Химични съставки на листата на Cistanche

Резюме: Cistancheлистата отдавна се използват като традиционна медицина залечениеисхемичен инсулт, стенокардия, ихипертонияи като здравословна напитка икозметика запротив стареене. Това изследване имаше за цел да изолира възможно най-много съединения от етанолов екстрактот листата на райска ябълка за идентифициране на биологично активните съединения. Антиоксидантният ефектот етилацетатния слой от етаноловия екстракт от листата на райска ябълка беше демонстрирано от2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH) анализ и онлайн високоефективна течна хроматография-2,20 -казино-бис (3-етилбензотиазолин-6-сулфонова киселина) (HPLC-ABTS) анализ. Нов флавоноид,кемпферол-3-O- -D-2"-кумароилгалактозид (1) и ново естествено съединение, кемпферол-3-O- -D-2"-ферулоилглюкозид (3) бяха изолирани от етилацетатния слой, заедно с 25 преди товаизвестни съединения, включителночетиринадесет флавоноиди, един йонон, два кумарина, седем тритерпеноида,и един ацетофенон. Интерпретацията на спектрометричните и спектроскопските данни определя техните структури. Всички изолирани съединения бяха бързо оценени с помощта на онлайнHPLC-ABTSанализ, и от тях, съединения4–8, 11, 13, 15, и16 ясно показаноантиоксидантни ефекти. Theколичеството на тези съединения е {{0}}.3–0,65 процента от екстракта.

Ключови думи:Диоспиров каки; Райска ябълка листа; флавоноид; антиоксидант

Щракнете тук, за да получите Cistanche, богат на флавоноиди за козметични средства против стареене

1. Въведение

Диоспиров какиThunb. (райска ябълка) принадлежи към семейството на Ebenaceae и е широко разпространеноразпространява се в Корея, Китай и Япония. Плодовете му се консумират пресни или сухи, докато листата иматотдавна се използва като традиционна медицина за лечение на исхемичен инсулт, стенокардия, хипертония,атеросклероза и инфекциозни заболявания [1]. Освен това са използвани листата мукато здравословни напитки и козметика поради техните свойства против стареене и способността дапомагат за предотвратяване на натрупването на холестерол и меланин [1]. Последните изследвания показватче екстрактите от листата на райска ябълка притежават широк спектър от биологични свойства,включително отстраняване на радикали, невропротекция, инхибиране на тромбоза, антиатеросклероза,и антиалергични [2–6]. Предишно фитохимично изследване предполага, че различнивидовефлавоноидии терпеноидите са основните съставки [7] и няколко танини,също се съобщава за нафтохинони, кумарини, йонони и мастни киселини [8–12]. Реактивните кислородни видове (ROS) са реактивни молекули, произведени в биологични системи,и балансът между генерирането и елиминирането на ROS е добре контролиран в нормално състояниеклетъчна физиология [13]. Прекомерното генериране на ROS обаче причинява окислително увреждане,и от своя страна стареенето и свързаните с възрастта заболявания, включително рак, диабет и болест на Паркинсонболест [14]. Следователно откриването на антиоксиданти като флавоноиди и фенолни съединенияможе да бъде обещаваща стратегия за лечение на тези заболявания.

Като част от нашия непрекъснат проект за намиране на биологично активни съединения [15], наантиоксидантен ефект на екстракта от етанол (EtOH) и разтворители от райска ябълкалистата е оценено с помощта на 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH) анализ и онлайн високопроизводителентечна хроматография-2,20 -казино-бис (3-етилбензотиазолин-6-сулфонова киселина)(HPLC-ABTS) анализ. Фитохимично изследване на листата на Райска ябълка доведе до изолиранетона един нов флавоноид (1), едно ново естествено съединение (3) и25 по-раноизвестни съединения. Прилагането на спектроскопски и спектрометрични методи характеризира структурите. Всички изолирани съединения бяха бързо проверени за тяхнотоантиоксидантни ефекти с помощта на онлайн HPLC-ABTS. Освен това, количественият анализ навсички изолирани съединения са проведени в настоящото изследване.

2. Резултати и дискусия

2.1. Антиоксидантно действие на листата от райска ябълка

Оценен е антиоксидантният ефект на етанолния (EtOH) екстракт от листа от Райска ябълказа предварителен скрининг чрез DPPH (Фигура1А). 0.125 mg/mL отекстракт поглъща приблизително 80 процента от DPPH радикала, докато 0,025 mg/mL аскорбинова киселинакиселина съставлява 94 процента от радикала. Онлайн HPLC-ABTS анализът беше извършен бързогарантира надеждността на тези резултати (Фигура1Д). Галова киселина и тролокс се използват като вътрешнистандарти. Хроматограмата при 734 nm (отрицателен пик) предполага, че приблизителнодевет съставки могат да имат антиоксидантна активност. Галова киселина и тролокс (6-хидрокси- 2,5,7,8-тетраметил хроман-2-карбоксилова киселинакиселина) бяха използвани като вътрешни стандарти за гарантиране нанадеждност на резултатите. Изводът е, че повечето от тези пикове са флавоноидни производникато флавоноиден гликозид и флаванол, въз основа на извършения дерепликационен анализчрез сравняване на ултравиолетови (UV) и масови спектри на съединенията с публикуванитеданни. Фракционирането, ръководено от биотест, предполага, че тези антиоксидантни съединения сав изобилие в етилацетатния (EtOAc) слой, докато водата (H2O) слой показа слабактивност (Фигура1B,C). 

Фигура 1. Ефекти на отстраняване на DPPH от EtOH екстракт (A), EtOAc слой (B) и HO слой (C) HhO слой на листата на Райска ябълка: (D) онлайн ABTS-HPLC хроматограма на EtOH екстракта.

2.2. Фитохимично изследване

За идентифициране на тези антиоксидантни съединения, различни хроматографски и спектроскопскибяха проведени методи за изолиране и структурно характеризиране насъединения. Нов флавоноид (1) и ново природно съединение (3) са получени отетилацетатен слой на етаноловия екстракт, заедно с 25 докладвани по-рано съединения,а именно кемпферол-3-O- -2"-кумароилглюкозид (2) [16], ( плюс )-катехин (4) [17], хиперозид(5) [17], изокверцитрин (6) [18], кверцетин -3-O- -2"-галоилгалактозид (7) [19], кверцетин -3-O- -2"-галоилглюкозид (8) [20], трифолин (9) [18], астрагалин (10) [18], кемпферол-3-O- - 2"-галоилгалактозид (11) [21], кемпферол-3-O- -арабинозид (12) [22], кемпферол-3-O- - 2"-галоилглюкозид (13) [23], кверцетин -3-O- -2"-кумароилглюкозид (14) [24], кверцетин(15) [15], кемпферол (16) [25], (6S,9S)-розеозид (17) [26], скополетин (18) [27], умбелиферон(19) [28], 1-(2,4-дихидрокси-6-метилфенил)етанон (20) [29], барбинервинова киселина (21) [30], диспиринова киселина B (22) [7], ротогенова киселина (23) [31], помолова киселина (24) [32], сиарезинолова киселина(25) [33], олеанолова киселина (26) [25] и урсолова киселина (27) [25] чрез използване на спектроскопски испектрометрични и физически данни в сравнение с публикуваните данни, а също и с тънкианализ на слойна хроматография (TLC) (Фигури2 и3). Сред тях съединения2, 16, 17, 19, 20, и24 бяха първо изолирани отD. каки. 

Съединение 1 беше получено като жълт прах, в който молекулната формула беше установена като C3olO3 въз основа на данни от масспектрометрия с висока разделителна способност (HRMS). Спектърът показва абсорбционни ивици при 207 и 315 nm, което показва, че съединение 1 има флавонолов скелет. Данните от 'H ядрено-магнитен резонанс (NMR) (Таблица 1, Фигура S1) показват типичен модел на кумаролиран флавонол гликозид, показващ два комплекта сигнали от тип AA'BB' ({{10}}).{{11 }} (2H, d, J= 8.5 Hz, H-2' и H-6 ),6,87 (2H, d, J{{20}} .5 HzH-3' и H-5')) в В пръстена на кемпферол, както и сигналите (0 7.45 (2H, d, J=8. 5 HzH-2 и H{{3{{104}}}}"), 6,81 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3 и H-5 процента ) в ароматния пръстен на кумароиловата група Два дублетни сигнала (8H 7.65 (1H, d, J=15.5 Hz, H-7"") и 6.35 (1Hd, J=16.0 Hz, H-8") бяха наблюдавани, което показва транс-олефинови протони от групата на страната. Освен това, аномерен протонен сигнал (0H 5,57 (1H, d, J=8.0 Hz, H-1) се наблюдава в областта на захарта, което предполага наличието на B-конфигурирана циклична захарна група. 1Фигура S2) показва 30 резонанса, включващи два транс-олефинови въглерода, десет ароматни въглерода и шест въглерода на глюкозилната част и десет непротонирани въглерода, включително два карбонилни въглерода. По-специално, химичните отмествания при C-2, C-3 и C-4 (8c 158.1, 134.9 и 179.2) са характерни сигнали за флавонол3-0-гликозид. Освен това карбонилният въглероден сигнал при C-1" (8c 168.7) и два трансолефинови въглеродни сигнала при C-2'" и C-3"(6 146.9 , 115.2) са типични химически измествания на кумароиловата група. Аномерният въглероден сигнал при C-1(6C 100.4) и други сигнали за гликозилната част от C-2" до C-6" " (6c74.3, 73.4, 70.5, 77.4 и 62.0) бяха наблюдавани. Тези едномерни (1D) NMR данни бяха насложени с тези на кемпферол-3-0-B-2"-кумароилглюкозид (2) (16]. Въпреки това, внимателното сравнение на данните от 13C NMR между двете съединения предполага, че съединение 1 има галактозна част, което беше допълнително демонстрирано от ядрено усилената спектроскопия на Overhauser (NOESY) NMR данните (Фигура S6). Докато NOES корелацията между H-2 и H-4 се наблюдават в съединение 2, няма корелация между тези протони в съединение 1. Като цяло интерпретирането на 13C NMR и NOESYNMR данните е ефективен метод за определяне на типа на гликозилната част Беше изведено, че местоположението на галактозната част е при C-3 според изместването на полето надолу на C-2и C-4, както допълнително се доказва от корелацията на хетеронуклеарната множествена връзка (HMBCмежду H{ {123}}" и C-3 (Фигура S5). Доказано е, че позицията на кумароиловата група е при C-2" въз основа на изместването на полето надолу (0 5.36 (1H, dd, J=10.0, 8.0 Hz, H{ {134}}")) и HMBC корелацията между H-2' и C-1. В резултат структурата на съединение 1 беше определена като кемпферол-3-0-B-2"-кумароилгалактозид. Въпреки че съединение 2 беше изолирано преди това от различни източници, включително Ouercus suber (16] и Alliumporrum (34), съединение 1 беше изолирано и структурно характеризирано за първи път.

Съединение3 се изолира като жълт прах и се установява молекулната формулакато C31H28O14 чрез анализиране на данни от HRMS. UV спектърът показа UVабсорбция при 210 и 327 nm поради същия агликон със съединения1 и2. The1H ЯМР данни (Таблица1, Фигура S10) бяха подобни на тези на съединението2, но съединение3 имаше ферулоилова група вместо кумароилова група, както се вижда от присъствието на anдопълнителна метокси група (δH 3.91 (3H, s, 3000 -ОХ3)). Освен това, аномерен протонсигнал (δH 5.64 (1H, d, J {{0}}.0 Hz, H-100 )), което показва, че гликозилната връзкабеше- конфигурацияи сигналът с изместване на полето надолу (5.03 (1H, t,J = 8.5 Hz, H-200 )) беше показано в областта на захарта, както при съединението1. The13С NMR данни (Таблица1, ФигураS11) показва 31 резонанса, включващи двапрев-олефифинови въглероди, десет четвъртични въглерода,десет ароматни въглерода, шест въглерода на глюкозилната част и един метокси въглерод и десет непротониранивъглероди, включително два карбонилни въглерода, съответстващи на кемпферол, ферулоил,и глюкозни групи. По-специално въглеродните сигнали от C-200 до C-600 (δC 75.8, 76.3, 71.5, 78.8 и 62.5) предполагат наличието на глюкозна част. Местоположението на глюкозната части ферулоилова група бяха присвоени от дългосрочните HMBC корелации между H-100 иC-3 (δC 134.8) и H-200 и C-1000 (δC 168.4) (Фигура S14). Позицията на допметокси групата се определя от ключовата корелация между 3000 -ОХ3 и C-3000 (δC 149.4). Горните резултати предполагат структурата на съединението3 като кемпферол-3-O- - 2"-ферулоил глюкозид. Доколкото ни е известно, съединение3 беше докладван само като aпродукт от хидролизата на 3-O- -(2-O-ферулоил)-глюкозил-7,40 -ди-О- -глюкозил кемпферол, изолиран отAllium tuberosum[35]. Следователно структурата на3 беше изяснен като новестествено съединение.

Съединение11 се изолира като жълт прах. The1Н NMR данни (Фигура S19)показва набор от АА0 ББ0 -тип сигнали (δH 8.06 (2H, d, J {{0}}.0 Hz, H-20 , H-60 ), 6.87 (2H, d, J {{0}}.0 Hz, H-30, H-50 )) в В пръстена на кемпферол и синглетен сигнал приδH 7.02 (2H, s, H-3000 , H-7000 ) на галоилова част в ароматна област, което е характерен сигналот отделения флавонол. Аномерен протонен сигнал (δH 5.78 (1H, d, J {{0}}.0 Hz, H-100 )) показва, че гликозилната връзка е a- конфигурация. Освен това поле надолуизместен протонен сигнал (5.27 (1H, t,J = 9.5 Hz, H-200 )) предполага, че галоилната групабеше прикрепен към хидроксилната група на C-200 защото тази промяна може да се припише наанизотропното влияние наO-галоилова част [21]. The13C NMR данни (Фигура S20)показва 26 резонанса, показващи отделен флавонолов гликозид. Въглеродът сигнализираот C-200 до C-600 (δC 71.1, 72.7, 68.2, 76.0 и 60.1) предполагат наличието на галактозачаст. Следователно структурата на съединението11 беше потвърдено като кемпферол-3-O- -200 - галоилгалактозид. Макар и съставен11 преди това е бил изолиран от различни източници,включителноD. каки[21,36], само1Данните за Н NMR и MS бяха докладвани преди това. По този начин,на13C NMR данни са докладвани за първи път в това изследване

2.3. Антиоксидантна активност на изолираните съединения

Всички изолирани съединения бяха оценени за техните антиоксидантни ефекти с помощта на rapid onлинеен HPLC-ABTS анализ, за ​​да се определи кои съединения са допринесли за антиоксидантаефект на листата на райска ябълка. Съединения4–8, 11, 13, 15, и16 показа мощен антиоксидативни дейности (Фигура4). Повечето от тези съединения са кемпферол и кверцетинпроизводни, но някои производни (1–3, 9, 10, 12, и14) не показва дейности. TheВръзката структура-активност не беше напълно определена, но беше частично разкрита. впо-специално, кверцетин и кемпферол с галоилови части (7, 8, 11, и13) бяха откритиимат силна активност, но тези с кумароилови или ферулоилови части (1–3 и16) не бяхпоказват всякакви дейности.

Фигура 4.Дейности за отстраняване на радикалите на изолираните съединения (4–8, 11, 13, 15, и16) бяха оценени онлайнHPLC-ABTS анализ.

2.4. Количествен анализ на изолирани съединения

Количественият анализ на всички изолирани съединения в EtOAc-разтворимия екстрактбеше извършено, за да потвърди, че антиоксидантните ефекти на листата на Райска ябълка могат да бъдатпричинени от тези активни съединения. Специфичен HPLC метод с откриване на диодна матрица ие разработен детектор за разсейване на изпарителна светлина за едновременното определянеот 27 съединения. Съдържанието на всички изолирани тритерпеноиди е приблизително 5,9 процента отекстрактът и от тях тези на сиарезинолова киселина (25), олеанолова киселина (26), и урсолакиселина (27) представляват значителна част, както се съобщава в предишни проучвания [7]. Theсъдържанието на флавоноиди е приблизително 5,4 процента, а от тях тези на активни съединенияса били 3,2 процента (табл2). По-специално, съдържанието на кемпферол-3-O- -200 -галоилгалактозид(9), кемпферол-3-O- -2"-галоилглюкозид (10), изокверцитрин (13) и кверцетин-3-O- -2"- галоилглюкозид (15) бяха повече от 0,3 процента. Аналитичният метод беше проверен с помощта на aпроста процедура за валидиране, за да се гарантира уместността на метода, който показа адекватностспецифичност, линейност, точност и прецизност.

Питай за още:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp плюс 86 15292862950