Характеризиране на потенциала за инхибиране на ензима CYP3A4 на избрани флавоноиди, част 2

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

2.3. Тест за псевдо-необратимо инхибиране

При анализа на псевдо-необратимо инхибиране пробите се инкубират с флавоноиди и се третират с оксидант, след което се подлагат на диализа. В случай на псевдонеобратимо инхибиране, ензимната активност трябва да се възстанови. При инкубациите с всички тествани флавоноиди е имало значително инхибиране на ензимната активност след диализа с и без лечение с оксидант (Фигура 4). Във всички случаи разликата в остатъчната ензимна активност между флавоноидната проба и пробата с калиев хексацианоферат е статистически незначима (p<>

Както в предишните експерименти, най-голямото намаляване на ензимната активност се наблюдава, когато хризинът се използва като инхибитор. Остатъчната активност на ензима след инкубация и диализа с хризин беше 0.57 процента, а след инкубация и диализа с предварително третиране с калиев хексацианоферат беше 1,31 процента (Фигура 4).

Cistanche може да подобри имунитета

В случай на директно (обратимо) инхибиране, този тип експеримент би показал възстановяване на ензимната активност след диализа. В случай на псевдо-необратимо инхибиране, ензимната активност ще се възстанови след лечение с оксидант и диализа. Тъй като това не е случаят с нито един от анализираните флавоноиди, може да се заключи, че всички флавоноиди показват необратимо инхибиране на цитохром P450 3A4.

3. Дискусия

Доказано е, че някои флавоноиди могат да инхибират активността на ензимите на цитохром P450. Шарич-Мустапич и др. [28] и Kondza et al. [29] показват, че акацетин, апигенин, кризин и пиноцембрин инхибират ензима CYP3A4 в анализа с тестостерон като маркерен субстрат. Тъй като ензимът CYP3A4 притежава голямо активно място, което може да приспособява субстратите по различен начин, се препоръчва да се провеждат анализи на активността с друг маркерен субстрат като нифедипин и мидазолам [30]. Следователно, използвахме окислението на нифедипин като маркерна реакция на активността на CYP3A4 и определихме кинетичните параметри на инактивиране. Стойностите на ефикасността на инхибиране, получени при използване на нифедипин като маркерен субстрат, са от същия порядък, когато се сравняват с тестостероновия тест за апигенин, акацетин и пиноцембрин. Само хризинът показва четирикратно по-висока стойност на тестостерона [29] в сравнение с анализа с нифедипин, т.е. 0,108 min-1 uM-1 спрямо 0,029 min-IμM-1. Наблюдаваните сходства в кинетиката на инактивиране са в съответствие с литературни данни, потвърждаващи, че нифедипин и тестостерон имат различни места на свързване, които се припокриват [31]. Цитохром P4503A4 има едно от най-големите активни места и може да поеме субстрата и инхибитора едновременно, като единият влияе върху свързването на другия, което би могло да обясни наблюдаваните разлики между анализите на нифедипин и тестостерон.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Клиничните последици от обратимите инхибитори (т.е. взаимодействията храна-лекарство) могат да бъдат избегнати, ако инхибиторът бъде прекратен от лечението. По-важните взаимодействия са тези, които са необратими, докато простото прекратяване на употребата на инхибитора няма да разреши проблемите с взаимодействието. В това проучване хризинът показва най-висок потенциал за инхибиране, с най-ниски IC50 и K; стойности. Изследването за молекулярно свързване на флавоноиди, свързващи се с цитохром P450 3A4, показва по-висок афинитет на свързване на хризин чрез излагане на В пръстена на желязото в активния център на ензима [28]. Проучването на връзката структура-инхибиране показа, чехидроксилгрупите в А пръстена допринасят за инхибиторния ефект, вероятно поради йон-йонни взаимодействия, докато В пръстенът може да бъде незаместен (пиноцембрин, кризин) или монозаместен (акацетин, апигенин), за да се наблюдава инхибиторният ефект (Фигура 1) [28]. Незаместените флавоноиди (пиноцембрин, кризин) са по-податливи на епоксидиране и генериране на реактивни междинни продукти, които инактивират CYP3A4. По-силният инхибиторен ефект, наблюдаван при хризин, вероятно се дължи на твърдостта на структурата и наличието на C2=C3 двойна връзка в сравнение с pinocembrin.

Значението на описаната ензимна кинетика може да се наблюдава в контекста на взаимодействията храна-лекарство, където прилагането на кризин (20-100 μM) значително повишава AUC и пиковата серумна концентрация (Cmax) на нитрофурантоин при плъхове [32] .cistanche deserticola ma,Например, докладвано е, че сравнително слабият инхибитор на ензима CYP3A4/5, еритромицин [33] причинява умерено взаимодействие с церивастатин при здрави доброволци (21% увеличение на AUC на церивастатин) [34]. Chrysin също има по-голям инхибиращ потенциал от mibefradil, антихипертензивно лекарство, което беше оттеглено поради значителни взаимодействия с други лекарства. Резултатите от това проучване показват, че кризинът може да бъде мощен инхибитор и вероятно да взаимодейства с други използвани лекарства,cistanche deserticolaпромяна на AUC и Cmax на тези лекарства. Хризинът е изобилен в прополиса (28 g/L) и е третият основен флавоноид в меда 5,3 mg/kg [35]; следователно диета, богата на тези храни, има потенциала да взаимодейства с лекарства, които са субстрати на CYP3A4.

Pinocembrin, доказан необратим инхибитор на ензима CYP3A4, показва най-ниското k; стойността на mg от 0.04 ± 0.01 min-1. Неговата ефикасност на инактивиране е подобна на тази на акацетин и апигенин （0,01 min-1 μM-1）. Пиноцембринът се намира най-вече в храни като мед и напитки (чай и червено вино), представлявайки богат източник на този флавоноид [29]. Съгласно тези кинетични параметри трябва да се подхожда с повишено внимание при консумацията на тези източници на пиноцембрин заедно с лекарства, които действат като субстрати на CYP3A4.

Акацетинът показва три пъти по-висока стойност на IC50 от хризин и пет пъти по-висок K; стойност, като същевременно поддържа подобни стойности на въздействие като другите флавоноиди, което показва по-ниска инхибираща ефикасност. Акацетин може да се намери главно в растителни видове като Turnera diffusa, Robinia pseudoacacia и Betula pendula [36], но някои храни също представляват източник на този флавоноид. Например сокът от кумкуат е богат източник на акацетин и акацетинът може да се намери в концентрации от 0,1 mg/100 g пресен сок [37]. Изходното съединение на акацетин, апигенин, показва най-високата стойност на IC50 и най-високия K; стойност сред четирите тествани флавоноида. Инхибиторният потенциал на апигенин беше потвърден in vivo, когато комбинираното лечение с апигенин и паклитаксел доведе до повишаване на оралната бионаличност на паклитаксел, което се дължи главно на повишената абсорбция в стомашно-чревния тракт чрез инхибиране на P-гликопротеин и намалено първо преминаване метаболизъм на паклитаксел чрез инхибиране на подсемейството на CYP3A в тънките черва и/или в черния дроб от апигенин [38]. Апигенинът е доминиращ флавоноид в целината, магданоза и лайката. Съобщава се, че сух магданоз има максималното количество апигенин, 45035ug/g. Допълнителни източници на апигенин се намират в билки като изсушен цвят на лайка, които съдържат 3000 до 5000 ug/g, и семена от целина, които съдържат 786,5 ug/g [39].

Обратимото инхибиране на цитохромите P450 3A4 е свързано с първия етап от каталитичния цикъл на цитохром P450 (Фигура 5). Най-често се наблюдава конкуренция между субстрата и инхибитора при свързване с активния център (фери желязо). В такъв случай е препоръчително да се проведат експерименти за свързване (ензимни титрувания) и да се тества с повече от един субстрат, тъй като CYP3A4 има голямо активно място, което може да поеме повече от една молекула субстрат/инхибитор [26,30. В това проучване ние използвахме нифедипин като субстрат и резултатите от ефективността на инхибиране бяха със сравнима величина с докладваните по-рано анализи, проведени с тестостерон като маркерен субстрат (Таблица 1).

Фигура 5. Каталитичният цикъл на цитохром P450 се състои от девет стъпки. Първата стъпка представлява свързването на субстрата и точката на взаимодействие с обратимите инхибитори. Във втория етап хем-желязото се редуцира до железна форма, към която се свързват псевдо-необратими инхибитори.цистанче ефектиАко се наблюдава необратимо инхибиране, то обикновено е свързано с радикалната форма на субстрата (образуван в стъпка 7) и/или продукта (образуван в стъпка 8). Реактивните кислородни видове, образувани в безполезен цикъл на цитохром P450 (стъпки 3а и 5а), могат да причинят разрушаване на ензима, което може да бъде предотвратено чрез добавяне на SOD и CAT. Описанието на стъпките, които не са свързани с инхибирането, е пропуснато. Изготвен съгласно справка [26].

Въпреки това, както показахме по-рано [28,29] и потвърдихме тук в нашите проведени експерименти, всички изследвани флавоноиди показват необратимо инхибиране. Независимо от вида на необратимото инхибиране (псевдонеобратимо или ковалентно свързване на междинен продукт с хем или апопротеин), инхибирането ще бъде най-забележимо, ако се проведе предварителна инкубация, преди добавянето на маркерен субстрат [26]. При предварителна инкубация се активира каталитичен цикъл чрез добавяне на генерираща система за производството на коензима (NADPH) и се оставя достатъчно време за наблюдение на инактивирането на ензима. По този начин, всички необратими видове инхибиране изискват редукция на ензима до желязна форма (Фигура 5).

Тъй като цитохромите P450 са хемопротеини, ние проучихме свързването на флавоноиди с желязната форма на активното място и свързването на възможно реактивно междинно съединение с хема [26]. За да се оцени възможното образуване на адукт на хема, беше проведен хемохромопиридинов анализ. Всички тестванифлавоноидизначително намалена концентрация на хем и в двата анализа, с повече от 50 процента. Chrysin отново беше най-мощният инхибитор, съответстващ на кинетичните стойности на инхибиране, наблюдавани в това проучване. Концентрацията на хем с пиноцембрин е пет пъти по-висока, а с апигенин е почти десет пъти по-висока от тази с хризин (съответно 25,3±0,4 и 45,1±1,7%). Това намаляване на концентрациите на хема показва, че необратимото инхибиране на CYP3A4 от изследваните флавоноиди може да се дължи на ковалентното свързване на реактивен междинен продукт към хема. Трябва да се отбележи, че хемите могат да бъдат унищожени от реактивни кислородни видове, понижавайки резултатите от хемохромопиридиновия анализ. За да се елиминира тази възможност, бяха проведени инкубации в присъствието на SOD и CAT (Таблица 2), потвърждавайки гореспоменатото заключение.

Първата стъпка в каталитичния цикъл на ензима цитохром Р450 е свързването на субстрат към железен йон. Ако инхибиторът показва конкурентно инхибиране към субстрата, ензимната активност може да бъде възстановена чрез диализа, тъй като елиминирането на инхибитора позволява пълното възстановяване на ензимната активност [26]. Въпреки това, ако инхибиторът се свърже с двувалентното желязо, е необходимо използването на окислител, като PCF, преди диализа, за да се възстанови ензимната активност. Ако ензимната активност се възстанови, инхибирането се характеризира като псевдонеобратимо [26]. Тъй като ензимната активност не може да бъде възстановена след диализа с или без PCF, нито един от тестваните флавоноиди (при концентрация от 25 uM) не действа като обратими или псевдо-необратими инхибитори на ензима CYP3A4. Това също потвърждава, че необратимо инхибиране чрез ковалентно свързване към хема или апопротеина е вероятната причина за ензимно инактивиране.

Трябва да се отбележи, че хризинът причинява почти пълно намаляване на хема в инкубацията: 97,1 процента без и 94,5 процента със SOD и CAT (Таблица 2); докато резултатите от остатъчната ензимна активност при подобни условия показват намаляване на ензимната активност с приблизително 99 процента (Фигура 4). Хемохромопиридиновият анализ регистрира хеми от всички източници в инкубацията, т.е. цитохром Р450, както и цитохром b;. Резултатите за хризин показват, че реактивен междинен продукт, генериран от цитохром Р450, реагира с хем от цитохром Р450, както и с цитохром b5.

Допълнителен LC-MS анализ беше проведен, за да се определят възможните реактивни флавоноидни междинни съединения или под формата на адукт на хема, или уловен с помощта на глутатион като радикален акцептор (данните не са показани). Ние обаче не успяхме да изолираме нито един от предвидените адукти, вероятно поради нестабилността на реактивния флавоноиден междинен продукт и/или хем/глутатионов адукт. Подобно поведение се наблюдава при мибефрадил, антихипертензивно средство, изтеглено от пазара поради взаимодействие лекарство/лекарство. Въпреки че мибефрадил причинява намаляване на хема, реактивен междинен продукт не е установен [40].

4. Материали и методи

4.1.Материали

В това изследване са използвани четири флавоноида (акацетин, апигенин, кризин и пиноцембрин) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Рекомбинантни цитохроми P450 3A4, коекспресирани с никотинамид-аденин-динуклеотид фосфат (NADPH)редуктаза и цитохром bs в автозоми, бяха закупени от Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).

Въз основа на цитохром Р450 анализ на въглероден оксид [41], съдържанието на ензима CYP3A4, обявено от производителя, е потвърдено, че е 1 μuM. Глюкозо-6-фосфат （G6P）, глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа (G6PDH) и -никотинамид-динуклеотид динатриева фосфатна сол (NADP плюс) бяха закупени от Sigma-Aldrich. Калиев фосфат (pa) и дихлорометан (pa) бяха закупени от Kemika dd (Загреб, Хърватия), мравчена киселина (85 процента, pa) от Semikem doo (Сараево, Босна и Херцеговина) и метанол, използван за разтваряне на реагент и хроматография от Merck KGaA (Дармщат, Германия). В инкубационните смеси и хроматографията се използва свръхчиста вода. Калиев дихидроген фосфат (Kemika dd) се използва за приготвяне на калиев фосфатен буфер рН 7,85; pH беше коригирано с помощта на натриев хидроксид, закупен от Semikem doo Нифедипин (Sigma-Aldrich) и окислен нифедипин (Европейска дирекция за качество на лекарствата, Фармакопея, 10-то издание, Страсбург, Франция) бяха използвани в изследването на остатъчната ензимна активност, както и в кинетика на инактивиране. Тестостерон (Sigma-Aldrich) и 6 -хидрокситестостерон (Кайман Европа, Талин, Естония) бяха използвани за анализи на псевдо-необратимо инхибиране. Тролеандомицин и дилтиазем са получени от Агенцията за лекарствени продукти и медицински изделия (Загреб, Хърватия). Пиридин (pa) (Semikem doo), говежди хемин (Sigma-Aldrich) и диметилсулфоксид (Semikem doo) бяха използвани в хемохромопиридиновия анализ. Калиевият хексацианоферат (Siegfried AG, Zofingen, Швейцария) е използван в изследването на обратимо и псевдо-обратимо инхибиране. Супероксид дисмутаза (SOD) (Sigma-Aldrich), каталаза (CAT) (Sigma-Aldrich) и солна киселина (36 процента, pa) (Semikem doo) бяха използвани в анализа за специфичност на свързване. Ензимните инкубации се извършват във водна баня (Inkolab, Загреб, Хърватия). Анализът на остатъчната ензимна активност и кинетиката на инактивиране на флавоноиди се извършва с помощта на високоефективна течна хроматография, съчетана с UV-Vis откриване (HPLC UV-Vis, Agi-lent 1100, Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Изчисленията на остатъчната активност и параметрите на кинетиката на инхибиране бяха направени с помощта на програмата R (The R Project for Statistical Computing, Виена, Австрия) и Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA).

4.2.Методи

4.2.1. Определяне на ензимна кинетика и остатъчна активност

Ензимните инкубации се извършват трикратно, с механично разбъркване във водна баня при 37 градуса. Аликвоти от флавоноиди с крайна концентрация от 1 μM се разтварят в метанол, прехвърлят се в стъклени епруветки и се изпаряват до сухо, с изключение на контролните проби без инхибитора (флавоноид). След изпаряването на разтворителя се приготвя инкубационна смес до обем от 100 μL, състояща се от 5pmol CYP3A4 ензим, 50 mM калиев фосфатен буфер (рН 7,4) , и свръхчиста вода. Система за генериране на NADPH, съставена от 0,1 M G6P:10 mg/mL NADP плюс:1000 IU/mL G6PDH=50:25:1(v/v/v) се приготвя непосредствено преди употреба. Тази система за генериране съдържа глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа, която регенерира NADP в NADPH, поддържайки концентрацията на цитохром P450 коензима (NADPH) постоянна в инкубацията. Добавянето на системата за генериране (15 процента от обема в крайната инкубация, v/v) започва реакцията. Нифедипин се използва за тестване на остатъчната ензимна активност при крайна концентрация от 200 μM. Реакцията се спира с помощта на 1 mL леденостуден 1% разтвор на мравчена киселина в дихлорометан. Пробите се смесват, след което се центрофугират за 10 минути на 1900 g (Rotofix32, Westfalia, Германия). След центрофугиране се образуват два слоя (вода и органичен слой). 850 μL от органичния слой се прехвърлят в кювети и се изпаряват. След това аналитът се разтваря в 30 μL метанол. Колона Agilent Zorbax SB C18 (4,6 × 250 mm, 3 μm, Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ） беше използван за анализ на пробите чрез HPLC. Подвижната фаза беше съставена от метанол и вода в съотношение 64:36. Анализът беше изократичен. Потокът беше настроен на 1,0 mL min-. Обемът на инжектиране беше настроен на 10 μL. Нифедипин беше използван като маркерен субстрат. Наблюдаваната реакция беше окисление на нифедипин. Хроматограмите бяха записани при 254 nm. Продължителността на анализа беше настроена на 25 минути. Задържането времето на нифедипин е 7,1 минути, а това на окисления нифедипин е 10,8 минути [42].И в двата случая количеството на получения продукт се наблюдава като количеството площ под кривата (AUC) спрямо контролната проба.За всички флавоноиди , полу-максимална инхибиторна концентрация (ICs0), константа на Бяха определени инхибиране (K;), константа на скоростта на инактивиране (Kinect) и ефикасност на инактивиране (въздействие /K;). Тролеандомицинът беше използван като положителна контрола--необратим инхибитор на цитохром P450 3A4.25 uM концентрация на тролеандомицин намали ензимната активност до 35±5 процента.

4.2.2. Хемохромопиридинов анализ

Хемохромопиридиновият анализ беше използван за оценка на възможното разрушаване на хема от реактивната междинна форма в цикъла на цитохром Р450 и беше извършен съгласно метода, описан от Flink и Watson [43] и Paul et al[44], с някои модификации. Беше установена калибровъчна крива, използвайки хемин, разтворен в диметилсулфоксид (0.6 до 0.1 μM）. Спектрите бяха записани при дължина на вълната от 500 до 600 nm. Инкубационни смеси с 25 uM инхибитори (флавоноиди) бяха приготвени до обем от 200 μL. Реакцията беше стартирана чрез добавяне на NADPH-генерираща система (за състава вижте раздел 4.2.1) и инкубациите продължиха 30 минути. Реакцията беше спряна след половин час чрез добавяне на пиридин (крайна концентрация 0,83 М) и натриев хидроксид (крайна концентрация 0,06 М) Пробите се записват на спектрофотометър (UV-1280, Shimadzu Corporation, Киото, Япония) в рамките на 1 минута добавянето на алкален разтвор, поради нестабилността на пиридиновия хемохромоген при основни условия [44]. Концентрацията на хем в пробите се изчислява въз основа на подготвената калибрационна крива. Този анализ се извършва в три екземпляра. Инкубациите се повтарят с помощта на каталаза и супероксид дисмутаза (5 IU всяка) в инкубационна смес за предотвратяване на генерирането на водороден пероксид чрез безполезния каталитичен цикъл.

4.2.3. Тест за псевдо-необратимо инхибиране

Целта на това есе е да се тества образуването на ковалентни комплекси с двувалентно желязо (Fe-), чрез оценка на възстановяването на ензимната активност след диализа с или без добавяне на окислител. Бяха проведени три типа експерименти за всеки флавоноид: инкубационна смес без флавоноиди (контрола), инкубационна смес с флавоноид и инкубационна смес с флавоноид, към който беше добавен окислител след инкубацията. Всяка инкубация с инхибитора се извършва за 30 минути, като се използват същите експериментални настройки, както е описано по-горе (раздел 4.2.1). След инкубиране пробите се прехвърлят в диализни патрони. Окислител - 20 mM разтвор на калиев хексацианоферат се добавя към една от инкубациите преди диализа [45]. Касетите (Slide-A-Lvzer Dialysis Cassettes, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) бяха потопени в 50 тМ буферен разтвор на калиев фосфат (рН 7.4) за 30 минути (диализният разтвор беше сменен три пъти). След диализата пробите се прехвърлят от касетата обратно в стъклената тръба и остатъчната ензимна активност се оценява с помощта на тестостерон като маркерен субстрат (200 μM крайна концентрация). Тъй като системата за генериране на NADPH също беше диализирана, тя отново беше добавена към инкубациите за иницииране на ензимни реакции. Пробите се инкубират в продължение на 30 минути със същите настройки (описани в раздел 4.2.1). Реакцията се прекратява чрез добавяне на леденостуден разтвор на мравчена киселина в дихлорометан. Пробите се анализират чрез HPLC. Дилтиазем, известен псевдо-необратим инхибитор на цитохром P450 3A4, беше използван като положителна контрола за оценка на окисляването до железна форма (наблюдава се пълно възстановяване на ензимната активност).

4.2.4. Обработка на резултатите

Ще се използва едностранен t-тест за оценка на статистическата значимост на разликите между пробите и контролите, въз основа на измервания на остатъчната активност. Използва се нелинейно уравнение за изчисляване на IC50 стойността. Уравнението на Michaelis-Menten се използва за определяне на константата на инактивиране и скоростта на инактивиране на инхибитора. Статистическата обработка и подготовката на графиките бяха извършени с помощта на програма R (The R Project for Statistical Computing, Виена, Австрия) и Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, САЩ).

5. Изводи

Акацетин, апигенин, кризин и пиноцембрин инхибират активността на ензима CYP3A4 in vitro. Chrysin е най-мощният ензимен инхибитор, с най-ниската IC50, K; Стойности на Kinect и най-висока ефикасност на инактивиране. Всички флавоноиди намаляват концентрацията на хема на ензима, потвърждавайки, че това е необратимо инхибиране от реактивен междинен продукт, който не може да бъде предотвратен чрез добавяне на SOD и CAT. Нито един от тестваните флавоноиди не действа като обратим или псевдо-необратим инхибитор на ензима CYP3A4 при концентрация от 25 μM, тъй като ензимната активност не може да бъде възстановена с диализа с и без добавяне на калиев хексацианоферат. Тъй като тези флавоноиди могат да бъдат намерени в изобилие в различни храни като плодове, зеленчуци, подправки, чайове и червено вино, има възможност те да взаимодействат с различни ксенобиотици, които са субстрати на CYP3A4. Необходими са по-нататъшни in vivo проучвания, за да се изследват напълно възможностите за такива взаимодействия храна-лекарство, както и възможния принос на други ензими и транспортери във взаимодействията.

Тази статия е извлечена от Molecules 2021, 26, 3018