Характеризира се с намаляване на физиологичните функции в отделните системи на органи

Моля, свържете се с oscar.xiao@wecistanche.com за повече информация

РЕЗЮМЕ

Черният чай е най-широко консумираната чаена напитка в света и постоянно се съобщава, че притежава ползи против стареене. Въпреки това, дали теафлавините, един вид от характерните фитохимикали в екстрактите от черен чай, участват в регулирането на стареенето и продължителността на живота на потребителите, остава до голяма степен неизвестно. В това проучване ние показваме, че теафлавините играят полезна роля за предотвратяване на чревно изтичане с възрастта и дисбиоза, като по този начин забавят стареенето при Drosophila. Механично, теафлавините регулират сглобяването на кондензата на Imd, за да управляват отрицателно свръхактивирането на Imd сигнали в червата на плодовата муха. В допълнение, теафлавините предотвратяват индуцирания от DSS колит при мишки, което предполага, че теафлавините играят роля в модулирането на чревната цялост. Като цяло, нашето проучване разкрива молекулярен механизъм, чрез който теафлавините регулират чревната хомеостаза, вероятно чрез контролиране на коалесценцията на Imd.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

ВЪВЕДЕНИЕ

Стареенето, характеризиращо се с намаляване на физиологичните функции в отделните системи на органи и нарастващ риск от заболяване и смърт, включва натрупване на увреждане на молекули, клетки и тъкани (Alavez et al., 2011; Bartke et al., 2019; Engeet др., 2017). Идентифицирането на функционални материали или химикали, предотвратяващи биологичното разрушаване за забавяне на процеса на стареене и удължаване на живота, несъмнено е от основно значение (Bar-ardo et al., 2017; Kapahi et al., 2017). Предишни проучвания съобщават, че черният чай, най-широко консумираният чай в света, притежава значителни дейности, които забавят стареенето (Cameron et al., 2008; Fei et al., 2017; Kumar and Rizvi, 2017; Naumovski et al., 2019 ; Peng et al., 2009; Xiao et al., 2020). Хранителната добавка с екстракти от черен чай ефективно удължава живота на експериментални животни като червеи (Feet al.,2017), плодови мушици (Peng et al.,2009; Site al.,2011), мишки (Site al.,2011). ; Xiao et al., 2020) и плъхове (Kumar and Rizvi, 2017).

Добре известно е, че екстрактите от черен чай съдържат главно два вида фитохимикали, а именно катехини и теафлавини (TF) (Cameron et al., 2008; Kondo et al., 2019; Li et al., 2013), последният от които се произвеждат от катехини от ендогенна полифенолоксидаза и пероксидаза по време на процеса на окисляване при производството на черен чай (Li et al., 2013). Серия от проучвания идентифицираха ролята на катехините против стареене чрез подобряване на оксидативния стрес и свързаното с възрастта възпаление и намаляване на увреждането на тъканите (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Si et al. .2011; Waaner et al., 2015). Въпреки това, функционалните проучвания за приноса на TFs към стареенето значително изостават от тези върху катехините, тъй като е трудно да се извлекат достатъчни количества TFs от листата на черен чай за медицински изследвания (Takemoto and Takemoto, 2018). Наскоро бяха разработени няколко биосинтетични метода за масово производство на TFs (Takemoto and Takemoto, 2018), което прави възможно изследването на точните биологични ефекти на TFs и основните регулаторни механизми.

Напоследък нарастващите набори от данни подчертават централната роля на червата в стареенето и модулирането на продължителността на живота (Guo et al., 2014; Jji et al., 2019; Maynard and Weinkove, 2018; Rothenberg and Zhang, 2019; Salazar et al. ,2018). Чревният епител, който действа като селективна бариера, позволява абсорбцията на хранителни вещества, йони и вода и ограничава контакта на гостоприемника с вредни субекти, включително микроорганизми, диетични антигени и токсини от околната среда (Capo et al., 2019; Nicholson et al. , 2012; Ryu et al., 2010). Като високооборотна тъкан при индивидите, чревният тракт осигурява най-добрата жизнена среда за симбиотични микроорганизми, включително естествени анаеробни условия, изобилие от хранителни вещества и подходяща температура и pH

Фигура 1. Теафлавините удължават живота на дрозофилите и подобряват способността за катерене

(A и B) Женските плодови мушици бяха култивирани със стандартни храни, които бяха допълнени с 1 mg/ml или 2,5 mg/mL теафлавини (TFs) или без TFs като основен. Мухите бяха прехвърлени в свежи флакони, съдържащи нова среда през ден, и мъртвите мухи бяха отбелязани през целия живот на възрастните, кривите на оцеляване (A) и средната продължителност на живота (B) на женските мухи бяха анализирани и показани.

(Канд D) Женски w18 бяха хранени със стандартни храни за Drosophila (посочен Basal) или с храни, допълнени съответно с 1 mg/ml или 2,5 mg/ETFs. Шест независими групи мухи на посочените възрасти (съответно 10 дни, 30 дни, 40 дни и 50 дни) бяха подложени на кафе (C) и флуоресцеинови (D) анализи. стойност, образувайки ниши, заети от специфични бактериални видове в тялото (Bonfini et al., 2016; Buchon et al., 2013; Nicholson et al., 2012). Междувременно, тези симбиотични микроорганизми и техните метаболити също пряко или косвено влияят върху обработката на хранителни вещества; храносмилане и усвояване; енергиен баланс; имунна функция; стомашно-чревно развитие и съзряване; и много други важни физиологични дейности (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Maynard and VVeinkove, 2018; Nicholson et al., 2012). Взаимно изгодната връзка между двата симбионта може да поддържа стабилността и динамичния баланс на чревната микроекосистема (Bonfini et al., 2016; Brodeerick, 2016; Broderick et al., 2014; Guo et., 2014; May-nard и Weinkove, 2018; Nicholson et al., 2012).

cistanche може да спре стареенето

Серия от проучвания показват, че вроденият имунен отговор е критичен за поддържане на хомеостазата на чревната микробиота и се запазва от безгръбначни до гръбначни (Guillouet al., 2016; Guo et al., 2014; Ryu et al., 2006, 2010; Vijay- Кумар и др., 2010). В Drosophila два основни сигнални пътя, а именно пътищата на Toll и имунната недостатъчност (Imd), участват във вродените имунни отговори (Lu et al., 2020; Myllymakiet al., 2014; Valanne et al., 2011). Трябва да се отбележи, че пътят на Toll на Drosophila споделя прилики с пътищата на интерлевкин-1 рецептора на бозайниците (IL-1R) и MyD88-зависимите Toll-подобни рецептори (TLR), докато пътят на Imd е подобен към пътя на рецептора на тумор некротизиращия фактор (TNFR) и TRIF-зависимия TLR път при бозайници (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011). Тези два пътя контролират експресията на антимикробни пептиди (AMP) чрез активиране на NF-KB транскрипционни фактори (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011).биофлавоноидиImd сигнализиращият път обикновено се активира от Грам-отрицателна бактериална инфекция и води до експресия на друг набор от AMPs, като Attacin, Cecropin и Diptericin (Kleino and Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). Експресията на тези АМР изисква протеин за разпознаване на пептидогликан (PGRP)-LC рецептор в пътя на Imd и зависимото от сигнала разцепване и ядрена транслокация на Relish, транскрипционен фактор от семейството на NF-kB (Kleino и Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014 г.). Скорошно проучване показа, че образуването на амилоид е необходимо за активиране на пътя на Drosophila Imd при разпознаване на бактериални пептидогликани (Kleino et al., 2017). Въпреки това, дали този Imd кондензат участва в други биологични процеси, като поддържане на чревната хомеостаза и регулиране на стареенето, остава до голяма степен неизвестно.

В настоящото проучване ние използвахме плодови мушици и мишки като животински модели, за да изследваме ролите на TFs в контролирането на чревната цялост и стареенето. Ние показахме, че TF забавят свръхпролиферацията на чревните стволови клетки с възрастта, предпазват от дисбиоза на микробиома на червата и предотвратяват активирането на Imd сигналния път, като по този начин удължават продължителността на живота на Drosophila. Допълнителни механистични проучвания показват, че TF отрицателно допринасят за Imd сигнализирането може да бъде чрез блокиране на кондензацията на Imd, а не чрез неговото повсеместно разпространение. Освен това открихме, че TFs са много ефективни за предотвратяване на DSS-индуциран колит при мишки. Взети заедно, нашите открития разкриват потенциална роля на TFs в модулирането на Imd поведението, което може да бъде ключовият фактор за техния положителен принос към чревната хомеостаза и удължаването на живота.

РЕЗУЛТАТИ

Хранителните добавки с теафлавини удължават живота на дрозофилите

За да проверим дали теафлавините (TFs) влияят на стареенето и продължителността на живота на Drosophila, ние отгледахме женски w'118 мухи със стандартни храни за отглеждане, които бяха допълнени с 1 mg/mL или 2,5 mg/ml TFs и извършихме анализи на продължителността на живота, както беше описано по-горе (Ji et al .,2019). Мухите, хранени с диета, допълнена с равен обем TFs разтворител (H2O), се считат за контроли. Както е показано на Фигура 1А, диетичното добавяне на относително ниска концентрация на TFs (1 mg/mL) леко удължава живота на плодовата муха, а високата концентрация на TFs (2,5 mg/mL) има значително положителен ефект върху удължаването на живота. По-специално, дългосрочното поемане на високи концентрации на TFs (2,5 mg/mL) води до приблизително 8 дни повишаване на средната продължителност на живота на женските мухи (Фигура 1B), което предполага полезна роля на TFsin в регулирането на дълголетието при Drosophila. Подобни резултати бяха получени, когато тествахме потенциалните ефекти на допълнителни TFs върху продължителността на живота на мъжки w'*'''8 мухи (фигури S1A и S1B).

Фигура 2. Теафлавините предотвратяват възникваща с възрастта чревна дисфункция и дисбиоза на микробиотата при Drosophila

(A и B) Загубата на чревна цялост е анализирана от Smurftest на възраст от 10 дни, 30 дни, 40 дни и 50 дни на възрастни жени w18. Примери за не-смърф и смърф бяха показани в (A). Процентите на Смърф в различни посочени групи бяха анализирани и показани в (B).

(C) Изобилие от бактерии, запазени чрез qPCR на 16S rRNA гена в женски w18 файлове от различни посочени групи, бяха анализирани и показани.

(DF) Извършено е секвениране на коммензалния бактериален 16S rRNA ген. Пропорциите на бактериалните таксони (D), топлинна карта на основните микробни таксони (F) и относителното изобилие на Gammaproteobacteria (F) бяха анализирани и представени.

Фигура 2. Продължение

(G и H) Червата бяха дисектирани от посочените женски мухи, хранени с 2,5 mg/ml TFs или без TFs като контрола на 10-дневна и 40-дневна възраст. Изображенията на слайдовете на средното черво бяха заснети чрез флуоресцентна микроскопия за GFP сигнали (G). Статистическият анализ, показващ процентите на GFP-позитивните клетки, е показан в (H).

(I) Червата от посочените женски мухи бяха събрани и подложени на имунооцветяващи анализи, използващи антитела срещу фосфорилиран хистон 3(pH3). Анализирани и показани бяха статистически резултати, определящи количествено pH3-положителните клетки на червата. В B, C, H и данните са анализирани чрез двустранния тест на Стюдънт и са показани като средни стойности ± SEM.NS, незначително,*p<><0.001. see="" also="" figure="">

Известно е, че ETF имат горчив вкус и горчивите храни обикновено се избягват както от потребителите, включително плодови мушици, така и от бозайници (Yamazaki et al., 2014; Yang et al., 2018). След това се опитахме да изясним дали TF могат да повлияят на приема на храна от Drosophila, тъй като предишни проучвания доказаха, че диетичните ограничения водят до удължаване на продължителността на живота както при гръбначни, така и при безгръбначни (Hudry et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Moger-Reischer et al. ., 2020 г.). За да направим това, първо проведохме анализа на кафенето, широко използван подход за директно и точно измерване на скоростта на хранене чрез използване на капилярно захранващо устройство, съдържащо течна среда, както беше описано по-горе (Ja et al., 2007). Както е показано на фигури 1C и S1C, диетичните добавки на TFs (съответно 1 mg/mL и 2,5 mg/mL) почти не променят консумацията на храна на тествани мухи. За по-нататъшно потвърждаване на това, след това използвахме флуоресцеина като хранителен маркер (Rera et al., 2012; Wang et al., 2005) и извършихме анализ на естественото хранене (Danilov et al., 2015). Както е показано на фигури 1D и S1D, не успяхме да наблюдаваме никакви корелации между добавянето на TFs и нивата на прием на храна. Взети заедно, нашите резултати предполагат, че полезните роли на TFs за удължаване на живота може да не се дължат на диетично ограничение при Drosophila.

Допълнителни TF са необходими за въздействие върху енергийната хомеостаза на Drosophila

Предполага се, че полифенолите в черния чай оказват положителен ефект върху предотвратяването на затлъстяването чрез инхибиране на храносмилането, абсорбцията и приема на липиди и захариди, като по този начин намаляват приема на калории (Cameron et al., 2008). След това се опитахме да изясним дали удължаването на живота на LDrosophila, регулирано от TFs, се дължи на промени в усвояването на хранителни вещества и съхранението на енергия. За да направим това, първо изследвахме нивата на триацилглицерид (TAG), един от най-често откриваните липидни метаболити (Tennessen et al., 2014), при женски мухи през целия им живот, както беше описано по-горе (Fan et al., 2017).купи цистанчеКакто е показано на Фигура 1E, лечението на TF едва ли е повлияло на общото изобилие на TAG в различни възрастови точки. Когато допълнително открихме съдържанието на гликоген и количествено определихме циркулиращите въглехидрати (глюкоза и трехалоза) чрез комплекта Hexokinase (Li et al., 2018; Ten-nessen et al., 2014), резултатите показаха, че няма очевидни промени между пробите с или без лечение с TFs (Фигури 1F-1H). Трябва да се отбележи, че бяха получени последователни резултати, когато изследвахме метаболитни фенотипове, използвайки мъжки w118 като животински модели (фигури S1E-S1H). Взети заедно, тези данни предполагат, че диетичните добавки на TFs са необходими за регулирането на въглехидратната и енергийната хомеостаза през целия живот на Drosophila.

Допълнително изследвахме кинетиката на естественото стареене на Drosophila при интервенция на диетични TFs чрез извършване на бързи итеративни отрицателни тестове за геотаксис (RING), както е описано по-горе (Dilliane et al., 2017; Staats et al., 2018). Както е показано на фигури 1l, 1J, S1l и S1J, индексите на изкачване на възрастен (40 дни) w1118 (както жени, така и мъже) в групите с добавки на TFs бяха значително подобрени (почти 12% увеличение при жените и почти 18% увеличение при мъжете ) в сравнение с контролните групи, което предполага, че TF потенциално подобряват катеренето и локомоторните дейности на Drosophila.

Теафлавините предотвратяват възникващото с напредването на възрастта чревно изтичане и дисбиозата на микробиотата

Предишни проучвания показват, че локомоторните дейности на плодовата муха и продължителността на живота са силно свързани със здравословното състояние на гостоприемника, като пол, диета, възраст и генотип (Caruso et al., 2013; Heintz and Mair, 2014). Наскоро няколко линии доказателства доказаха, че запазването на чревната Imd сигнализираща хомеостаза подобрява целостта на червата чрез предотвратяване на свръхпролиферация на ISC и прекурсорни клетки и чрез забавяне на настъпилата с възрастта чревна епителна дисфункция, което от своя страна допринася положително за здравето на организма (Clark et al. , 2015; Guo и др., 2014). При Drosophila скъсената продължителност на живота е тясно свързана с дисфункцията на чревната епителна бариера и развитието на целостта на тази бариера по време на стареенето води до удължаване на продължителността на живота (Clark et al., 2015; Guoet al., 2014; Jet al., 2019). По този начин ние се опитахме да определим дали TFs променят целостта на червата чрез извършване на Smurf анализ, метод, който беше описан по-рано (Clark et al., 2015; Rera et al., 2011). Както е показано на Фигура 2А, тестваните плодови мушици, при които сините багрила са били ограничени до храносмилателния тракт, са посочени като несмърфове (ляв панел на Фигура 2А). Ако се наблюдават сини багрила

Фигура 3. Продължение

(EG) Червата бяха изолирани от женски w1118 пили, хранени с 2,5 mg/ml TFs или без TFs като основен на 10 дни, 30 дни, 40 дни и 50 дни, съответно. Общата РНК се екстрахира и се подлага на aRT-PCR анализи. Нивата на експресия на иРНК на диптерицин (F), атацин (F) и цекропин A1(G) бяха анализирани и показани. В EG данните се анализират чрез двустранен t-тест на Student и се показват като средни стойности ± SEM.NS, незначително, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

изтичащи от червата в корема, гостоприемниците бяха преброени като смърфове (десен панел на фигура 2A). В съответствие с предишни открития (Clark et al.,2015), пропорциите на смърфовете постепенно се увеличават по време на стареенето (Фигура 2B). Интересното е, че пропорциите на възрастните смърфове са значително намалени в групите, хранени с TFs, в сравнение с контролите, съответстващи на възрастта и при двете женски (от 8,2 процента на 3,7 процента, от 19,4 процента на 15,6 процента и от 35,4 процента на 27,1 процента за групите на възраст съответно 30 дни, 40 дни и 50 дни, фигура 2B) и възрастни мъже (от 2,7 процента до 0,9 процента, от 6,9 процента до 0,9 процента и от 8,3 процента до 2,7 процента на 30-годишна възраст дни, 40 дни и 50 дни, съответно, фигура S2A), което показва, че TFs могат да предотвратят дисфункция на чревната бариера при възрастни плодови мушици. Трябва да се отбележи, че наблюдаваме по-голямо намаление на процентите на смърфове при мъжките (намалено с почти 65,8 процента, 86.9 процента и 67,4 процента съответно на възраст 30 дни, 40 дни и 50 дни), отколкото тези на възраст -съвпадащи женски (намален с почти 54,1 процента, 19,5 процента и 23,3 процента на възраст съответно 30 дни, 40 дни и 50 дни), което предполага, че TF могат да играят по-добра роля за намаляване на чревното изтичане при мъжки мухи.

Предишни проучвания предполагат, че дисфункцията на чревната бариера с възрастта често е свързана с дисбиоза на чревната микробиота (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014). По този начин, ние изследвахме чревния комензален бактериален състав след добавяне на TFs. Първо използвахме универсални праймери и проведохме количествени PCR експерименти, за да определим количествено нивата на бактериалния 16S rRNA ген. Както е показано на Фигура 2C, при остарели разфасовки, общата бактериална популация от интервенционните групи на TFs показа забележително намаление (почти 45 процента -55 процента ) в сравнение с контролите, което предполага, че добавянето на TFs вероятно предотвратява разширяването на микробиотата по време на стареене . След това извършихме метагеномика, за да проучим подробно промените в чревната микробна общност, причинени от хранителни добавки с TFs. Както е показано на фигури 2D-2F, делът на гамапротеобактериите, чиято експанзия е установено, че е тясно свързана с недостатъчност на чревната бариера (Clark et al., 2015), очевидно е намален от добавянето на TFs в старите черва ( почти 7% намаление), което означава, че TFs допринасят положително за хомеостазата на чревната микробиота по време на стареене в Drosophila.

Теафлавините подобряват чревната пролиферативна хомеостаза при Drosophila

We further examined the intestinal integrity of flies that were treated with or without TFs. First, we employed the widely-used P{Esg-Gal4}/P{Uasp-GFP};{Tub-Gal80*s}strain(referred to as esgts>GFP), в който чревните стволови клетки (ISC) и прогениторните клетки са белязани с GFP. Както е показано на фигури 2G и 2H, броят на GFP-позитивните клетки в интервенционните групи на TF на възраст 40 дни (преброени са 20 черва) е много по-малък (почти 29,7 процента) от този в контролите, съответстващи на възрастта (почти 47,6 процента и Бяха преброени 19 черва), което предполага, че TF могат да инхибират свръхпролиферацията на ISC с възрастта. Освен това проведохме експерименти с имунооцветяване, използвайки антитела срещу Phospho-Histone 3 (pH3), специфичен маркер за митотични клетки в чревните тъкани. Наблюдавахме по-малко рН3-положителни клетки в червата от възрастни възрастни, приемали TFs (средният брой беше 20,6), отколкото при тези от контролите (средният брой беше 39,5, Фигура 2). Взети заедно, нашите резултати предполагат, че хранителните добавки с TFs подобряват чревната пролиферативна хомеостаза и предотвратяват дисплазията на микробиотата с възрастта, като по този начин забавят стареенето при Drosophila.

Теафлавините модулират отрицателно чревните Imd сигнали

За да изследваме основните молекулярни механизми, чрез които TF допринасят положително за чревната хомеостаза на Drosophila, ние извършихме RNA-seq анализ, използвайки съвпадащи по възраст чревни проби от възрастни жени w1118, лекувани с или без TFs. Анализите на фрагменти на килобаза на милион (FPKM) предполагат, че общите модели на генна експресия са сходни между двете експериментални групи (Фигура 3А). Допълнителен анализ на диференциалната експресия обаче идентифицира общо 229 диференциално експресирани гена, от които 99 са регулирани нагоре и 126 са регулирани надолу (Фигура 3В). Интересното е, че генният онтологичен анализ на тези гени разкри, че пътят на имунния отговор е силно променен от хранителни добавки с TFs (Фигура 3C).

При Drosophila е доказано, че вродените имунни сигнални пътища играят доминираща роля в регулирането на чревната хомеостаза и дълголетието с началото на възрастта (Clark et al, 2015; Guo et al, 2014). След това се съсредоточихме върху изследването на моделите на експресия на антимикробните пептиди (AMP) надолу по веригата на вродените имунни сигнали. Както е показано

Фигура 4. Продължение

(D) Пречистени Imd протеини се инкубират с различни концентрации на TFs (50 uM, 100 uM и 200 uM, съответно) при стайна температура в продължение на 5 минути. След това пробите се подлагат на спектърен анализ на флуоресцентни емисии, като се използват посочените дължини на вълната (възбуждане при 430 nm, излъчване от 450 nm до 550 nm с ширина на процепа от 5 nm). Проба без TFs беше използвана като базова контрола.

（E and F）Lysates of guts from NP11>Мухите Myc-Imd се приготвят и инкубират с TFs (100 μM) при стайна температура в продължение на 30 минути. SDD-AGE （горен панел в E) и SDS-PAGE (долен панел в E) бяха проведени за анализ на Imd протеинови агрегати. Тубулинът се използва като контрола на натоварването.цистанчИзвършен е денситометричен анализ за количествено определяне на Imd кондензатите в различни проби и резултатите са показани в (F). (G) Представителна хроматограма на проба от TFs.

(H и I) Пречистени Flag-Imd протеини се инкубират с TFs, TF1, TF2a, TF2b или TF3 (100 μM за всяка проба) или с равен обем буфер (контрола) при стайна температура за 30 минути, както е посочено. След това пробите бяха подложени на SDD-AGE (горен панел в H) и SDS-PAGE (долен панел в H) анализи за определяне на моделите на агрегиране на Imd. Беше извършен денситометричен анализ за количествено определяне на Imd кондензатите в различни проби и показан в (). В C, F и I данните се анализират чрез двустранния тест на Стюдънт и се показват като средни стойности ± SEM.***p< 0.001.="" see="" also="" figure="">

на Фигура 3D, AMP гени, управлявани от пътя на имунната недостатъчност (Imd), включително диптерицин А (DptA), дип-терицин В (DptB), атацин А (AttA), цекропин А1 (CecA1), цекропин А2 (CecA2) и цекропин C (Cece), са значително намалени (съответно с 39,4 процента, 72,3 процента, 10,5 процента, 86.5 процента, 99,8 процента и 36,1 процента) в групите, третирани с TFs, в сравнение с контролните групи. За по-нататъшно потвърждаване на резултатите, получени от RNA-seq анализ, ние проведохме количествена обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция (gRT-PCR), за да определим количествено относителните нива на експресия на Imd-свързаните AMP гени в проби от червата на Drosophila, получени в четири различни възрастови точки включително 10 дни, 30 дни, 40 дни и 50 дни. Както е показано на фигури 3E-3G, нивата на експресия на иРНК на определени гени, включително диптерицин, атацин и цекропин А1, са значително намалени (с почти 35,9 процента -66.6 процента) при третирани с TFs остарели черва. Взети заедно, нашите данни разкриха, че TFs потенциално антагонизират активирането на Imd сигналния път в клетките на червата на Drosophila по време на стареене.

Теафлавините са незаменими за транскрипционна регулация на Imd пътя или убиквитиниране на Imd

Ние се опитахме да проучим връзката между TFs и Imd и извършихме теста за повърхностен плазмонен резонанс (SPR), както беше описано по-горе (Lan et al., 2020). Както е показано на фигура 4A. TFs показват умерен афинитет на свързване с пречистен Imd протеин при изчислена Kp константа от 8,078 uM. След това сме склонни да определим как TF контролират чревния сигнален път на Imd. Въз основа на резултатите от анализа на транскриптоми от RNA-seq данни, ние открихме, че нивата на експресия на ключовите регулаторни фактори в Imd сигналния път, като PGRP-LC, Imd и Relish, почти не са били променени от лечението с TFs (Фигура S3A ). Освен това събрахме проби от червата от мухи, които бяха подложени на хранителни добавки със или без TF на различни възрасти и проведохме qRT-PCR експерименти, за да открием специфично моделите на експресия на тези гени. Както е показано на фигура S3B, нивата на иРНК на някои гени, включително effete, faded, tak1, pgrp-Ica, uev1a, bendless, relish, imd, pgrp-sc2, tab2, ird5 Kenny и diap2, са сходни между контролните групи и TFs интервенционни групи, което предполага, че TFs не участват в регулирането на Imd сигнали на транскрипционно ниво.

След това изследвахме профилите на убиквитиниране на Imd, тъй като предишни проучвания предполагат, че убиквитинирането на Imd е от съществено значение за трансдукцията на сигнала надолу по веригата в пътя на Imd (Myllymaki et al., 2014; Zhou et al., 2005). Първо проведохме in vitro тест за изместване на E1 и открихме, че лечението с TFs няма видимо влияние върху ензимните реакции на E1 и убиквитин за образуване на конюгиран E1/Ub (Фигура S4A). Освен това, ние трансфектирахме Drosophila S2 клетки с плазмиди, експресиращи Imd, маркиран с флаг, заедно с HA-маркиран Ub и след това третирахме клетките с или без TFs. По-нататъшни анализи на убиквитиниране предполагат, че добавянето на TF почти не повлиява нивата на убиквитиниран Imd в култивирани клетки (фигури S4B и S4C). За да определим връзките между TFs и повсеместното разпространение на Imd in vivo, ние използвахме трансгенната муха P {NP1-Gal4}/P{Uasp-Myc-Imd};P{Tub-Gal80*} (наричана NP1* s > Myc-Imd), в който Myc-маркиран Imd протеин е силно експресиран в чревни клетки (Фигура S4D). Нашите експерименти за убиквитиниране показаха, че диетичните добавки с TFs са ненужни за модулиране на убиквитинирането на Imd в чревните тъкани (фигури S4D и S4E). Взети заедно, нашите резултати показват, че TF негативно управляват сигналите на Drosophila Imd, като не засягат модела на убиквитиниране на Imd.

Теафлавините предотвратяват образуването на Imd кондензат

Едно скорошно проучване предполага, че агрегирането на Imd е от съществено значение за активирането на гени надолу по веригата в пътя на Imd (Kleino et al., 2017). След това се опитахме да проучим дали TF регулират процеса на

Фигура 5. Продължение

(F и G) Женски w18 (наричани imd плюс / плюс), imd' хетерозиготни и хомозиготни мутанти (наричани съответно imd плюс /- и imd-/-) са отглеждани със стандартни храни за Drosophila (наричани Basal) или диетична добавка с 2,5 mg/mL (наричани TFs) и след това бяха подложени на анализ на продължителността на живота Кривата на оцеляване (F) и средната продължителност на живота (G) бяха анализирани и показани.

В и F тестът Log Rank беше използван за статистически анализ. В BE и, двустранният t-тест на Student е използван за статистически анализ и данните са sh като средни стойности ± SEM. NS, без значение, *p<0.05, **p="" <="" 0.01,=""><0.001. see="" also="" figure="">

Imd образуване на агрегати. Първо, пречистихме Myc-маркирани Imd протеини от култивирани S2 клетки и инкубирахме протеините с различни концентрации на TFs (Фигура 4B). Интересното е, че открихме, че TF значително предотвратяват агрегацията на Imd (намалено с 81,7 процента -89.7 процента, Фигури 4B и 4C), както се предполага от нашите анализи за електрофореза с полуденатуриращ детергент агарозен гел (SDD-AGE). За да потвърдим това откритие, ние допълнително извършихме анализи на свързване на тиофлавин-Т и получихме последователни резултати (Фигура 4D). И накрая, отгледахме NP1ts> Myc-Imd трансгенни мухи, които бяха подложени на хранителни добавки със или без TFs и събрахме чревни проби от възрастни възрастни. Експериментите SDD-AGE предполагат, че агрегирането на Imd е значително понижено от TFs в чревните клетки (намалено с 16,7 процента -22 процента, фигури 4E и 4F).

За да определим как TFs допринасят за контролиране на сглобяването на Imd кондензат, ние подложихме TFs на HPLC-анализ и установихме, че те съдържат главно четири вида мономери (Фигура 4G), а именно теафлавин (TF1), теафлавин 3-O-галат ( TF2a), теафлавин 3'-O-галат (TF2b) и теафлавин 3,3'-ди-O-галат (TF3), които са в съответствие с предишни доклади (Li et al., 2013; Takemoto и Takemoto, 2018) . След това инкубирахме всеки от тези химикали с пречистен Imdprotein и проведохме SDD-AGE експерименти. Както е показано на фигури 4H и 4l, третирането на всички тези TFмономери доведе до значително намаляване (съответно с 59,5 процента, 60,9 процента, 58,4 процента, 58,2 процента и 55,8 процента за TFs, TF1, TF2a, TF2b и TF3) в съвкупните нива на Imd. Взети заедно, нашите резултати предполагат, че TF негативно регулират сигналния път на Drosophila Imd, вероятно чрез контролиране на поведението на Imd кондензатите.

Теафлавините удължават живота на Drosophila по Imd-зависим начин

To examine whether TFs prolong Drosophila lifespan depending on their regulatory role in Imd, we specifically knocked down Imd in gut tissues using the transgenic flies P{NP1-gal4)PITub-gal80*}/P{Uasp-imd-IR(KK)} (referred to as Imd RNAi). As shown in Figures 5A and 5B, dietary supplementation of TFs extended the lifespan of controls (elevation of nearly 7.2 days in the mean lifespan), whereas prevention of Imd expression in guts apparently reversed the lifespan extension caused by TFs. Consistent results were obtained when we utilized male Imd RNAi and control flies to perform lifespan assays (Figures S5A and S5B). Further qRT-PCR assays showed that the mRNA expression levels of AMP genes at ages of 10 days, 30 days, 40 days, and 50 days, including diptericin, attacin, and cecropin A1.hardly changed in the gut tissues of Imd RNAi flies(Figures 5C-5E), whereas additional TFs caused reductions of 31%-72.3% in mRNA abundances of these genes in samples from control groups. To confirm these results from Imd RNAi flies, we first performed lifespan assays using w18(control, referred to as imd+/+), imd' heterozygous (referred to as imd+/-), and homozygous(referred as imd-/-)mutant flies. We found that TFs addition extended lifespan and increased mean life longevity of imd+/-flies (elevation of nearly 6.2 days, Figures 5F and 5G). However, this lifespan extension effect by TFs was almost abolished in imd-/-flies (Figures 5F and 5G). Next, we performed lifespan assays utilizing Relish RNAi(NP1's>Relish RNAi and control(NP1ts>плюс )лети. защото Relish е ключовият транскрипционен фактор, отговорен за Imd-надолу по веригата AMP генни експресии (Myllymaki et al., 2014). Както е показано във Fiqures S5C и S5D. диетичното добавяне на TFs значително удължи дълголетието на контролните мухи и това удължаване на продължителността на живота беше значително предотвратено при мухите Relish RNAi. Взети заедно, нашите данни показват, че диетичните добавки на TFs допринасят положително за продължителността на живота на Drosophila, вероятно в зависимост от чревните Imd сигнали.

За да видим дали удължаването на продължителността на живота от TFstill се случва в аксеничен фон, ние извършихме анализи на продължителността на живота, използвайки w1118 женски при аксенични условия. Както е показано на фигури S5E и S5F, добавянето на различни концентрации на TFs (1 mg/mL и 2,5 mg/mL) почти не повлиява съотношенията на смъртност и средна продължителност на живота при w18 възрастни. Тъй като условията на аксенично отглеждане могат до голяма степен да предотвратят изобилната микробиота, като по този начин ограничават Imd сигналите при разфасовки (Clarke al., 2015), нашите данни предполагат, че TFs удължават живота на Drosophila може да бъде чрез модулиране на регулирани от чревната микробиота вродени имунни сигнали.

Фигура 6. Теафлавините облекчават индуцирания от DSS колит при CD-1 мишки

(A) Лечението с TFs не повлия на консумацията на вода в различни групи мишки CD-1.

(BD) Прилагането чрез сонда на различни концентрации на TFs (1 mg/mL, 2,5 mg/mL и 5 mg/mL, съответно) подобрява скъсяването на дебелото черво и разширяването на далака, причинени от DSS при CD-1 мишки. Показани са представителни изображения (B) и статистически анализи на дебелото черво (C) и далака (D). (E) Прилагането на различни концентрации на TFs (1 mg/mL, 2,5 mg/ml и 5 mg/mL, съответно) предотвратява изтичане на червата, предизвикано от DSS в CD-1 мишки. (F и G) Колони бяха събрани от посочените групи мишки. Общата РНК се екстрахира и се подлага на qRT-PCR анализи за откриване на нивата на експресия на иРНК на TNFa(F) и IL-6 (G).

(HL) Дебели черва от различни групи мишки се събират надлъжно и се подлагат на анализи за оцветяване с HE. Пробите бяха изследвани чрез микроскопия и бяха получени и показани представителни изображения на посочените проби （HL）. Скала, 40 μm. (M-Q') SEM изображения, показващи микротрихомите на дебелото черво от различни посочени проби. Скала, 50 um (MQ) и 4 um (M'-Q').

В CG данните се анализират чрез двустранния тест на Стюдънт и се показват като средни стойности ± SEM.NS, незначително, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

Теафлавините облекчават индуцирания от DSS колит при CD-1 мишки

За по-нататъшно изследване на потенциалната роля на TFs в поддържането на чревната хомеостаза при бозайници, CD-1 мишки бяха използвани за индуциране на колит чрез натриев декстран сулфат (DSS). На мишките са прилагани интрагастрално различни концентрации на TFs (1 g/L, 2,5 g/L или 5 a/L) или вода като контрола в продължение на четири седмици, последвано от третиране с 2 процента DSS в питейна вода в продължение на 7 дни. За да видим дали TFs влияят на количеството пиене на DSS в различни групи мишки, ние наблюдавахме пиенето на мишки всеки ден. Както е показано във Fiqure6A, лечението с TFs не е необходимо за повлияване на консумацията на напитки при мишки с индуциран от DSS колит, третирани с DSS мишки са показали синдром на колит с диария и/или хематохезия, които са били предотвратени чрез зависимо от дозата лечение с TFs (Фигури S6A-S6E).cistanche АвстралияОсвен това, интервенцията с TFs спаси намаляването на дължината на дебелото черво, причинено от DSS, и облекчи уголемяването на далака (Фигури 6B-6D).

След това използвахме декстран-4000-FITC (FITC-DX), за да изследваме чревната бариерна функция на тези мишки. Както е показано на фигура 6E, мишките от групите, третирани с DSS, показват висока концентрация на FITC-DX в кръвни проби, което показва изтичане на червата при тези животни. Въпреки това, намесата с TFs значително предотвратява транспортирането на FITC-DX от храносмилателните органи в кръвоносна система (намалена с 56,1 процента -77.5 процента, Фигура 6E). Трябва да се отбележи, че прилагането на TFs не променя чревната пропускливост на мишки при нормални условия (Фигура S6F). Тъй като възпалението играе основна роля в развитието на колит на миши модел, ние допълнително извършихме qRT-PCR експерименти, показвайки, че лечението с TFs значително понижава експресиите на IL-6 и TNF в червата на мишки, третирани с DSS (фигури 6F и 6G).

За по-нататъшен анализ на патологичните промени в дебелото черво, ние проведохме анализи за оцветяване с хематоксилин-еозин (HE). Както е показано на фигури 6H-6L и S6G-S6J, индуцираното от DSS тежко епително увреждане е значително подобрено чрез лечение с TFs по дозозависим начин. Сканиращата електронна микроскопия на тези чревни проби допълнително предостави последователни резултати (Фигури 6M-6Q' и S6K-S6N'). Взети заедно, нашите открития показват, че TFs играят полезна роля в защитата на функцията на чревната бариера както при насекомите, така и при бозайниците.

ДИСКУСИЯ

В това проучване ние изследвахме физиологичните функции на TFs в модулирането на чревната хомеостаза и дълголетието и основните молекулярни механизми. Ние показахме, че диетичните добавки с TFs положително допринасят за предотвратяването на възрастовата дисбиоза на чревната микробиота и забавянето на чревната епителна дисфункция, като по този начин удължава продължителността на живота на Drosophila. Нашите in vitro и in vivo механистични проучвания разкриха, че TF вероятно играят отрицателна роля в контролирането на Imd сигналния път чрез блокиране на коалесценцията на Imd. Освен това открихме, че индуцираният от DSS колит може да бъде ефективно облекчен чрез добавяне на TFs в CD-1 мишки. Нашите резултати подкрепят идеята, че TF благоприятно допринасят за чревната хомеостаза както при безгръбначните, така и при гръбначните.

Хранителната добавка с теафлавини удължава живота на дрозофилите

Консумацията на чай е популярна в световен мащаб и е на второ място след консумацията на вода (Rothenberg and Zhang, 2019). Многобройни проучвания са фокусирани върху физиологичните функции, често чрез експериментални и клинични подходи (Cameron et al.,2008; Niu et al.,2013; Peng et al.,2009; Rothenberg and Zhang.2019; Spindleret al.,2013; Takemoto и Takemoto, 2018; Unno et al., 2020; Zhou et al., 2020. Обширно е доказано, че чаят е от полза за здравето чрез понижаване на нивата на липидите и чрез ефекти против затлъстяване, а основните функционални съединения в чая са катехините, особено епигалокатехин галат (EGCG) (Abbas and Wink, 2009; Modernelli et al., 2015; Niu et al., 2013; Wagner et al., 2015; Xiong et al., 2018). Предишни проучвания също показват, че зеленият чай и черният чай може да увеличи продължителността на здравето и продължителността на живота на плодови мухи (Site al., 2011; Wagner et al., 2015), червеи (Fei et al., 2017; Xiong et al., 2018) и плъхове (Imran et al. .,2018; Niu etal.2013), а основният регулаторен механизъм е ефективната превенция на оксидативния стрес от EGCG чрез модулиране на ROSсигнали.ползи от Cistanche,Въпреки това, дали TFs, като характерните "златни" съединения в черния чай, играят роля в регулирането на стареенето и продължителността на живота остава до голяма степен неизвестно. Това проучване предоставя убедителни доказателства, показващи, че интервенцията на TFs е ненужна за въздействие върху приема на храна и дългосрочното усвояване на TFs чрез диетата значително удължава продължителността на живота както при мъжките, така и при женските плодови мухи. Тези констатации предоставят насоки за по-нататъшни изследвания на функциите на TFs в дълголетието на бозайниците.

Теафлавините подобряват възникващата с възрастта дисбиоза на микробиотата и насърчават чревната хомеостаза. Прогресивният дисбаланс на пролиферативната хомеостаза и регенеративния капацитет е отличителен белег на стареенето и възрастовите заболявания (Clark et al., 2015; Heintz and Mair, 2014; Maynard and Weinkove, 2018; Rera и др. 2012). Хроничното възпаление е свързано със загуба на хомеостаза и повишена честота на рак при стареещи организми (Bartke et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Xiao et al., 2020). Това е особено важно в бариерен епител като чревния епител (Guo et al., 2014; Maynard and Weinkove, 2018). С модел за развитие на свързана с възрастта дисплазия в стареещите черва, ние демонстрирахме, че подобряването на взаимодействията гостоприемник-комменс в стареещия бариерен епител може да насърчи здравето и продължителността на живота. Използвахме редица неинвазивни подходи за изследване на чревната функция и динамиката на микробиотата по време на стареене. Първо, анализът на Smurf показва положителна роля на TFs в регулирането на дисфункцията на епителната бариера по време на стареене. След това, имунооцветяващият анализ, използващ няколко трансгенни мухи, разкри, че TFs забавят свръхпролиферацията на ISCs и оборота на диференцирани клетки. И накрая, секвенирането на микробиома предполага, че TFs регулират надолу разширяването на чревната коменсална микрофлора с възрастта. Тези резултати категорично показват, че TF играят ключова роля в забавянето на процеса на стареене на гостоприемника чрез поддържане на чревната хомеостаза.

Теафлавините облекчават прекомерните имунни реакции в червата чрез отрицателно регулиране на Imd сигнализирането

Предполага се, че деликатният баланс между чревната имунна функция и микробиотата трябва да се поддържа, за да се осигури дългосрочна хомеостаза на бариерния епител (Guo et al., 2014; Maynard and Weinkove, 2018). Предишни проучвания също показват, че хроничното прекомерно възпаление в червата е свързано със свързана с възрастта дисфункция в бариерния епител и е отличителен белег на стареенето (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014; Ji et al., 2019) . По този начин поддържането на здрава комменсална популация чрез запазване на вродената имунна хомеостаза в такъв епител е обещаващ подход за насърчаване на здравето и дълголетието (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Clark et al., 2015). Да се ​​изследват молекулярните механизми чрез които TFs забавят стареенето, направихме RNA-seq анализ, използвайки разрязани черва със или без лечение с TFs. Нашите данни предполагат, че групата от гени, силно експресирани в червата на контролните плодови мушици в сравнение с тази на третирани с TFs животни, е обогатена с гени, класифицирани като гени на "имунен отговор". По-нататъшен биоинформационен анализ и get-PCR анализи разкриват, че експресията на Imd-свързани AMP гени е драматично инхибирана от добавянето на TFs в диетата. Резултатите от експериментите с мишки CD-1, използващи DSS за предизвикване на анормални имунни отговори в червата, допълнително потвърдиха идеята, че TFs функционират като протектори срещу чревно възпаление.

Теафлавините потискат сигналите чрез определяне на амилоидната група на Imd

Как TF негативно регулират Imd сигналния път? Въз основа на резултатите от анализа на транскриптома, ние открихме, че TFs са необходими за транскрипционната регулация на ключовите фактори в Imd сигналния път. Интересно е, че наблюдавахме очевидния афинитет на свързване на TFs с пречистен Imd протеин чрез SPR анализ, което предполага вероятност TFs да играят роля в контролирането на поведението на Imd протеина или неговия процес на пост-транслационна модификация. Предишни проучвания подчертаха основната роля на убиквитинирането в трансдукцията на Imd сигнал (Kleino и Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014), а предотвратяването на убиквитинирането на Imd води до дълбоко спиране на Imd сигнализирането (Myllymaki et al., 2014; Thevenon и др., 2009). Въпреки това, нашите in vitro и in vivo анализи за убиквитиниране показаха, че TF почти не влияят на модела на убиквитиниране на Imd. Скорошно проучване показа, че образуването на амилоид е необходимо за активиране на пътя на Drosophila Imd при разпознаване на бактериални пептидогликани (Kleino et al., 2017). Интересното е, че нашите SDD-AGE и ThTbinding анализи предполагат, че коалесценцията на Imd се предотвратява от TFs. Предотвратяването на агрегацията на Imd чрез унищожаване или мутация на Imd в чревните клетки очевидно е обърнало благоприятните ефекти на TF върху удължаването на живота. За по-нататъшно потвърждаване на нашата констатация би било интересно да се проучи дали TFs не са по-функционални за удължаване на продължителността на живота на плодови летки, когато запазеният загадъчен RHIM (cRHIM, аминокиселини от 118-ия до 121h) мотив на Imd е специално нокаутиран, унищожен, въз основа на констатацията, че престъплението в Imd е от съществено значение за неговото агрегиране и образуване на амилоид (Kleino et al., 2017). Въпреки това, нашето проучване подчертава основната роля на TFs в контролирането на чревната хомеостаза и процеса на стареене, може би чрез модулиране на коалесценцията на Imd. Бъдещите проучвания трябва да се съсредоточат върху изследването кои остатъци или региони на Imd са свързани с TFs и как това свързване води до предотвратяване на Imd кондензация. Освен това, нашите открития в системата на бозайниците показват, че TFs могат ефективно да защитят дебелото черво срещу възпаление, причинено от екзогенния отровен химикал DSS, което предполага запазена регулаторна роля на TFs в поддържането на чревната хомеостаза. Струва си да се проучи дали TF играят роля в управлението на сглобяването на протеини в тъканите на бозайници.

Тази статия е извлечена от zhongwenxie@ahau.edu.cn