихме това откритие с ChlP-PCR и луциферазни анализи. Освен това, ние показахме, че свръхекспресирането на KLF15 или SUMO1 повишава стабилността на P53, което блокира клетъчния цикъл на човешки бъбречни MCs (HRMCs) и следователно премахва клетъчната пролиферация. Обратно, нокдаунът на SUMO1 в HRMCs, дори тези свръхекспресирани с KLF15, не може да инхибира скоростите на пролиферация на HRMC и да увеличи SUMOylation на P53. Накрая, резултатите показаха, че нивата на SUMOилиран P53 в кората на бъбреците на анти-Thy 1 моделни плъхове са намалени по време на периодите на пролиферация. Тези констатации разкриват критичния механизъм, чрез който KLF15 е насочен към SUMO1, за да медиира разпространението на MCs.
КЛЮЧОВИ ДУМИ: KLF15, мезангиална клетъчна пролиферация, P53, SUMO1
1| ВЪВЕДЕНИЕ
Мезангиалните клетки (МС) представляват приблизително една трета от клетъчната популация в гломерула. Те играят важна роля в хомеостазата, като поддържат структурната архитектура на гломерула, произвеждат и поддържат мезангиалния матрикс, регулират филтрационната повърхност и фагоцитират апоптотични клетки или имунни комплекси.1 При много гломерулни заболявания, като мезангиален пролиферативен нефрит и диабетни нефропатии , MC са увредени и претърпяват голяма промяна във фенотипа, което води до неконтролирана мезангиална пролиферация и прекомерно отлагане на мезангиален матрикс.2-4 В допълнение към хиперпролиферацията и увеличаването на производството на протеини на извънклетъчния матрикс (ECM) и матрични металопротеинази, MCs могат освобождават възпалителни фактори, водещи до гломерулна склероза и интерстициална фиброза; допълнително влошават бъбречното увреждане и причиняват прогресия до необратимо бъбречно заболяване в краен стадий.5-Познаването на реакцията на МС към патологични стимули е от решаващо значение за разработването на лечения за намаляване на увреждането на бъбреците, причинено от анормална пролиферация на МС и забавяне на прогресията в краен стадий на бъбречно заболяване.
Крюпел-подобните фактори (KLFs) са група от цинкови пръстови ДНК-свързващи транскрипционни фактори. Все повече доказателства показват, че това семейство участва в различни клетъчни процеси, като клетъчна диференциация, сърдечно ремоделиране, хемопоеза и определяне на съдбата на стволовите клетки.8-10 Семейството KLF се състои от осемнадесет члена, сред които KLF15 е широко разпространен вбъбрек, панкреас, сърце,черен дроби скелетните мускули. Предишни проучвания показват, че KLF15 е ключов транскрипционен регулатор в различни физиологични процеси, включително глюконеогенеза,имунни реакции, и диференциация на адипоцитите.1-14 Нашето предишно проучване показа, че KLF15 е необходим за инхибиране на пролиферацията на MCs.15 Това проучване имаше за цел да изясни директния целеви ген и механизма надолу по веригата, чрез който KLF15 регулира мезангиалната пролиферация.
2|МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
2.1|Модел на анти-Thy1 нефрит
Мъжки плъхове Wistar (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) с тегло между 200 и 220 g бяха разпределени на случаен принцип към контролната и анти-Thy1 групите. Всички плъхове бяха настанени в съоръжение за грижи за животни при цикъл светлина/тъмнина от 12/12 часа със свободен достъп до храна и вода. По време на експеримента бяха извършени оценки и интервенции, свързани с благосъстоянието. Общо 28 плъха са инжектирани с мише анти-Thy1 моноклонално антитяло, както е описано по-рано, 16 и седем са инжектирани с физиологичен разтвор (контроли). Гломерулите се пречистват от тъканта на бъбречната кора, като се използва метод на пресяване. Събрани са серуми за измерване на нивата на серумен уреен азот и креатинин. Плъхове с анти-Thy1 модел бяха убити на дни O, 3, 5, 7 и 10 и техните гломерули бяха събрани. Всички процедури за хуманно отношение към животните и експериментални процедури бяха извършени в строго съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни (Национален изследователски съвет на САЩ, 1996 г.).
2.2|Човешка бъбречна MC (HRMC) култура и лечение
Първичните бъбречни HRMCs бяха закупени от ScienCell (Сан Диего, Калифорния). HRMCs от третия до шестия пасаж се поддържат в MC Medium (MsCM; ScienCell) съгласно инструкциите на производителя. За експериментите клетките се отглеждат до сливане, растежът се спира в редуциран серум (0.5 процента FBS) за 24 часа и се разделят на различни експериментални групи.
За лечение с различни концентрации на глюкоза, клетките се инкубират в MsCM, съдържащ или 5 mmol/L глюкоза (нормална глюкоза), или 30 mmol/L глюкоза (висока глюкоза, HG) за 48 часа при 37 градуса С. Клетките се инкубират при идентични експериментални условия с 5 mmol/L глюкоза и 25 mmol/L манитол вместо 30 mmol/L глюкоза бяха използвани като осмотични контроли. За лечение с PDGF-BB, клетките се инкубират в MsCM, съдържащ 20 ng/ml PDGF-BB (R&D Systems, Minneapolis, MN) за 48 часа при 37 градуса С.
2.3|Имунохистохимия (IHC)
Вградената в парафин бъбречна тъкан се нарязва на срезове с дебелина 4 μm и срезовете се оцветяват за IHC. Срезовете се инкубират с 3 процента Н, О, за да се блокира ендогенна пероксидаза след депарафинизация. След извличане и блокиране на антиген, срезовете се инкубират с анти-KLF15 (ab81604, Abcam), анти-малък убиквитин-свързан модификатор 1 (SUMO1, ab32058, Abcam) и анти-PCNA (ab92552, Abcam) антитела при 4 градуса C След това резените се инкубират с вторично антитяло, белязано с пероксидаза от хрян, при 37 градуса за 30 минути и имунохистохимичната реакция се наблюдава съгласно инструкциите на производителя с 3,3'-диаминобензидин (DAB, ORIGINE, CN) като хромогенен агент . Впоследствие предметните стъкла бяха насрещно оцветени с хематоксилин-еозин и изобразени със светлинен микроскоп (Olympus). Имунохистохимичното оцветяване се оценява със софтуера Image J според стойността на средната оптична плътност (AOD).
2.4|Имунопреципитация на хроматин (ChlP) с паралелно секвениране (ChIP-Seq)
ChIP се извършва с помощта на Simple ChlP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads; Cell Signaling Technology) съгласно протокола на производителя. Накратко, HRMCs бяха свръхекспресирани или с KLF15, или с бъркане при клетъчна плътност от 2.0×10³клетки/mL и омрежени с 1,7 процента формалдехид в PBS за 5 минути при стайна температура (RT ). Омрежените клетки бяха лизирани, за да се получи ядрената фракция, която беше обработена с ултразвук в 1 × ChIP буфер. Лизатите се избистрят чрез центрофугиране при 9300×g за 10 минути при 4 градуса. Хроматиновите проби се инкубират или с анти-KLF15 антитяло (ab81604, Abcam), или с анти-lgG антитяло (фонов контрол) за една нощ при 4 градуса. Свързаните с антитялото комплекси се улавят чрез инкубиране с протеин G магнитни перли. ChlP-Seq библиотеки за секвениране бяха подготвени с помощта на TruSeq ChlP Sample Prep Kit (Illumina). Библиотеките бяха подложени на паралелно секвениране с HiSeq2500 секвенсер (Illumina), използвайки протокол за дължина на секвениране от 50 bp в един край. Суровите данни за секвениране от следващо поколение (NGS) бяха преобразувани във файлове FASTQ с помощта на софтуер CASAVA (версия 1.8.2) и всеки набор от данни беше подравнен към човешкия референтен геном (UCSC hg19) с помощта на Burrows-Wheeler Aligner (версия 0.7.12 ).17 Пиковото извикване на ChIP-Seq беше извършено с помощта на програмата MACS2 (версия 2.0.1) с параметрите по подразбиране, но aq стойност от 0,05, с входните данни за изваждане.18 Сравнение на пикове с кодирания контрол (родителските клетки) и пробите за свръхекспресия бяха извършени с Diffbind, R пакет, използвайки алгоритъма DeSeq2, и степента на фалшиво откриване от 0,1 беше счетена за показване на значимост.1 Суперенхансерите бяха идентифицирани от набора от пикове, открити в DMSO-третирани HRMCs със супер-енхансера софтуер ROSE.2 степен Пиковете на ChIP-Seq бяха анотирани с R пакета ChlPpeakAnno и промоторите бяха дефинирани като KLF15-обогатени региони в рамките на 1kb от мястото на начало на транскрипция.21 Генът с начално място на транскрипция най-близо до ° С въвеждането на всеки супер-енхансер се дефинира като целевия ген на този супер-енхансер.
2.5|ChIP-количествен PCR в реално време (ChlP-PCR)
Процедурата ChlP-PCR беше подобна на процедурата, описана по-горе. ChIP ДНК от третирани с анти-KLF15 антитяло клетки се използва за откриване на връзката между KLF15 и SUMO1. ДНК от третирани с анти-lgG антитяло клетки служи като контрола. Пречистената ДНК се използва за анализ на SUMO1 проксималната промоторна област чрез PCR в реално време на ABI PRISM 7600, използвайки SYBR GreenER qPCR Supermix. SUMO1 праймерите бяха както следва: напред: 5'-AGCAGCGGTCTTTAGCATCA-3';обратно:5'-TCGGTTAACCAGCACCCTTG-3'. Относителното усилване на промоторната последователност на гена беше изчислено с помощта на {{18 }}AcT метод и нормализацията беше извършена спрямо разреждане 1:100 на входящата ДНК.
2.6|Клетъчно маркиране и маркиране на стабилен изотоп чрез анализ на аминокиселини в клетъчна култура (SILAC)
Клетки с 15 процента конфлуентност се посяват в подходяща пълна среда (за HRMCs: MsCM). Етикетирането и SILAC процедурите са описани в предишни изследвания.22 Накратко, след като са били етикетирани с лек (13C,-белязан) или тежък (15N,-маркиран) лизин и лек (1c-белязан) или тежък (15N-белязан) )аргинин, клетките бяха трансфектирани с KLF15 свръхекспресионен плазмид или контролен плазмид. След третиране, клетките бяха трипсинизирани и преброени, за да се получи клетъчна пелета от 2 × 10'клетки/състояние, и клетките бяха подложени на SILAC анализ с помощта на масспектрометрия. Тежките и леките клетъчни пелети бяха лизирани в буфер за радиоимунопреципитация, обогатен с протеазни и фосфатазни инхибитори, като се използваха кратки 15-втори импулси на обработка с ултразвук. Лизатите се центрофугират при 14,000 rpm за 20 минути. След центрофугиране, супернатантите бяха събрани и концентрацията на протеин беше измерена с помощта на Hitachi L-8900 аминокиселинен анализатор. Аликвотни части от 200 ug протеин се приготвят от пробите, комбинират се и се утаяват, като се използва метод на утаяване с метанол-хлороформ. Протеиновите пелети бяха ресуспендирани в 8 mol/L урея/0,4 mol/L амониев бикарбонатен буфер, редуцирани с 45 mmol/L DTT за 30 минути при 37 градуса С, алкилирани със 100 mmol/L йодоацетамид за 30 минути на тъмно при RT и се смила с Lys-C протеаза (1:20 w/w) за една нощ (~16 часа) при 37 градуса. Усвоеният Lys-C беше допълнително разреден и усвоен с трипсин (1:20 w/w) в продължение на 8 часа при 37 градуса. Извлеченият продукт се обезсолява с колона MacroSpin (The Nest Group, Inc) и се суши в концентратор SpeedVac. След това обезсолените пептиди се обогатяват с фосфопептиди, като се използва смола от титанов диоксид, вградена в 10 μL накрайници (Glygen Corp). Потоците бяха запазени и обогатените пептиди бяха елуирани при използване на съотношение 1:33 на амониев хидроксид към водата. Изсушените чрез SpeedVac фракции на потока и елуирането се ресуспендират в буфер А (0,1 процента формична киселина във вода) и се подлагат на анализ с течна хроматография-тандемна масспектрометрия (LC/MS).
2.7| Репортерен анализ с двойна луцифераза
Човешки SUMO1(NM_001005781) промотор от див тип с 1604bp(-1474nt- плюс 129nt), включително потенциалното място на свързване (-205nt--199nt) беше получен с помощта на PCR амплифицират и субклонират в pGL3-Basic вектор (Cat.# E1751 Promega) със SacI и Bgl ll рестрикционни ензимни сайтове, наречени pGL3-WT-SU. Също така, мястото на свързване -CACCCA-в рамките на промотора на SUMO1 беше мутирано до -CGTTTG-, наречено pGL3-MT-SU. Плазмидът (pReceiver-M94), съдържащ човешката KLF15 сДНК с пълна дължина, беше получен от GeneCopoeia. KLF15 свръхекспресиращият плазмид и pGL3-WT-SU или pGL3-MT-SU бяха трансфектирани в HEK293T клетки с Lipofectamine 2000 реагент. След това пробите бяха котрансфектирани с pRL-TK (Cat #E2241, Promega) плазмид, експресиращ Renilla луцифераза. След 24 часа трансфекция, клетките бяха лизирани. Нивата на луциферазна активност на Firefly и Renilla бяха изследвани с помощта на репортерна система за анализ с двойна луцифераза (Biotek).
2.8|Приготвяне на РНК, синтез на сДНК и RT-qPCR анализ
Общата РНК се екстрахира с помощта на TRlzol (Invitrogen) и се пречиства с помощта на RNeasy Mini Kit (Qiagen) съгласно инструкциите на производителя. cDNA се генерира с помощта на комплект за синтез на cDNA на първа верига на ProtoScript (New England Biolabs. Количественият PCR се извършва с помощта на Power SYBR Green Master Mix (Life Technologies). Олигонуклеотидните последователности, използвани за RT-qPCR, са предоставени в таблица 1.
2.9|Тест за клетъчна пролиферация
Човешка SUMO1 cDNA (NM_003352.8) с пълна дължина, получена от OriGene Technologies (Пекин, Китай), беше вмъкната в pCMV6-Entry плазмид (CAT#: RC200633). Клетъчната пролиферация се анализира с Click-iT⑧ Plus EdU Alexa Fluor⑧555 Imaging Kit (Invitrogen) съгласно инструкциите на производителя. Накратко, клетките се инкубират в 6-плака за култура с ямки и се трансфектират с контролен плазмид KLF15 (Scramble, групата VECTOR), плазмид за свръхекспресия на KLF15 (същият по-горе, групата KLF15), експресионен вектор за SUMO1 (групата VECTOR), плазмид със свръхекспресия SUMO1 (групата SUMO1), siRNA с отрицателна контрола (групата SI CON), siRNA SUMO1 (групата SI SUMO1), плазмид със свръхекспресия на KLF15 със siRNA SUMO1 (групата KLF15 плюс SI SUMO1) или KLF15 свръхекспресиращ плазмид с отрицателна контрола siRNA (KLF15 плюс SICONгрупата) за 24 часа. След това средата беше заменена със среда, допълнена с 20 ng/mL PDGF-BB за 48 часа, и оптимизирана EdU концентрация от 10 μmol/L беше добавена около 12 часа преди PDGF-BB стимулация. След третиране клетките бяха фиксирани с 4 процента формалдехид, пермеабилизирани с 0,5 процента Triton X-100, промити с 3 процента BSA в PBS, инкубирани с Click-iT⑧ коктейл за реакция за 30 минути при RT и инкубирани с DAPIre-action буфер за 10 минути при стайна температура, защитен от светлина. Клетките се наблюдават чрез флуоресцентна микроскопия (Olympus, Токио, Япония). След това ядрата на пролифериращите клетки се оцветяват в червено.
2.10|Western blot анализ и имунопреципитация (IP)
Клетките се лизират с помощта на RIPA буфер (Thermo Scientific) и общият протеин в супернатантите се определя количествено с помощта на комплект за анализ на BCA протеин (Thermo Scientific). Western blot анализ и IP бяха извършени, както е описано по-горе. 23.24 Анти-KLF15 антитяло (AV32587, Merk), анти-SUMO1 антитяло (S8070, Merk) и анти- -актин (A5316, Sigma) бяха използвани за Western blot анализ. Анти-P53 антитяло (P5813, Merk) се използва за IP анализ.
2.11|Биоинформатичен анализ
Кандидатите от ChIP-Seq или SILAC показаха поне двойно обогатяване спрямо контролите. Анализът на генната онтология (GO) беше извършен с базата данни за анотация, визуализация и интегрирано откриване (DAVID; версия 6.7). P-стойностите бяха коригирани за тестване на множество хипотези с помощта на метода на Benjamini-Hochberg. Значително обогатени категории във функционалната субонтология и пътищата на KEGG с коригирана P-стойност<.05 were="" chosen.="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa)="" of="" 52="" intersecting="" genes="" or="" proteins="" between="" chlp-seq="" and="" silac="" was="" performed="" on="" the="" qiagen="" ipa="" platform(https://digitalinsights.qiagen.com/),="" and="" the="" motifs="" in="" the="" target="" genes="" were="" analyzed="" using="" meme="" suite="" 5.3.0.="">
2.12|Статистически анализ
Всички експерименти са проведени в три екземпляра и резултатите са изразени като средни стойности ± SEs. Всички данни бяха анализирани с помощта на софтуер SPSS (версия 20.0; SPSS Inc) и сравнени с помощта на t-тест на Student или еднопосочен ANOVA. P-стойност<.05 was="" considered="" to="" reflect="" statistical="">
