bgезик
Начало / знание / Съдържание

знание

Химерен човешки папиломен вирус-16 Вирусоподобни частици, представящи P18I10 и T20 пептиди от HIV-1 обвивка, индуцират HPV16 и HIV-1-Специфичен хуморален и Т-клетъчно медииран имунитет при BALB/c мишки

Dec 07, 2023

Резюме:

В това проучване HIV-1 P18I10 CTL пептидът, получен от V3 бримката на HIV-1 gp120 и Т20 антифузионният пептид на HIV-1 gp41 бяха вмъкнати в HPV16 L1 капсиден протеин за конструиране на химерни HPV: HIV (L1:P18I10 и L1:T20) VLP чрез използване на системата за експресия на клетки от бозайници. HPV: HIV VLPs се пречистват чрез хроматография. Ние демонстрирахме, че вмъкването на P18I10 или T20 пептиди в DE бримката на HPV16 L1 капсидни протеини не повлиява in vitro стабилността, самосглобяването и морфологията на химерни HPV: HIV VLPs. Важно е, че не се намесва нито в реактивността на HIV-1 антитялото, насочено към последователни и конформационни P18I10 и T20 пептиди, представени върху химерни HPV: HIV VLPs, нито в индуцирането на HPV16 L1-специфични антитела in vivo. Наблюдавахме, че химерните L1:P18I10/L1:T20 VLPs ваксини могат да индуцират HPV16-, но слаби HIV-1-специфични антитела отговори и предизвикват HPV16- и HIV-1-специфични T- клетъчни отговори при BALB/c мишки. Освен това, може да бъде потенциален бустер за увеличаване на ХИВ-специфичните клетъчни отговори при хетероложна имунизация след първично ваксиниране с BCG.HIVA ваксина. Тази изследователска работа ще допринесе за стъпка към разработването на нова химерна HPV: ХИВ VLP-базирана ваксина платформа за контролиране на HPV16 и HIV-1 инфекция, която е спешно необходима в развиващите се и индустриализираните страни.

Desert ginseng-Improve immunity (12)

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Ключови думи:

ХИВ-1; HPV16; ваксина; вирусоподобни частици; P18I10; Т20 енфувиртид; BCG.HIVA; хуморален имунитет; Т-клетъчно медииран имунитет

1. Въведение

Вирусът на човешката имунна недостатъчност-1 (HIV-1), който причинява синдром на придобита имунна недостатъчност (СПИН), е открит в началото на 80-те години на миналия век и оттогава се превърна в глобална епидемия [1]. Въпреки че високоактивното антиретровирусно лечение (HAART), заедно с предекспозиционната профилактика (PrEP) може да има реално въздействие върху контрола на HIV-1 инфекцията, ваксинацията все още е основен подход за обществена полза и за поставяне на край на глобалната ХИВ-1 епидемия [2]. Въпреки над три десетилетия задълбочени изследвания на ХИВ-1 и многобройни клинични изпитвания на ваксини, лицензирана ваксина срещу ХИВ-1 досега все още е непостижима. Проучването RV144, проведено в Тайланд, е първият случай, който разкрива скромна ефикасност от 31,2% срещу придобиването на HIV-1 инфекция [3]. По-голямата част от другите кандидати за ваксина срещу ХИВ-1, които са били подложени на клинични изпитания, се основават главно на ДНК, рекомбинантни вирусни вектори или модели на субединица протеин [4,5]. В идеалния случай една ефикасна ХИВ-1 ваксина е способна да индуцира вродени имунни отговори, неутрализиране на антитела за предотвратяване на вирусна инфекция [6], както и цитотоксични Т-лимфоцитни (CTL) отговори за елиминиране на заразените клетки [7]. Въпреки това, предизвикването на всеки отговор може да изисква различни стратегии за ваксина, което изисква отделни, но паралелни усилия за развитие. Изборът на имуногени и вектори за доставяне ще има значително въздействие върху функцията и специфичността на HIV-1 ваксините [8,9]. Повтарящите се неуспехи при използване на стандартните подходи за разработване на ваксина срещу ХИВ-1 доведоха до признаването на важността на избора на вектор за доставяне, режимите на основно усилване и имуногенната специфичност както в хуморалните, така и в клетъчните отговори. Повече от 100 вида човешки папиломен вирус (HPV) вече са известни и HPV генотипове 16 и 18 се считат за отговорни за приблизително 70% от раковите заболявания на маточната шийка в света [10]. HPV L1 вирусоподобни частици (VLPs), класифицирани като тип субединични ваксини, могат предимно да индуцират сравними L1- специфични хуморални отговори към див тип вирион, а също и Т-клетъчно-медиирани отговори [11–13]. В момента на пазара са лицензирани три HPV превантивни ваксини и всички те са базирани на VLPs на HPV L1 капсиден протеин. Два от тях, Gardasil (Merck, Rahway, NJ, USA) и Gardasil-9 (Merck) се произвеждат от експресионната система на дрожди (Saccharomyces cerevisiae), докато другият, Cervarix (GSK, Brentford, UK), се произвежда от системата на бакуловирусен експресионен вектор/клетка от насекомо (BEVS/IC) [14]. Досега оптималните условия за производство на HPV16 L1 протеини в експресионната система на бозайници не са добре установени. По този начин разработването на комбинирана ваксина, която би защитила срещу HPV и HIV инфекции, е логично усилие в борбата срещу тези два основни глобални патогена.

В предишната ни публикация на рецензентни документи относно концепциите за проектиране на базирани на вирусоподобни частици (VLP) ваксини срещу ХИВ-1 споменахме, че VLP без обвивка, като VLPs на папиломавирус, могат да играят функционална роля като вектори за доставяне, които да представят HIV-1 CTL или епитопи на неутрализиращи антитела [15,16]. Тази хипотеза е потвърдена в няколко химерични говежди папиломавируси (BPV) L1 VLP, представящи P18I10 CTL епитоп от V3 бримка на gp120 HIV-1 обвивен протеин (Env) и 2F5 епитоп или MPER регион на gp41 HIV-1 Env [17–22]. Структурната характеристика на капсидните протеини L1 на човешкия папиломен вирус тип -16 (HPV16) е подобна на тази на BPV и може да се самосглоби в еднослойни L1 VLPs [23]. Пет от протеините HPV16 L1 образуват пентамер и 72 от пентамерите се самосглобяват в HPV16 VLP [24]. Въпреки това, все още няма ясни доказателства, че химерните HPV16:HIV капсидни протеини могат да бъдат стабилни in vitro и да се самосглобяват в морфологично интегрални VLP. От друга страна, е доказано, че HPV16 L1 VLPs са силно имуногенни и са способни да индуцират антиген-специфични Т и В-клетъчни имунни отговори [11–13]. Все още остава да се види дали представянето на HIV-1 епитопи чрез HPV: HIV VLP може да бъде имуногенно. В това проучване ние имахме за цел да разработим химерна VLP-базирана HPV: HIV ваксина чрез използване на човешки 293F клетки, добре установена система за експресия на клетки от бозайници. Протеинът HPV 16 L1 действаше като структурно скеле на ваксината и пептидите P18I10 и T20 бяха избрани като HIV-1 имуногени и вмъкнати в DE бримката на протеина HPV 16 L1. Имунодоминантният P18I10 CTL епитоп, включващ 10 аминокиселини (остатъци 311–320: RGP GRAFVTI) е получен от третия вариабилен домен (V3) на HIV-1 обвивния гликопротеин gp120. Пептидът P18I10 е идентифициран като H-2Dd-ограничена МНС клас-I молекула за индуциране на цитотоксични Т лимфоцитни (CTL) отговори [25,26]. Пептидът Т20, известен като енфувиртид и проектиран като антиретровирусен мултимерен слят пептид, се състои от 36 аминокиселинна последователност (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF), имитираща С-терминалната хептадна спирална последователност близо до мембраната0 s proximal external region (MPER) на обвивния гликопротеин 41 на HIV-1 (gp41) [27]. Тези два ХИВ-1 Т (P18I10) и В (Т20) клетъчно-базирани епитопа бяха избрани като отправна точка и доказателство за концептуален експеримент за химерния базиран на VLP HPV: платформа за разработване на ваксина срещу ХИВ.

През последното десетилетие бяха тествани много различни формати за първично усилване на базирана на VLP ваксина срещу HIV-1 [15]. Въпреки че по-голямата част от предишните стратегии за ваксина срещу HIV-1 VLP [28] или химерни BPV: HIV VLP [17–22] бяха фокусирани върху индуциране на имунни отговори чрез използване на хомоложния първичен бустер режим, две предишни проучвания предполагат, че хетероложната имунизация състоящ се от рекомбинантниMycobacterium bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG), експресиращ HIV-1 Gag prime и HIV-1 Gag VLP усилване, може да допринесе за повишаване на Т-клетъчния имунитет [29,30]. В нашата изследователска група ние демонстрирахме имунизиране с rBCG, експресиращ HIVA имуноген и подсилване с рекомбинантен вирусен вектор MVA.HIVA беше безопасен и предизвика HIV-1-специфични Т-клетъчни имунни отговори при BALB/c мишки [31–33]. HIVA имуногенът, проектиран от д-р Томас Ханке, е съставен от HIV-1 Gag протеин с пълна дължина, комбиниран с множество CTL епитопи, включително P18I10 епитопи в С-края [34]. Следователно, ние имахме за цел да оценим дали BCG.HIVA може да засили Т-клетъчните имунни отговори, индуцирани от HIV: HPV (L1:P18I10) VLPs в BALB/c мишки.

В това проучване химерните HPV: HIV (L1:P18I10 и L1:T20) имуногени са проектирани и произведени чрез използване на 293F експресионна система. Експресията на химерния L1:P18I10 и L1:T20 протеин се потвърждава чрез имунооцветяване. HPV: HIV VLP впоследствие се пречистват чрез 3-етапен хроматографски метод, включващ катионна (CEC), хроматография с изключване по размер (SEC) и хепаринова афинитетна (H-AC) хроматография. След това, in vitro стабилността, in vitro самосглобяването и морфологията на пречистени HPV: HIV VLPs бяха потвърдени съответно чрез нередуциращ SDS-PAGE, анализ на молекулна маса и трансмисионна електронна микроскопия (TEM). Последователните и конформационни P18I10 и T20 пептиди, представени върху химерни HPV: HIV VLP, бяха допълнително характеризирани с анти-HIV-1 gp120 V3 и 2F5 моноклонални антитела in vitro чрез използване на Western blot и индиректен ELISA анализ. И накрая, имуногенността на HPV: HIV VLPs беше оценена в BALB/c мишки модел. Ние демонстрирахме, че химерни L1:P18I10 и L1:T20 VLP-базирани ваксини могат да индуцират HPV16- и HIV-1-специфични отговори на антитела, а химерните L1:P18I10 VLP могат да индуцират HPV16- и HIV{ {37}}специфични Т-клетъчни отговори при BALB/c мишки. Тъй като разработването и производството на имуногенна HPV: ваксина срещу ХИВ все още е непостижимо, това проучване предостави основна стратегия, която може да си струва да подкрепи глобалните усилия за разработване на нови химерни VLP-базирани ваксини за контролиране на HPV и HIV-1 инфекции.

2. Материали и методи

2.1. Конструиране на ваксинен щам BCG.HIVA2auxo.int

Рекомбинантен BCG експресиращ HIVA имуноген е конструиран преди това с помощта на E.coli-mycobacterial интегративен совалков вектор p2auxo.int. Конструкцията на Е. coli/микобактериален вектор, експресиращ HIVA антиген, беше описана по-рано [31–33]. BCG.HIVA2auxo.int се разрежда в PBS-Tween20 до 2 × 107 cfu/mL, обработва се с ултразвук, за да се разрушат бактериалните бучки, и се инокулира в задната хранителна подложка или BALB/c мишки (50 µL, 106 cfu/мишка).

Desert ginseng-Improve immunity (23)

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

2.2. Бактериални култури и трансформация

Клетките на глицин ауксотрофния щам на E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, USA), предоставени от д-р Pau Ferrer, бяха култивирани в минимална M9-производна среда (M9-D: Na2HPO4, 6,78 g/L; KH2PO4, 3 g/L; NaCl, {{10}}.5 g/L; NH4Cl, 1 g/L, глюкоза, 1{{20 }} g/L; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0.1 mmol/L; тиамин, 0.1 g/L; FeCl3, 0.{{56 }}25 g/L; AlCl3·6H2O, 0.13 mg/L; ZnSO4·7H2O, 2,6 mg/L; CoCl2·6H2O, 0.47 mg/L; CuSO4·H2O, 4,6 mg/L; H3BO3, 0.03 mg/L; MnCl2·4H2O, 4,2 mg/L; NiCl2·6H2O, 0,02 mg/L; Na2MoO4·2H2O, 0,06 mg/L) , допълнен с глицин (70 µg/mL). Е. coli M151Gly клетките се трансформират с p2auxo.HIVA плазмидите чрез електропорация. За тази цел културите на Е. coli се отглеждат до оптична плътност от 0,9 при 600 nm и се трансформират с помощта на Bio-Rad генен импулсен електропоратор при 2,5 kV, 25 µF и 200 Ω. Трансформираните клетки впоследствие се култивират върху M9-D агарови плаки (компоненти, както е описано по-горе, с добавен 1,5% бактоагар) без добавяне на глицин за селекция или с добавяне на глицин като контрола. Лизин ауксотрофният BCG щам, BCG∆lys, любезно предоставен от WR Jacobs Jr., BR Bloom и T. Hsu, беше трансформиран с p2auxo.HIVAint плазмидна ДНК чрез електропорация. Микобактериите се култивират в бульонна среда Middlebrook 7H9 или среда Middlebrook agar 7H10, допълнена с албумин-декстроза-каталаза (ADC; Difco), съдържаща 0,05% Tween 80. L-лизин монохидрохлорид (Sigma, Kawasaki, Япония) се разтваря в дестилирана вода и използван като добавка при крайна концентрация от 40 µg/mL. За трансформация, BCG се култивира до оптична плътност от 1,5 при 600 nm и се трансформира с помощта на Bio-Rad генен импулсен електропоратор при 2,5 kV, 25 µF и 1000 Ω. След това трансформантите се култивират върху среда с добавка на ADC Middlebrook агар 7H10, съдържаща 0.05% Tween 80 без добавка на лизин.

2.3. Клетъчни линии и клетъчна култура

Клетките 293F (Tibco), получени от 293 клетки на човешки ембрионален бъбрек (HEK), се култивират в експресионна среда FreeStyle 293 (Tibco), допълнена с 5 mL/L пеницилин-стрептомицин (Tibco) и се инкубират в инкубатор при 37 ◦C, съдържащ овлажнена атмосфера от 5% CO2 върху орбитална шейкър платформа, въртяща се със 125 rpm.

2.4. Производство на L1:P18I10 и L1:T20 протеини с помощта на 293F експресионна система

Конструкцията pCDNA3.1 съдържа L1:P18I10 или L1:T20 ДНК кодиращи последователности, съответстващи съответно на химерни L1:P18I10 и L1:T20 протеини. HIV-1 P18I10 CTL пептидът (RGPGRAFVTI) или Т20 пептидът (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) бяха вмъкнати в DE бримката на HPV16 L1 капсиден протеин. HPV16 L1 DE бримкова последователност, кодираща 130-136 аминокиселини, беше заменена или с P18I10I10, или с Т20 пептид. ДНК кодиращите последователности L1:P18I10 или L1:T20 бяха модифицирани с последователност на Kozak, оптимизирани с човешки кодон, оградени от местата на рестрикционните ензими на HindIII и XbaI, и клонирани в pcDNA3.1(+) вектор чрез използване на услуги за генен синтез на GeneArt ( Thermo Fisher, Waltham, MA, САЩ). Рекомбинантната плазмидна ДНК (pDNA) се трансформира в Е. coli DH5 компетентни клетки (Invitrogen) за амплификация и се екстрахира с помощта на плазмидни комплекти Maxi (QIAGEN, Hilden, Германия). Клетките 293F се култивират с 30 mL FreeStyle 293 експресионна среда в 125 mL Ерленмайерова колба (Corning, New York, NY, USA) до плътност 1.0 × 106/mL и временно се трансфектират с L1: P18I10 или L1: T20 pDNAs, използвайки разклонените полиетиленимин с MW 25 kDa (PEI-25K) (Polysciences) при оптимизирано съотношение на ДНК към PEI 1:3 (w/w) и ДНК към хранителна среда 1:1 (w/v), съгласно според инструкциите на производителя [35]. Клетките 293F се събират 96 часа след трансфекцията. Клетките 293F могат да достигнат плътност на сливане от 3,6 × 106 клетки/mL с приблизително 50% жизнеспособност.

2.5. Имунофлуоресцентно оцветяване

Клетките се пермеабилизират върху предметното стъкло със 100% студен ацетон. Впоследствие фиксираните клетки бяха изследвани с анти-HPV16 L1 антитялото CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, UK) и уловени с анти-миши IgG-FITC (Sigma). Имунооцветените клетъчни монослоеве бяха старателно промити с PBS и покрити с монтажна среда с DAPI (Abcam). Имунофлуоресцентните изображения бяха инспектирани под обърнат микроскоп при 40 × увеличение. Ефективността на трансфекцията се определя от съотношението на FITC (зелени)-положителни клетки към DAPI (сини)-оцветени клетки.

2.6. Пречистване на HPV: HIV (L1:P18I10 и L1:T20) VLPs

Общо 108 трансфектирани 293F клетки в 125 mL ерленмайерова колба (30 mL културална среда/колба) бяха събрани чрез центрофугиране при 1500 rpm за 5 минути и промити два пъти с PBS. Клетъчните пелети се ресуспендират в лизисен буфер, формулиран с 1% Triton X-100, протеазен инхибитор (1:100) (Millipore) и бензоназа (25 U/mL) (Millipore). Клетъчните лизати се избистрят с 0.45 цт PVDF филтър за спринцовка (Millipore). HPV: HIV (L1:P18I10 и L1:T20) VLP проби бяха серийно пречистени с помощта на катионен обмен (Capto SP ImpRes, GE, Бостън, Масачузетс, САЩ), изключване на размера (Capto Core 700, GE) и афинитет (HiTrap Heparin HP , GE) хроматография. Хроматографските протоколи бяха описани в нашите предишни проучвания [36,37] и следваха протокола на производителя [38]. L1 протеиновият сигнал във всеки етап на пречистване се характеризира чрез Western blot анализ и се изследва с анти-HPV16 L1 антитяло CAMVIR-1 [39].

2.7. Нередуцираща SDS-PAGE

HPV16 L1, L1:P18I10 и L1:T20 VLP бяха смесени с 2 × Laemmli буфер за проби (BIO-RAD) в отсъствие или присъствие на 5% (v/v) 2-меркаптоетанол ({{11} }ME) и реагира при стайна температура (RT) в продължение на 24 часа. Пробите бяха разделени с 8–16% TGX протеинови гелове без петна (BIO-RAD). След това геловете се прехвърлят в PVDF мембрани. Мембраните бяха изследвани с анти-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb при разреждане 1:4000. След това мембраните се инкубират с анти-миши IgG пероксидазен конюгат (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) при разреждане 1:4000. Сигналът беше разработен и визуализиран чрез хемилуминесценция, като се използва Western Blot ECL субстратен комплект (Bio-Rad, Hercules, СА, САЩ). Блот изображенията са получени чрез използване на системата за изображения Odyssey Fc.

2.8. Анализ на молекулна маса

HPV16 L1, L1:P18I10 и L1:T20 VLPs без 2-ME лечение бяха филтрирани през 1000 kDa прекъсване на молекулното тегло (MWCO) устройства за ултрафилтрация (SARTORIUS). HPV16 L1, L1:P18I10 и L1:T20 VLP с 2-ME лечение бяха прекарани през 100 kDa MWCO устройства за ултрафилтрация (Amicon). Ретентатите се възстановяват до първоначалния обем и се събират от резервоара за проби на филтърното устройство, докато филтратите се събират на дъното на центрофужната епруветка. Сигналът L1 се измерва чрез използване на точков блот, изследван с анти-HPV16 L1 mAb и открит чрез анти-миши IgG-пероксидазен конюгат (Sigma-Aldrich). Изображенията са получени с помощта на Odyssey Fc Imaging System при хемилуминесцентен канал.

Desert ginseng-Improve immunity

Ползи от Cistanche tubulosa- укрепване на имунната система

2.9. Отрицателно оцветяване и трансмисионна електронна микроскопия

След зареждане на покритите с въглерод медни решетки (Sigma-Aldrich) под ултравиолетова светлина в продължение на 5 минути, търговски HPV16 L1 (Abcam), пречистени L1:P18I10 и L1:T20 VLPs, уравновесени с 20 mM Tris-HCl (рН 7,4, 137 mM NaCl ) се абсорбират върху решетки за 1 минута и се изплакват три пъти с miliQ вода. HPV: HIV VLP бяха отрицателно оцветени с 2% уранил ацетат при рН 4,5 (Sigma-Aldrich) за 1 минута. Излишните оцветяващи агенти бяха отстранени с качествена филтърна хартия Whatman (Sigma-Aldrich). Решетките се поставят в камера за изсушаване най-малко 2 часа преди наблюдението. Изображенията бяха получени с помощта на трансмисионен електронен микроскоп (Tecnai Spirit 120 kV) при увеличение SA135K (100 nm) и SA59000 (200 nm), съответно.

2.10. Електрофореза с натриев додецил сулфат–полиакриламиден гел и Western blotting анализ

Равни количества (500 ng) от HPV16 L1 протеин (Abcam), пречистени L1:P18I10 и L1:T20 VLPs се смесват с 2 × Laemmli буфер за проби, съдържащ 5% 2-ME и се кипват при 95 ◦C за 5 минути . Пробите бяха разделени от 8–16% TGX Stain-свободни протеинови гелове и след това прехвърлени към PVDF мембрана (Millipore, Burlington, MA, USA) с помощта на полусухо трансферно устройство (Bio-Rad). Мембраната се блокира с 5% обезмаслено мляко в TBST. След това мембраните бяха изследвани с анти-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb при разреждане 1:4000, анти-HIV-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) при разреждане 1: 40 и HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) при разреждане съответно 1:4000. След това мембраните се инкубират с анти-миши IgG пероксидазен конюгат (Sigma-Aldrich) при разреждане 1:4000. Western ECL субстратен комплект (BIO-RAD) беше използван за развитие на сигнала. Блот изображенията бяха получени чрез използване на системата за изображения Odyssey Fc в хемилуминесцентен канал.

2.11. Имунизация на мишки, събиране на серуми и изолиране на спленоцити

Това е предварително проучване за доказване на концепцията за демонстриране на имуногенността на HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 и L1:T20 VLPs). Дозата, пътят на приложение и интервалът на първично усилване на нашите HPV: HIV VLPs се позовават на предишни проучвания, които имунизират мишки с говежди папиломен вирус (BPV): HIV VLPs за индуциране на отговори на антитела [20,21]. Пречистен HPV: HIV VLPs бяха емулгирани с равен обем (225 µg за всяка доза от 0,5 ml) алуминиев хидроксифосфат сулфат (Thermo Fisher), за да се осигури подобна формулировка на лицензираната ваксина Gardasil-9 HPV [40]. Всички групи мишки имат еднакво разпределение по пол (мъжки n=4 и женски n=4 на група). В групи А и В, BALB/c мишки бяха имунизирани интрамускулно (im) с 10 µg L1:P18I10 или L1:T20 VLPs, съответно, чрез следване на хомоложен първичен бустер режим. В група С мишките бяха инокулирани със 106 cfu от BCG.HIVA2auxo.int интрадермално (id, на хранителната подложка) и подсилени с 10 µg L1:P18I10 VLP интрамускулно. В група D мишките с положителна контрола бяха инокулирани с Gardasil- 9 prime, последвано от Gardasil-9 бустер интрамускулно с 10 µg HPV16 L1 VLPs. В група Е, отрицателни контролни мишки бяха имунизирани два пъти с PBS буфер. Интервалът на основно усилване беше 2 седмици. Мишките бяха умъртвени на ден 28. Кръвни проби бяха събрани от сърцата на мишките. Серумите се възстановяват чрез центрофугиране и се съхраняват при -20 ◦C за ELISA анализ. Миши далаци се отстраняват и се пресоват поотделно през клетъчна цедка (Falcon) с гумено бутало на спринцовка от 5 ml. След отстраняването на червените кръвни клетки с ACK лизиращ буфер (Lonza), спленоцитите се промиват и ресуспендират в лимфоцитна среда R10 (RPMI 1640, допълнена с 10% фетален телешки серум (FCS), пеницилин-стрептомицин, 20 mM HEPES и 15 mM {{ 46}}ME) при концентрация от 2 × 107 клетки/mL.

2.12. Имунособентен анализ, свързан с ензимите

За тестване на HPV16 L1- и HIV-1-специфични антитела, свързващи се с химерен HPV: HIV VLP конструкции in vitro, 50 µL с еднаква концентрация (200 ng/mL) рекомбинантен HPV16 L1 протеин (Abcam, ab119880 ), пречистени L1:P18I10 и L1:T20 VLPs в 50mM карбонат бикарбонатен буфер (рН=9.6) (Sigma) бяха 2-кратно серийно разредени и покрити върху Maxisorb плаките (Nunc). Плаките се инкубират при 4 ◦C за една нощ. Плаките се блокират с блокиращия буфер (5% обезмаслено мляко в TBST) при 37 ◦C за най-малко 2 часа. След двукратно промиване с TBST, покритите с VLP плаки се инкубират с анти-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb при разреждане 1:8000, 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) при разреждане 1:8000 и анти- HIV-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) при разреждане 1:40 в блокиращ буфер, съответно, при 37 ◦C за 2 часа. След промиване три пъти с TBST, плочите се инкубират с рекомбинантен протеин G пероксидазен конюгат (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) при разреждане 1: 4000 в блокиращ буфер при 37 ° С за 1 час. TMB се използва за разработване на сигнала от ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и се спира с 50 µL 2M H2SO4. Оптичната плътност (OD) на всяка ямка се измерва и записва при дължина на вълната от 450 nm с помощта на EL × 800 абсорбиращ четец на микроплаки.

За измерване на VLP-индуцираните антитела в BALB/c мишки, микротитърните плаки бяха покрити с 50 µL от 2 µg/mL рекомбинантен HPV16 L1 протеин (Abcam, ab119880), HIV-1 P18I10 пептид (NIBSC, ARP734), T20 пептид (NIBSC, ARP984), съответно, с 50 тМ карбонат-бикарбонатен буфер (рН=9.6). Плаките се инкубират при 4 ◦C за една нощ. Плаките се блокират с блокиращия буфер (5% обезмаслено мляко в TBST) при 37 ◦C за най-малко 2 часа. В същото време серуми, събрани от група AE имунизирани мишки, се разреждат с 5% обезмаслено мляко в TBST в съотношение 1:50. След двукратно промиване с TBST, плаките се инкубират с разредените серуми при 37 °C в продължение на 2 часа. След промиване три пъти с TBST, плаките се добавят с рекомбинантен протеин G HRP конюгат при разреждане 1: 4000 в блокиращ буфер и се инкубират при 37 ° С за 1 час. TMB се използва за разработване на ELISA сигнала и се спира с 50 µL 2M H2SO4. OD на всяка ямка се измерва при дължина на вълната 450 nm с помощта на EL × 800 абсорбиращ четец на микроплаки (Biotek).

2.13. IFN-ELISpot анализ

Анализът на ензимно-свързаното имунно абсорбиращо петно ​​(ELISpot) се извършва с помощта на търговски комплект миши IFN-ELISpot (Mabtech, Nacka Strand, Швеция), съгласно инструкциите на производителя. Плаките ELISpot (MSISP4510, 96-ямкови плаки с мембрани от поливинилиден дифлуорид, Millipore, Middlesex County, MA, САЩ) бяха третирани със 70% EtOH и покрити с пречистено моноклонално антитяло за улавяне на анти-миши интерферон (IFN-), разредено в фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) до крайна концентрация от 5 µg/mL при 4 ◦C за една нощ. След това към всяка ямка се добавят 2, 5 × 105 пресни спленоцити. Впоследствие клетките от групи А и В бяха стимулирани съответно с 2 µg/mL HPV16 L1 VLPs и HIV-1 P18I10 пептиди. Всички проби и контроли се поставят в двойни ямки. ELISpot анализите се инкубират в продължение на 16 часа при 37 ◦C, 5% CO2. След това плаките се промиват 5 пъти с PBS, инкубират се в продължение на 2 часа с биотинилирано анти-IFN-моноклонално антитяло (mAb), разредено в PBS 2% фетален телешки серум (FCS) до крайна концентрация от 2 µg/mL, промиват се 5 пъти в PBS и се инкубира с конюгата стрептавидин-алкална фосфатаза в PBS 2% FCS. След това плаките се промиват 5 пъти с PBS преди да се инкубират със 100 µL субстратен разтвор на 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP)/нитро син тетразолий (NBT) (Sigma-Aldrich , Сейнт Луис, Мисури, САЩ). След 5-10 минути плаките се промиват с чешмяна вода, изсушават се и получените петна се преброяват с помощта на четец ELISPOT (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Страсберг, Германия). За всяко животно средната стойност на фоновите отговори беше извадена индивидуално от всички ямки, за да се даде възможност за сравнение на IFN-спотно образуващи клетки (SFC)/106 между групите. За да се определят положителните отговори, прагът беше дефиниран като най-малко пет точки на ямка и отговорите, надвишаващи средния брой петна в ямките с отрицателна контрола плюс три стандартни отклонения на ямките с отрицателна контрола.

2.14. Статистически анализ

Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на софтуер Prism 6 GraphPad (CA, USA). Използвахме данни от експерименти, проведени върху 5 различни концентрации на покритие на ELISA плака (0, 50, 100, 150, 200 ng/mL) на рекомбинантен HPV16 L1 протеин (Abcam, ab119880) и HPV: HIV VLPs. Събрахме данни от 2 групи (HPV16 L1 и HPV: HIV VLP) и събрахме три повторения за всяка концентрация на покритие. Графиката в Prism показва данните като диаграма на разсейване, показваща концентрацията на покритието (ng/mL) по оста X и OD450 по оста Y. Тъй като предположихме, че нашите in vitro ELISA данни са свързани по линеен модел, извършихме линейния регресионен анализ и сравнихме наклоните на двете линии, за да потвърдим, че наборът от данни-1 и наборът от данни-2 (антитяло реактивност между HPV16 L1 и HPV: HIV VLPs) са различни по своите действия. Избрахме 95% доверителни интервали заедно с най-подходящата линия. Prism автоматично насложи линия на линейна регресия върху двата набора от данни и начерта пунктирана линия, представляваща 95% доверителни интервали. По време на линейния регресионен анализ софтуерът изчисли само средната Y стойност на нашия набор от данни, която показва, че е подходяща. Освен това Prism ни даде коментар, така че можем да заключим, че разликите между двата склона са изключително значителни.

Имахме 5 комплекта (ELISA) и 4 комплекта (ELISPOT) данни, събрани от експерименти с имунизация на мишки. Тези набори от данни имат еднакъв брой (мъжки n=4 и женски n=4) във всяка група. Използвахме Gardasil-9-имунизирани мишки като положителна контролна група и PBS-имунизирани мишки като отрицателна контролна група. Данните от нашите проектирани експерименти не съвпадат или се сдвояват. Предприехме еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA), за да видим дали тези средни са различни. Първо проверихме дали нашите данни отговарят на нормалното разпределение на Гаус. Установихме, че някои групи от данни в анализа ELISA не са преминали теста за нормално разпределение на Гаус. Затова проведохме непараметричен статистически анализ на тези данни. Обратно, всички групи от данни в анализа ELISPOT преминават теста за нормално разпределение на Гаус. По този начин извършихме параметричен статистически анализ на тези данни. Прагът на значимост и нивото на достоверност бяха зададени на 0.05 (еквивалентно на 95% доверителен интервал). p стойност, показваща като цяло вероятността да има разлики между групите. Тъй като основната ни грижа за този експеримент е какви са разликите между нашите групи, множеството сравнения в Prism ни дадоха резултата от сравнението във всички групи с всяка друга група.

2.15. Етични декларации

Мишки BALB/c на възраст от шест до осем седмици бяха закупени от Envigo (компания Inotiv, Чикаго, Илинойс, САЩ) и одобрени от местните власти (Generalitat de Catalunya, номер на проекта 11157) и Комитета по етика на Universitat Autònoma de Barcelona. Експериментите с животни са стриктно съобразени със законодателството за хуманно отношение към животните на Generalitat de Catalunya. Всички експерименти бяха одобрени от местния Комитет по етика на изследванията (Процедура 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).

3. Резултати

3.1. Дизайн на L1:P18I10 и L1:T20 имуногени и оценка на експресията на HPV: HIV протеин чрез използване на 293F експресионна система

Пептидът P18I10 от бримката на третия вариабилен домен на HIV-1 Env (V3) и пептидът Т20 от проксималната външна област (MPER) на мембраната на HIV-1 Env бяха вмъкнати в HPV16 L1 DE бримков протеин за генериране на химерен L1 :P18I10 и L1:T20 имуногени. Химерните L1:P18I10 и L1:T20 ДНК кодиращи последователности бяха клонирани в pcDNA3.1 (+) плазмиден ДНК експресионен вектор за преходна трансфекция в 293F клетки (Фигура 1А). Мономерните структури на HPV16 L1, химерни L1: P18I10 и L1: T20 капсидни протеини бяха предварително предсказани с помощта на сървъра на SWISS модел (Фигура 1B). Главен капсиден протеин L1 на HPV16 (7cn2.1.R) беше избран като структурен шаблон за изграждане на моделиране на хомоложност на HPV16 L1, L1:P18I10 и L1:T20 капсиден протеин. В сравнение с конформацията на свързания P18I10 пептид в предишното проучване [41], посоката на основната верига на N към C края на P18I10 пептида на нашия химерен L1:P18I10 протеин върви отдясно наляво (Фигура 1B, среден и горен панел), и експониращите P18I10 странични вериги биха могли потенциално да взаимодействат с Т клетъчни рецептори (Фигура 1B, среден и долен панел). В сравнение със структурата на HIV-1 фузионния инхибиторен пептид в предишната статия за преглед [42], вмъкнатият Т20 пептид върху HPV16 L1 капсиден протеин е представен като образуване, подобно на спирала (Фигура 1B, десен и горен панел ), а експониращите Т20 странични вериги биха могли потенциално да бъдат разпознати от В-клетъчните рецептори (Фигура 1В, десен и долен панел). Тъй като HPV16 L1 капсидните протеини могат хомогенно да се съберат в T=7 икосаедрична частица със 72 пентамерни капсомери [43], дисплеят с висока плътност на P18I10 или T20 пептиди към външната повърхност на химерните HPV: HIV VLPs е потенциално силно имуностимулиращо за индуциране на епитоп-специфични имунни отговори.

Figure 1. L1:P18I10 and L1:T20 immunogen design and construction of chimeric HPV: HIV VLPs by using 293F expression system. (A) The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 DNA coding sequences were cloned into pcDNA3.1+ expression vectors, respectively, for transient transfection in 293F cells. (B) Prediction of monomer structures of HPV16 L1 and chimeric HPV: HIV capsid proteins by using the SWISS-model server. HPV16 major capsid protein L1 (7cn2.1.R) was selected as the structural template to build the HPV16 L1 (left panel), L1:P18I10 (middle panel), and L1:T20 (right panel) capsid protein homology modeling. Secondary structural elements of HPV16 L1 capsid protein are labeled, with letters h1–h5 for the 5 α-helices. Loops of HPV16 L1 capsid protein between strands are labeled BC, CD, DE, EF, FG, and HI. Secondary structural elements of HIV-1 P18I10 and T20 peptides L1 are labeled by the arrows (top panel). The part of the P18I10 and T20 peptide that protrudes above the surface of the HPV16 L1 capsid protein is indicated by the arrows (bottom panel). (C) Immunofluorescence staining of L1 protein in 293F cells. The following pDNA.L1:P18I10 (left), pDNA.L1:T20 (middle), and pDNA.without insertion (right) were transfected in 293F cells. The transfected cells were probed with anti-HPV16 L1 mAb and detected with anti-mouse IgG-FITC (green channel). Cell nuclei were stained with DAPI (blue channel). Immunofluorescence images were merged by using Adobe Photoshop


Фигура 1. L1:P18I10 и L1:T20 имуногенен дизайн и конструиране на химерни HPV: HIV VLP чрез използване на 293F експресионна система. (A) Химерните L1:P18I10 и L1:T20 ДНК кодиращи последователности бяха клонирани съответно в pcDNA3.1+ експресионни вектори за преходна трансфекция в 293F клетки. (B) Прогноза на мономерни структури на HPV16 L1 и химерен HPV: HIV капсидни протеини чрез използване на SWISS-моделен сървър. HPV16 основен капсиден протеин L1 (7cn2.1.R) беше избран като структурен шаблон за изграждане на HPV16 L1 (ляв панел), L1:P18I10 (среден панел) и L1:T20 (десен панел) моделиране на хомология на капсиден протеин. Вторичните структурни елементи на капсидния протеин HPV16 L1 са означени с букви h1–h5 за 5 -спиралите. Примки на HPV16 L1 капсиден протеин между нишките са означени BC, CD, DE, EF, FG и HI. Вторичните структурни елементи на HIV-1 P18I10 и T20 пептидите L1 са обозначени със стрелките (горен панел). Частта от пептида P18I10 и T20, която стърчи над повърхността на капсидния протеин HPV16 L1, е показана със стрелките (долния панел). (C) Имунофлуоресцентно оцветяване на L1 протеин в 293F клетки. Следните pDNA.L1:P18I10 (вляво), pDNA.L1:T20 (в средата) и pDNA.без инсерция (вдясно) бяха трансфектирани в 293F клетки. Трансфектираните клетки бяха изследвани с анти-HPV16 L1 mAb и открити с анти-миши IgG-FITC (зелен канал). Клетъчните ядра се оцветяват с DAPI (син канал). Имунофлуоресцентните изображения бяха обединени с помощта на Adobe Photoshop

Тъй като терминалната последователност на HPV16 L1 протеин С медиира клетъчния ядрен импортиращ механизъм по време на инфекция [44], сигнали за ядрена локализация (NLS) на HPV16 L1 протеин са идентифицирани в предишни проучвания [45]. Моноклоналното антитяло CAMVIR-1 беше избрано за разпознаване на HPV16 L1 епитоп (GFGAMDF, 230–236 aa) [39] и базираното на флуоресцеин багрило FITC беше използвано като репортер за наблюдение на експресията на L1:P18I10 и L1: Т20 протеини. Изображенията на присъствие на имунофлуо ясно показват, че HPV16 L1 (в зелено) е локализиран главно в ядрата (в синьо) на 293F клетки. Не се наблюдава L1 сигнал в контролни плазмид-трансектирани 293F клетки (pcDNA3.1 плазмид без вмъкване) (Фигура 1С). Резултатите предполагат, че и химерните L1:P18I10 и L1:T20 капсидни протеини могат да бъдат експресирани чрез използване на полиетиленимин (PEI)-медиирана трансфекция и разпознати от HPV16 L1 CAMVIR-1 моноклонално антитяло.

3.2. Пречистване на L1:P18I10 и L1:T20 VLP чрез използване на хроматографски методи

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa и хетероложна долна лента<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

Figure 2. Purification and characterization of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Schematic process flowchart of L1:P18I10 and L1:T20 VLP purification by chromatography. (B, C) Western blot analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLP samples from each purification step. The signal of L1 in each purification step was characterized by Western blot analysis probed with anti-HPV16 L1 mAb. The arrow indicates the molecular weight of ~56 kDa of L1:P18I10 and ~58 kDa of L1:T20 proteins. Lane 1: clarified cell lysate (CCL); Lane 2: flow-through (FT) from cation exchange chromatography (CEC) sample loading; Lane 3: CEC eluate; Lane 4: FT from CEC 2M NaCl regeneration step; Lane 5: size exclusion chromatography (SEC) FT-1; Lane 6: SEC FT-2; Lane 7: FT from heparin affinity chromatography (H-AC) sample loading; Lane 8: H-AC eluate; Lane 9: FT from H-AC 2M NaCl regeneration step; Lane 10: 10-fold diafiltration.


Фигура 2. Пречистване и характеризиране на L1:P18I10 и L1:T20 VLPs. (A) Схематична блок-схема на процеса на L1:P18I10 и L1:T20 VLP пречистване чрез хроматография. (B, C) Western blot анализ на L1:P18I10 и L1:T20 VLP проби от всеки етап на пречистване. Сигналът на L1 във всеки етап на пречистване се характеризира чрез Western blot анализ, изследван с анти-HPV16 L1 mAb. Стрелката показва молекулното тегло от ~56 kDa на L1:P18I10 и ~58 kDa на L1:T20 протеини. Ивица 1: избистрен клетъчен лизат (CCL); Пътека 2: поток през (FT) от зареждане на проба от катионнообменна хроматография (CEC); Ивица 3: CEC елуат; Ивица 4: FT от етап на регенерация на CEC 2M NaCl; Ивица 5: хроматография с изключване по размер (SEC) FT-1; Пътека 6: SEC FT-2; Ивица 7: FT от зареждане на проба с хепарин афинитетна хроматография (H-AC); Ивица 8: H-AC елуат; Ивица 9: FT от етап на регенерация на H-AC 2M NaCl; Пътека 10: 10-сгъваема диафилтрация.

3.3. In vitro стабилност и самосглобяване на L1:P18I10 и L1:T20 VLPs

За да потвърдим, че пречистените HPV: HIV VLPs показват подобна in vitro стабилност на HPV16 L1 VLPs, ние извършихме нередуцираща SDS-PAGE, за да оценим дисулфидното омрежване на HPV: HIV капсидните протеини (Фигура 3A). Известно е, че pH, йонна сила, температура [52] и редокс среда всички корелират с дисулфидните връзки на HPV16 L1 капсидните протеини [53]. HPV L1 VLP са склонни да се самосглобяват при ниско pH и висока йонна сила. Максималното разглобяване на VLPs обикновено изисква излагане на висока концентрация на редуциращ агент, като 5% 2-меркаптоетанол (2-ME) за относително дълъг период от време [54]. В отсъствието на редуциращи агенти 2-ME, само малка част от HPV-16 протеина L1, L1:P18I10 и L1:T20 мигрира до мономери с привидно молекулно тегло (MW) от 55 kDa . Приблизително 70% от L1 протеините са дисулфидно свързани в по-големи димери или пентамери, с прогнозирана MW от 110 kDa и 280 kDa (Фигура 3A, пътеки 2, 4 и 6). Обратно, почти всички HPV-16 L1, L1:P18I10 и L1:T20 протеини в буфера за разглобяване изглеждат мономерни структури в нередуцираща SDS-PAGE (Фигура 3A, лента 3, 5 и 7). Тези резултати показват, че in vitro стабилността на пречистени L1:P18I10 и L1:T20 VLPs представя подобни модели на дисулфидно омрежване като HPV16 L1 VLPs при същото pH, йонна сила и термични условия. Пречистените VLP изглежда се разграждат до нивото на пентамери, тримери и димери след дългосрочно излагане на високи концентрации на редуциращи агенти. Тези данни са в съответствие с предишни проучвания [53,54] Въпреки това, разглобяването на HPV: HIV VLPs все още е далеч от завършване (мономери).

Figure 3. In vitro stability of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Disulfide cross-linking of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in non-reducing SDS-PAGE. The HPV16 L1 VLPs, purified L1:P18I10, and L1:T20 VLPs were mixed with Laemmli sample buffer in the absence or presence of 2-mercaptoethanol (2-ME), respectively, and analyzed by non-reducing SDS-PAGE. The position of the L1 monomer (55 kDa), L1 dimer (110 kDa), and L1 pentamer (280 kDa) are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 VLP; Lane 3: HPV16 L1 VLP treated with 2-ME; Lane 4: L1:P18I10 VLP; Lane 5: L1:P18I10 VLP treated with 2-ME; Lane 6: L1:T20 VLP; Lane 7: L1:T20 VLP treated with 2-ME. (B) Molecular mass analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. Assembled VLPs untreated with 2-ME (lanes 2, 4, and 6) were filtered out through 1000kDa molecular weight cutoff (MWCO) diafiltration devices (upper panel). Disassembled VLPs treated with 2-ME (lanes 3, 5, and 7) were filtered out through 100kDa MWCO centrifugal filter devices (lower panel). Retentates (R) were collected from filter device sample reservoirs, while the filtrates (F) were collected at the bottom of centrifuge tubes. The L1 protein signal was detected by using a dot blot probed with anti-HPV16 L1 mAb.


Фигура 3. In vitro стабилност на L1:P18I10 и L1:T20 VLPs. (A) Дисулфидно омрежване на L1:P18I10 и L1:T20 VLPs в нередуцираща SDS-PAGE. HPV16 L1 VLPs, пречистените L1:P18I10 и L1:T20 VLPs се смесват с буфер за проба на Laemmli съответно в отсъствие или присъствие на 2-меркаптоетанол (2-ME) и се анализират чрез нередуциране SDS-СТРАНИЦА. Позицията на L1 мономера (55 kDa), L1 димера (110 kDa) и L1 пентамера (280 kDa) са посочени със стрелка. Ивица 1: маркер за молекулно тегло на протеин; Ивица 2: HPV16 L1 VLP; Ивица 3: HPV16 L1 VLP, третиран с 2-ME; Пътека 4: L1:P18I10 VLP; Ивица 5: L1:P18I10 VLP, третиран с 2-ME; Пътека 6: L1:T20 VLP; Ивица 7: L1:T20 VLP, третиран с 2-ME. (B) Анализ на молекулна маса на L1:P18I10 и L1:T20 VLPs. Сглобени VLPs, нетретирани с 2-ME (ленти 2, 4 и 6) бяха филтрирани през 1000kDa устройства за диафилтрация с прекъсване на молекулното тегло (MWCO) (горен панел). Разглобени VLPs, третирани с 2-ME (пътеки 3, 5 и 7) бяха филтрирани през 100kDa MWCO центробежни филтърни устройства (долен панел). Ретентатите (R) се събират от резервоарите за проби на филтърното устройство, докато филтратите (F) се събират на дъното на центрофужните епруветки. Сигналът на L1 протеина беше открит чрез използване на точков блот, изследван с анти-HPV16 L1 mAb.

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) и бяха запазени в ретентати. Моделът съвпадаше с данните, които бяха наблюдавани в нередуциращ SDS-PAGE. Въпреки че всички VLP групи, третирани с 2-ME, са показани в мономерна лента (~55 kDa) в нередуциращата SDS-PAGE (Фигура 3A, лента 3, 5 и 7). Въпреки това, съответните редуцирани VLPs не бяха филтрирани през 100 kDa ултрафилтрационни мембрани (Фигура 3B, долен панел). Тези резултати предполагат, че химерните HPV: HIV протеини са способни да се самосглобяват до по-големи частици, но максималното разглобяване на VLPs в мономери изисква не само намаляване на дисулфидните връзки, но и други денатуриращи фактори, като рН или йонна сила.

3.4. Морфологична характеристика на L1:P18I10 и L1:T20 VLPs

Трансмисионна електронна микроскопия (TEM) беше използвана за изследване на морфологичната конформация на HPV16 L1 и HPV: HIV VLPs. Пептидите HIV-1 P18I10 и T20 бяха вмъкнати съответно в DE бримки на HPV16 L1 протеин. Тези търговски HPV16 L1 и химерни HPV: HIV капсидни протеини могат спонтанно да се самосглобяват in vitro в интегрални VLPs в диаметър приблизително 50–60 nm (Фигура 4A–C, десен панел). В сравнение с електронни микрографии на HPV16 L1 VLPs, публикувани в предишни проучвания [55,56], икосаедричната структура на HPV16 L1, L1:P18I10 и L1:T20 VLPs тук е по-малко контрастна и неясна. Може да се дължи на реагента за отрицателно оцветяване, който използвахме в това изследване. В нашето скорошно проучване, публикувано в предишно проучване [37] и друга текуща статия в процес на партньорска проверка (данните не са показани), имаме добро качество и разделителна способност на електронни микрографии, когато L1:P18I10 VLPs, получени от дрожди и бакуловирус (същите химерни конструкт) бяха уравновесени в PBS и отрицателно оцветени с фосфоволфрамова киселина (PTA). Тъй като използвахме различните системи за производство и пречистване на VLP в това изследване, L1: P18I10 и L1: T20 VLPs, получени от клетки на бозайници, бяха уравновесени с Tris-HCl и отрицателно оцветени с уранил ацетат. Въпреки че електронните микрографии могат да бъдат подобрени, все още можем да наблюдаваме ясен модел, че повечето от HPV16 L1, L1: P18I10 и L1: T20 капсидния протеин могат да се сглобят самостоятелно в морфологични VLP под TEM екран (Фигура 4A–C, ляв панел ). По принцип HPV VLP са защитени срещу агрегация в условия с високо съдържание на сол [57]. Някои от откриваемите агрегации на HPV16 L1 и HPV: HIV VLPs в Tris-HCl буфер с ниско съдържание на сол могат да се видят при по-ниско увеличение (Фигура 4A–C, ляв панел). От тези резултати заключихме, че модификацията на частична L1 DE последователност на бримка чрез вмъкване на HIV-1 P18I10 или T20 пептиди не повлиява значително морфологията на HPV: HIV VLPs.

Figure 4. Electron micrographs of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Morphology of HPV16 VLPs. (B) Morphology of L1:P18I10 VLPs. (C) Morphology of L1:T20 VLPs. Purified VLPs were absorbed on UV-charged carbon-coated copper grids, and negatively stained with 2% uranyl acetate. Images were acquired under transmission electron microscopy. The bar represents 200 nm at magnification 59,000 (left panel) and 100 nm at magnification 135K (right panels), respectively


Фигура 4. Електронни микрографии на L1:P18I10 и L1:T20 VLPs. (A) Морфология на HPV16 VLPs. (B) Морфология на L1:P18I10 VLPs. (C) Морфология на L1:T20 VLPs. Пречистените VLPs се абсорбират върху медни решетки с UV-заредено покритие и се оцветяват отрицателно с 2% уранил ацетат. Изображенията са получени чрез трансмисионна електронна микроскопия. Лентата представлява съответно 200 nm при увеличение 59,000 (ляв панел) и 100 nm при увеличение 135K (десни панели)

3.5. Представяне и реактивност на епитопите на HPV-16 и HIV-1 

За да се потвърди, че последователни HIV-1 P18I10 или 2F5 епитопи са представени в хроматографски пречистени L1:P18I10 или L1:T20 VLPs, бяха извършени Western blot анализ и индиректен ELISA с използване на епитоп-специфични mAbs. Избрахме добре познато моноклонално антитяло (mAb), обозначено като CAMVIR-1, за разпознаване на силно запазения епитоп (GFGAMDF, aa 230–236) на HPV16 L1 протеин [39,58]. По-рано публикувано mAb, насочено към HIV-1 gp120 V3 бримков епитоп (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322), беше избрано за откриване на последователни P18I10 епитопи (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59]. От друга страна, широкото неутрализиращо антитяло (bnAb), разпознаващо епитоп на HIV-1 gp41 2F5 (ELDKWA) срещу голямо разнообразие от лабораторни щамове на HIV-1, беше избрано за характеризиране на пептида Т20 [ 60,61]. Western blot анализ, изследван с HPV16 L1 mAb, показва ленти 55, 56 и 58 kDa, съответстващи съответно на HPV16 L1, L1:P18I10 и L1:T20 протеин (Фигура 5A, B, вляво). Молекулното тегло (MW) на L1:P18I10 протеина е подобно на HPV16 L1 протеина (Фигура 5А, вляво). Лентата, съответстваща на L1:T20 протеин, се наблюдава малко по-висока от HPV16 L1 протеина, както е предвидено от допълнителната аминокиселинна последователност (Фигура 5B, вляво). Лентите от приблизително 56 и 58 kDa, съответстващи на L1:P18I10 и L1:T20 протеин, бяха открити в Western blot анализ, изследван съответно с анти-HIV-1 gp120 V3 и 2F5 mAb (Фигура 5A, B, вдясно ). Смятахме, че молекулното тегло (MW) на анти-2F5-оцветения L1:T20 протеин е правилно и отговаря на очакваните 58 kDa (Фигура 5B, вдясно). Въпреки това, MW на анти-HIV-1 gp120 V3-оцветен L1:P18I10 протеин е малко по-нисък (Фигура 5A, вдясно). Това може да се дължи на хетерогенната структура на химерните L1: P18I10 протеини. Тъй като конформацията на последователния епитоп може да бъде загубена при денатуриращо състояние в SDS-PAGE. Следователно, ние допълнително извършихме индиректен ELISA, за да демонстрираме конформационния P18I10 пептид, правилно представен на нашите химерни L1: P18I10 VLPs (Фигура 5E). От друга страна, антитялото анти-HIV-1 gp120 V3 примка, което използвахме, разпозна цялата примка HIV-1 V3, а не епитопа P18I10. Следователно, общият анти-V3 сигнал беше по-нисък (Фигура 5A, B, десни панели). Въпреки това, тези резултати показват, че последователните HIV-1 P18I10 и T20 пептиди са представени в HPV: HIV VLPs.

Figure 5. Presentation of HPV-16 and HIV-1 epitopes. (A, B) Sequential epitope detection of chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were analyzed by Western blot, using anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 and 2F5 mAb. The HPV16 L1 VLPs were used as a control. The molecular weight of the L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa), and L1:T20 (58 kDa) proteins are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 protein; Lane 3: L1:P18I10 protein; Lane 4: L1:T20 protein. (C, D) Binding of HPV16 L1 mAb to chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (E) Binding of anti-HIV-1 gp120 V3 mAb to chimeric L1:P18I10 VLPs. (F) Binding of HIV-1 2F5 mAb to chimeric L1:T20 VLPs. The line graph of indirect ELISAs was performed to detect the conformational epitopes of recombinant HPV16 L1, L1:P18I10, and L1:T20 VLPs bound to anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 or 2F5 mAbs, respectively. Data are representative of three independent experiments. A simple linear regression test was done to compare the line difference of purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs with the standard curve of commercial L1 VLPs; ns: not significant; ** p < 0.01.


Фигура 5. Представяне на HPV{1}} и HIV-1 епитопи. (A, B) Последователно откриване на епитоп на химерни L1:P18I10 и L1:T20 VLP. Пречистените L1:P18I10 и L1:T20 VLPs бяха анализирани чрез Western blot, използвайки анти-HPV16 L1, анти-HIV-1 gp120 V3 и 2F5 mAb. HPV16 L1 VLP бяха използвани като контрола. Молекулното тегло на протеините L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) и L1:T20 (58 kDa) е показано със стрелка. Ивица 1: маркер за молекулно тегло на протеин; Ивица 2: HPV16 L1 протеин; Ивица 3: L1:P18I10 протеин; Ивица 4: L1:T20 протеин. (C, D) Свързване на HPV16 L1 mAb към химерни L1:P18I10 и L1:T20 VLP. (E) Свързване на анти-HIV-1 gp120 V3 mAb към химерни L1:P18I10 VLP. (F) Свързване на HIV-1 2F5 mAb към химерни L1:T20 VLP. Линейната графика на индиректни ELISAs беше извършена за откриване на конформационните епитопи на рекомбинантни HPV16 L1, L1:P18I10 и L1:T20 VLPs, свързани съответно с анти-L1, анти-HIV-1 gp120 V3 или 2F5 mAbs. Данните са представителни за три независими експеримента. Беше направен прост линеен регресионен тест, за да се сравни разликата в линията на пречистени L1:P18I10 и L1:T20 VLPs със стандартната крива на търговски L1 VLPs; ns: незначителен; ** p < 0,01.

Освен това, за да определим дали HIV{{{{50}}}} конформационни епитопи, представени на HPV: HIV VLPs могат да бъдат идентифицирани чрез gp120 V3 и 2F5 неутрализиращи антитела in vitro, направихме индиректен ELISA анализ, за ​​да проверим епитоп-свързващата специфичност и реактивност. Както е показано на Фигура 5C, D, HPV16 L1, L1:P18I10 и L1:T20 VLP се разпознават от анти-L1 mAb. Извършихме линеен регресионен анализ, за ​​да сравним наклона на всяка линия на разреждане. Резултатите разкриват, че L1 епитоп-свързващата специфичност на L1:P18I10 или L1:T20 VLPs не се различава от HPV16 L1 VLPs. Освен това, анти-HIV-1 gp120 V3 mAb успя да свърже L1:P18I10 VLPs, но не и HPV16 L1 VLPs (Фигура 5E). В допълнение, 2F5 mAb може да разпознае L1:T20 VLPs, но не и HPV16 L1 VLPs (Фигура 5F). След линеен регресионен анализ, разликата в gp120 V3 епитоп-свързващата специфичност между L1:P18I10 и HPV16 L1 беше изключително значима (p <0,01%). 2F5 епитоп-свързващата специфичност на L1:T20 VLPs е значително различна от HPV16 L1 VLPs (p <0,01%). Този модел разкри, че хидрофобните клетъчни липиди не са необходими за свързването на 2F5-неутрализиращи антитела към HPV: HIV VLP in vitro. Въпреки че реактивността на анти-HIV-1 gp120 V3 и 2F5 неутрализиращи антитела към HPV: HIV VLP е сравнително лека, свързването на анти-HIV-1 gp120 V3 и 2F5 mAb към HPV: HIV VLP е значително епитоп-специфичен.

3.6. Имуногенност на L1:P18I10 и L1:T20 VLPs след BALB/c имунизация на мишки

Ние оценихме HPV16- и HIV-1-специфичните имунни отговори след имунизация на BALB/c мишки с L1:P18I10 и L1:T20 VLP. Имунизационният график е показан на Фигура 6А. Тъй като индуцираната от VLP имуногенност след мукозно приложение обикновено е по-слаба, отколкото след системно приложение, мишките са имунизирани интрамускулно с една шеста от дозата Gardasil-9 HPV16 L1 [22,62]. Алуминиевият хидроксифосфат сулфат адювант за доза (10 µg/100 µL) от химерни HPV: HIV VLPs беше коригиран до същата концентрация (1 mg/1 mL) като Gardasil-9. За да се оцени половата разлика в резултатите от ваксинацията, беше оценено сравнение на отговорите на антитялото между мъжки (n=4) и женски (n=4) мишки. В групата на L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP и Gardasil-9 отговорите на анти-HPV16 L1 антитела на женски мишки са били средно по-високи от тези на мъжките мишки (Фигура 6B). 2 от 4 (50%) L1:P18I10 VLP-имунизирани женски, 3 от 4 (75%) L1:T20 VLP-имунизирани женски и всички (100%) Gardasil имунизирани женски мишки предизвикват по-висок титър на анти-L1 антитела отколкото мъжките мишки. Анти-L1 отговорите, предизвикани от женски мишки в групата на Gardasil-9, са значително по-високи от мъжките мишки (p=0.0041) (Фигура 6B). Много ниско ниво на отговори на анти-L1 антитела беше открито в групата на BCG.HIVA прайминг и L1:P18I10 VLP усилване. Този модел съответства на предишни констатации, описващи, че BCG индуцира предимно Т-клетъчни отговори, а не продукция на IgG [63].

Figure 6. Induction of humoral immune responses by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A) All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Groups A and B: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 or L1:T20 VLPs intramuscularly (i.m.); Group C: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group D: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group E: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Sera were collected and diluted at a titer of 1:50 for ELISA assay. (B) HPV L1-specific IgG in male and female mice. (C–E) Epitope-specific IgG induced by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. ELISA was performed to analyze anti-L1, anti-P18I10, and anti-T20 IgG induced by BALB/c mice following different prime-boost combinations as described above. Data are shown as mean ± S.D. One-way ANOVA (nonparametric) test was done to compare differences between groups. OD: opticaldensity. Ns not significant; ** p < 0.01


Фигура 6. Индукция на хуморални имунни отговори от L1:P18I10 и L1:T20 VLPs в BALB/c мишки. Имунизационният график е изобразен в (A) Всички групи мишки имат еднакво разпределение по пол (мъжки n=4 и женски n=4). Групи A и B: хомоложна първична усилваща имунизация с 10 µg L1:P18I10 или L1:T20 VLP интрамускулно (im); Група C: първично с 106 cfu rBCG.HIVA интрадермално (id) и подсилване с 10 µg L1:P18I10 VLPs im; Група D: хомоложна първична усилваща ваксинация с Gardasil-9, съдържаща 10 µg HPV16 L1 VLPs im; Група Е: двукратна имунизация с PBS буфер. Интервалът на основно усилване беше 2 седмици. Крайната точка на това изпитване беше ден 28. Серумите бяха събрани и разредени при титър 1:50 за ELISA анализ. (B) HPV L1-специфичен IgG при мъжки и женски мишки. (C–E) Епитоп-специфичен IgG, индуциран от L1:P18I10 и L1:T20 VLP. ELISA беше извършен за анализиране на анти-L1, анти-P18I10 и анти-T20 IgG, индуцирани от BALB/c мишки след различни комбинации за първично усилване, както е описано по-горе. Данните са показани като средна стойност ± SD Еднопосочен ANOVA (непараметричен) тест е направен за сравняване на разликите между групите. OD: оптична плътност. Ns не е значимо; ** p < 0,01

Ние оценихме дали мишки, имунизирани с L1: P18110 и L1: T20 VLP, могат да индуцират HPV-16 L1-специфични и HIV-1 епитоп-специфични антитела в BALB/c мишки. Индуцираните от VLP IgG антитела в миши серуми се измерват чрез ELISA, покрити съответно с рекомбинантен HPV16 L1 протеин, P18I10 или Т20 пептиди. Статистическа разлика в L1-специфичния IgG при серумен титър 1:50 беше открита в групата на Gardasil-9 в сравнение с контролната група на PBS (p=0.0039). Анти-L1 отговорите сред Gardasil-9, L1:P18I10 и L1:T20 VLP-имунизирани мишки са сходни и не се различават значително (Фигура 6C). BCG.HIVA2auxo.int първични и L1:P18I10 VLP усилващи мишки предизвикват много ниско ниво на анти-L1 IgG. Тези резултати предполагат, че HPV: HIV VLP-имунизирани мишки произвеждат същото ниво на анти-L1 IgG като Gardasil-9-имунизирани мишки (Фигура 6C). Въпреки че L1: P18I10 VLP групата числено изглежда има тенденция към по-високо ниво на P18I10 епитоп-специфичен IgG в сравнение с други имунизационни групи, тези разлики не са статистически значими (Фигура 6D). При някои от L1:P18I10 VLP-имунизирани мишки (4 от 8, 50%) са наблюдавани по-високи анти-P18I10 свързващи антитела в сравнение с Gardasil-9-имунизирани мишки. Като алтернатива, анализ на Т-теста разкрива, че разликата между L1:P18I10 VLP и групата Gardasil-9 е значителна (p=0.005) (данните не са показани). В групата на L1:T20 VLP беше открит значително по-висок отговор на антитела срещу пептида T20 в сравнение с групата на Gardasil-9 (p=0.0083). Както се очакваше, анти-T20 титрите бяха неоткриваеми в Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP и BCG.HIVA първични, комбинирани с L1:P18I10 VLP усилващи групи (Фигура 6E). Титърът на Т20 пептид-специфичното антитяло е относително нисък. Това вероятно се дължи на: (1) Т20 е субдоминантен пептид; (2) предизвикването на MPER или 2F5 неутрализиращи антитела изисква пептидно-липидни конюгати (Фигура 6E). Като цяло, нашите резултати показаха, че L1:P18I10 и L1:T20 VLPs могат да индуцират HPV16-, но слаби HIV-1-специфични отговори на антитела при мишки.

Desert ginseng-Improve immunity (2)

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

За да оценим HPV и HIV-специфичните Т-клетъчни имунни отговори при мишки, ние следвахме схемата за имунизация, показана на Фигура 7А. В допълнение, хетероложно BCG.HIVA2auxo.int имунизиране и усилване на L1:P18I10 VLPs беше сравнено с хомоложна L1:P18I10 VLP първична и усилваща имунизация, за да се оцени честотата на специфични HPV16 и HIV-1 Т-клетъчни имунни отговори. Няма разлики между групите Gardasil-9 и PBS по отношение на секрецията на IFN след спленоцитна стимулация с HPV16 L1 VLP. Разликите в L1- специфичната IFN-секреция също не са значими между L1:P18I10 VLP и групите Gardasil-9. Ние заключихме, че слабата L1-специфична IFN-секреция може да се дължи на ниската концентрация (2 µg/mL) на HPV16 L1 VLPs, използвани като стимули. Групата с първичен BCG.HIVA2auxo.int и L1:P18I10 VLP усилване индуцира по-висока честота на IFN-секретиращи спленоцити и се наблюдават значителни разлики в IFN-секрецията в сравнение с мишки, ваксинирани с Gardasil-9 група (p {{36 }}.0103). 3 от 8 мишки (~38%) са предизвикали най-високите L1- специфични IFN-отговори (Фигура 7B). Това може да се дължи на неспецифичната адювантност на BCG според нашите предишни проучвания [64–66]. Очевидният първичен ефект, дори от дивия тип BCG, е в съответствие със способността на rBCG производните да действат като мощни адюванти за последващи усилващи ваксини [64,65]. По отношение на HIV-1-специфичните Т-клетъчни отговори, най-високата обща величина на IFN-спотно образуващи клетки (SFC)/106 спленоцити се наблюдава при праймирани мишки с BCG.HIVA2auxo.int в сравнение с мишки, получаващи Gardasil{{54} } ваксини или L1:P18I10 VLP. Мишки, имунизирани с BCG.HIVA и подсилени с L1:P18I10 VLPs, предизвикват значително по-висока секреция на IFN в сравнение с мишки, ваксинирани с L1:P18I10 VLP хомоложно първично усилване (p=0.0268). В допълнение, значително по-висока секреция на IFN се наблюдава при мишки, ваксинирани с L1:P18I10 VLP, в сравнение с мишки, получаващи ваксини Gardasil-9 (p=0.0157) (Фигура 7C). Както се очакваше, секрецията на IFN беше неоткриваема в групите Gardasil-9 и PBS. Тези резултати показват, че (1) L1:P18I10 VLP предизвикват HIV-1-специфични Т-клетъчни имунни отговори; (2) L1:P18I10 VLP предизвикват HPV-специфични Т-клетъчни имунни отговори и (3) BCG.HIVA2auxo.int може да засили HIV-1-специфичните Т-клетъчни имунни отговори, предизвикани от L1:P18I10 VLP.

Figure 7. Induction of HPV16 and HIV-1 specific T cell responses by chimeric L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A). All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Group A: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 VLPs intramuscularly (i.m.); Group B: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group C: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group D: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Splenocytes were isolated for IFN-γ ELISpot assay. T-cell immune responses to HPV16 and HIV-1 were assessed ex vivo by IFN-γ ELISpot after splenocyte stimulation with HPV16 L1 VLP and P18I10 peptide. (B, C) HPV16 L1- and HIV-1 P8I10-specific T-cell responses elicited by L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA prime combined with L1:P18I10 VLP boost. Data are shown as median ± S.D. A one-way ANOVA test was done to compare differences between groups. Ns not significant; * p < 0.05.


Фигура 7. Индукция на HPV16 и HIV-1 специфични Т клетъчни отговори от химерни L1:P8I10 VLPs и BCG.HIVA в BALB/c мишки. Имунизационният график е изобразен в (A). Всички групи мишки имат еднакво разпределение по пол (мъжки n=4 и женски n=4). Група A: хомоложна първична усилваща имунизация с 10 µg L1:P18I10 VLP интрамускулно (im); Група B: първично с 106 cfu rBCG.HIVA интрадермално (id) и подсилване с 10 µg L1:P18I10 VLPs im; Група C: хомоложна първична усилваща ваксинация с Gardasil-9, съдържаща 10 µg HPV16 L1 VLPs im; Група D: двукратна имунизация с PBS буфер. Интервалът на основно усилване беше 2 седмици. Крайната точка на това изпитване беше на ден 28. Спленоцитите бяха изолирани за IFN-ELISpot анализ. Т-клетъчните имунни отговори към HPV16 и HIV-1 бяха оценени ex vivo чрез IFN-ELISpot след спленоцитна стимулация с HPV16 L1 VLP и P18I10 пептид. (B, C) HPV16 L1- и HIV-1 P8I10-специфични Т-клетъчни отговори, предизвикани от L1:P8I10 VLPs и BCG.HIVA първичен комбиниран с L1:P18I10 VLP усилване. Данните са показани като медиана ± SD. Направен е еднопосочен ANOVA тест за сравняване на разликите между групите. Ns не е значимо; * р <0,05.

4. Дисвъзглавница

Както HPV16, така и ХИВ-1 са болести, предавани по полов път, и в момента са в центъра на много проучвания за ваксини. Въпреки че HPV профилактичните ваксини са комерсиализирани и предаването на ХИВ-1 е силно контролирано от антиретровирусно лечение (АРТ) и PrEP, ефективна, безопасна и достъпна химерна HPV: ХИВ ваксина срещу двата вируса е спешна нужда. В това изследване (1) ние демонстрирахме, че 293F експресионната система и хроматографският метод за пречистване могат да бъдат възможни подходи за производство и пречистване на химерни L1:P18I10 и L1:T20 VLPs; (2) ние потвърдихме, че вмъкването на P18I10 или T20 пептиди в DE бримката на HPV16 L1 капсидни протеини не повлиява in vitro стабилността, самосглобяването и морфологията на химерни HPV: HIV VLPs; (3) Последователните и конформационни P18I10 или T20 пептиди, изложени на DE бримки на химерен HPV: HIV VLP могат да бъдат открити чрез анти-HIV-1 gp120 V3 и 2F5 неутрализиращи антитела in vitro; (4) Химерните L1:P18I10 и L1:T20 VLP могат да предизвикат HPV, но слаби HIV-1-специфични свързващи антитела в BALB/c мишки. Освен това, вмъкването на HIV-1 P18I10 или T20 пептиди в HPV16 L1 протеин не повлиява HPV16 L1-специфична индукция на антитела in vivo; (5) L1:P18I10 VLP могат да индуцират както HPV16, така и HIV-1-специфични Т-клетъчни отговори; (6) BCG.HIVA първично и L1:P18I10 VLP усилване предизвика най-високата величина на IFN-продуциращи спленоцити в сравнение с L1:P18I10 VLPs хомоложно първично усилване в BALB/c мишки. Тези констатации подкрепиха по-нататъшното разработване на HIV-1 ваксини, базирани на rBCG и химерни HPV: HIV VLPs. Като цяло, това проучване предоставя основна стратегия, която може да бъде достойна за подкрепа на глобалните усилия за разработване на нови химерни VLP-базирани ваксини за контролиране на HPV и HIV инфекции.

В това проучване L1:P18I10 и L1:T20 VLP могат да индуцират същото ниво на анти-HPV16 L1 свързващи антитела като HPV ваксината Gardasil-9. Въпреки това, L1:P18I10 и L1:T20 VLPs предизвикват само ниски нива на P18I10 и T20 епитоп-специфични отговори на HIV-свързващи антитела. Ние предположихме, че това може да се дължи на плаките за анализ ELISA, покрити съответно с рекомбинантен HPV16 L1 протеин, HIV-1 P18I10 пептид и HIV-1 T20 пептид. Мишите анти-L1 антитела, индуцирани от нашите L1:P18I10 и L1:T20 VLP, могат да се насочат към множество свързващи епитопи на L1 протеин. Обратно, миши анти-HIV-1 антитела, предизвикани от нашите L1:P18I10 и L1:T20 VLPs, са насочени само към един HIV пептид (P18I10 или T20) върху HPV: HIV VLPs. Следователно общите максимални стойности на OD450 на анти-HIV-1 свързващите антитела са много по-ниски от тези на анти-HPV16 L1 антителата.

Причината, поради която избрахме HPV16 L1 капсиден протеин DE бримка като предварителен регион на вмъкване на HIV-1 имуноген, се отнася до предишно проучване, което имунизира мишки с говежди папиломен вирус (BPV): HIV VLPs за индуциране на отговори на антитела [20]. Известно е, че епитопите, разположени в експонираните на повърхността DE и FG бримки на основните капсидни протеини на HPV L1, доминиращо допринасят за индуцираните от ваксината кръстосано неутрализиращи антитела [67]. Освен това е показано от предишни проучвания, че вмъкването на HIV-1 MPER в BPV L1 DE веригата може да индуцира частично неутрализиращи антитела, които специфично разпознават нативната конформация на MPER в HIV-1 Env [20]. Въпреки това, няма данни, които показват дали рекомбинантният BPV L1:MPER VLP влияе върху имуногенността и неутрализацията срещу BPV след вмъкване на HIV-1 MPER в BPV L1 протеин. В нашето проучване, използващо HPV16 L1 VLPs като вектор за доставяне на HIV антиген, наблюдавахме, че вмъкването на HIV-1 пептид не е модифицирало HPV L1 структурата и че химерните HPV: HIV протеини все още притежават капацитета да образуват VLPs. В допълнение, ние проведохме концепцията за имунобост, за да демонстрираме сравними имунни отговори между HPV: HIV VLP кандидат (наш) и одобрена VLP базирана HPV ваксина (лицензирана Gardasil-9). Нашите данни разкриха, че вмъкването на HIV-1 P18I10 или T20 пептид в химерен HPV: HIV VLP може да предизвика подобен титър на HPV16 L1-специфични свързващи антитела, в сравнение с HPV Gardasil-9 ваксина. Типоспецифичните анти-HPV16 L1 свързващи антитела, наблюдавани с лицензирана HPV Gardasil-9 VLP ваксина в сравнение с химерните версии на HPV Gardasil-9 VLP ваксина, са в съответствие с нашите данни.

Дължината и мястото на оптималния HIV-1 чужд антиген, включен в HPV16 L1 VLPs и in vitro стабилността на получения химерен HPV: HIV VLPs трябва да бъдат проверени преди имунизиране на мишки. Нашето текущо проучване показа, че вмъкването на P18I10 или T20 пептиди в HPV16 L1 протеин не повлиява in vitro стабилността, самосглобяването и морфологията на химерни HPV: HIV VLPs. Тези резултати са в съответствие с предишни проучвания, показващи, че вмъкването на HIV-1 MPER домейн в BPV L1 DE последователността на бримката не е повлияло на способността на BPV L1 капсидния протеин да се самосглобява към VLP [20]. По принцип епитопите, разположени в експонираните на повърхността DE и FG бримки на HPV L1 капсидните протеини, доминантно допринасят за индуцирането на L1-специфични кръстосано неутрализиращи антитела [67]. Тук демонстрирахме, че вмъкването на HIV-1 P18I10 или T20 пептиди в HPV16 L1 DE веригата не повлиява индукцията на L1-специфично антитяло от химерни HPV: HIV VLP след имунизация на мишки. В допълнение, HIV-1 P18I10 или T20 епитопите върху HPV16 DE бримки на химерен HPV: HIV VLPs бяха открити in vitro и бяха имуногенни in vivo. HPV16 L1 VLP представляват потенциално скеле за повърхностно показване на епитопа на HIV-1, който представлява интерес. В това проучване ние извършихме индиректен ELISA, за да демонстрираме конформационния P18I10 и T20 пептид, представен на повърхността на нашите химерни HPV: HIV VLPs. В бъдеще имунната електронна микроскопия може също да бъде допълнителен подход за демонстриране на P18I10 или T20 антигенна структурна локализация и организация в HPV: HIV VLPs.

Самосглобяването е представителен показател за in vitro стабилността на HPV16 L1 VLP. Известно е, че pH, йонна сила, температура [52] и редокс среда всички корелират с дисулфидните връзки на HPV16 L1 капсидните протеини [53]. По-ранните разработки върху VLPs на папиломавирус предполагат значението на дисулфидните връзки за самосглобяването на главния капсид L1 [68,69]. Образуването на дисулфид показва по-висок цистеин на L1 капсиден протеин в подходяща геометрия [53]. Тези дисулфидни кръстосани връзки свързват остатъци 175 и 428 (за HPV16), които стабилизират HPV вирионите и VLP [70]. В това проучване ние анализирахме модели на междумолекулно дисулфидно кръстосано свързване като косвено доказателство, за да докажем, че нашите L1:P18I10 и L1:T20 капсидни протеини са склонни да се самосглобяват in vitro. На Фигура 3A демонстрирахме, че пречистените L1:P18I10 и L1:T20 VLPs представят подобни междумолекулни дисулфидни омрежващи модели като HPV16 L1 VLPs при същото pH, йонна сила и термични условия. На фигура 3B, ние допълнително демонстрирахме, че пречистените L1: P18I10 и L1: T20 протеини са способни да се самосглобяват до по-големи частици (по-големи от L1 пентамер MW 280 kDa) in vitro. Следователно, заедно с модела на морфологично самосглобяване на VLP (въпреки че икосаедричната структура не беше съвсем добра), наблюдаван на Фигура 4, заключихме, че нашите пречистени химерни HPV: HIV VLPs са стабилни in vitro. Освен стабилността на VLP трябва да се имат предвид много други критични фактори, които биха могли да повлияят на имуногенността на химерния HPV: HIV VLPs, като място на вмъкване на имуноген сред различни бримки на VLPs [71], доза, интервали на първично усилване и път на приложение [22] и т.н.

Пептидите P18I10, получени от HIV-1 gp120 V3 бримка, се представят в HIV-инфектираните клетки от основния комплекс за хистосъвместимост (MHC-I) клас I молекули [26]. CD8+, цитотоксични Т лимфоцити (CTL), могат да разпознаят MHC-I-ограничени P18I10 антигени и да отделят различни цитокини, като IFN- за елиминиране на HIV-инфектирани клетки [72–75]. Рекомбинантната вирусна или плазмидна ДНК са добри носители на ваксина за експресиране на P18I10 пептиди в клетки гостоприемници и индуциране на P18I10-специфични клетъчни отговори чрез MHC-I пътя [76–79]. Например, комбиниран режим на усилване на ДНК първичен и модифициран ваксиниа вирус Ankara (MVA) беше достатъчен за индуцирането на IFN- и CTL отговори срещу епитопа P18I10 [79]. Напротив, екзогенните P18I10 пептиди не се представят ефективно на CD8+ Т-клетките чрез MHC-I пътя [80,81] и изискват участието на подходящи адюванти [82–85] или антигенни носители, като напр. VLPs. Например, имуногенността на синтетични P18I10 пептиди, допълнени с адюванти, е незначителна поради липсата на Т-хелперни детерминанти [82–85]. По-рано беше съобщено, че HIV-1 Gag VLPs [86], VLPs на хепатит B повърхностен антиген (HBsAg) [87], VLPs на парвовирус VP2 [88] и VLPs на папиломавирус L1 [17–19] могат да действат като доставящи вектори за MHC-I-ограничено представяне на CTL епитоп in vivo. Въпреки че механизмът на VLP-индуцирани MHC-I-ограничени Т-клетъчни отговори все още е неясен, структурата на частиците на VLPs може да благоприятства ендоцитното поглъщане на макрофаги или дендритни клетки, като по този начин достига до цитозола и впоследствие навлиза в типичен MHC-I път [89, 90]. Освен това се наблюдава, че MHC-I-ограничената детерминанта P18I10 индуцира CD4+ хелперни Т-клетъчни отговори чрез MHC-II път [91,92]. Хибридните BPV1 L1 VLP могат да се използват като антигенни епитопни носители за предизвикване на терапевтични вирус-специфични CTL отговори чрез MHC-I и MHC-II пътища [17,19], осигурявайки обещаваща стратегия за дизайна на ваксината за контрол на вирусна инфекция. Някои ранни проучвания също показват BPV L1 VLPs, експресиращи HPV16 E7 епитоп или P18I10 епитоп на HIV-1 gp120 V3 индуцирана от бримка лигавични повърхности, както и системен VLP епитоп-специфичен хуморален и Т-клетъчен имунитет [18]. В съответствие с предишни проучвания, ние предварително демонстрирахме, че нашите химерни HPV: HIV (L1: P18I10) VLP могат да индуцират HIV-специфични Т-клетъчни имунни отговори в BALB/c мишки след спленоцитна стимулация с P18I10 пептид. В допълнение, праймирането на BCG.HIVA усилва HIV-1-специфичните Т-клетъчни имунни отговори при мишки. Въпреки това, многофункционалните Т-клетъчни имунни отговори, индуцирани от L1: P18I10 VLP, ще се нуждаят от допълнителни имунологични изследвания.

По-широките CD8+ Т-клетъчни отговори срещу множество запазени CTL епитопи са полезни за преодоляване на генетичното разнообразие на HIV-1 и бягство [7,93–100]. Рационалният дизайн на HIV-1 Т-клетъчни имуногени, като HIVA, трябва да има потенциала да реагира на множество CTL епитопи [34]. HIV-1 HIVA имуногенът, проектиран от д-р Tomas Hanke, е съставен от HIV-1 Gag протеин с пълна дължина, комбиниран с множество CTL епитопи, включително P18I10 епитопи в С-края [34]. ДНК, MVA и rBCG бяха избрани като HIVA имуногенни носители и индуцираха висока величина и широчина на CTL епитоп-специфични клетъчни отговори чрез използване на хетероложни първични усилващи режими в модели на мишки и нечовекоподобни примати (NHP) [34,101]. Нашите предишни проучвания показаха, че BCG.HIVA prime в комбинация с MVA.HIVA усилва предизвиква HIV-1-специфични IFN-продуциращи CD8+ Т-клетки в BALB/c мишки [31–33,102]. Интересно е, че VLP могат да бъдат потенциален бустер за увеличаване на HIV-специфичните клетъчни отговори при хетероложна имунизация с rBCG [29,30] или ДНК ваксини [103,104]. Например, rBCG, експресиращ HIV-1 Gag протеин, може ефективно да подготви Т-клетъчната имунна система за усилване с Gag VLPs в NHP модели [29,30]. В настоящото проучване ние демонстрирахме, че праймирането на BCG.HIVA може да засили Т-клетъчните имунни отговори, индуцирани от HPV: HIV (L1:P18I10) VLP. Ще проучим допълнително степента на полифункционалните CD4+, CD8+ и Т-клетъчните отговори на паметта, генерирани от този rBCG първичен и VLP усилващ режим.

Cistanche deserticola-improve immunity -

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

В момента нашата изследователска група се фокусира върху разработването на обещаващи rBCG: ХИВ ваксини, експресиращи нови ХИВ{0}} Т-клетъчни имуногени, като tHIVconsvX и HIVACAT (HTI) Т-клетъчен имуноген, за подобряване на ХИВ-1 съвпадение на варианта и широчина на Т-клетъчния отговор. Имуногените от 2-ро поколение HIVconsvX са проектирани чрез предефиниране на запазените региони от група М и използване на двувалентен мозаечен дизайн, за да се увеличи максимално съответствието на потенциалните 9-mer Т-клетъчни епитопи във ваксината с глобалните варианти [64]. HTI имуногенът е проектиран да покрива Т-клетъчни цели, срещу които Т-клетъчните отговори се наблюдават предимно при HIV-1-инфектирани индивиди с нисък HIV-1 вирусен товар [65,66]. Тъй като е доказано, че папиломните VLP са носители на множество CTL епитопи [17], ние имахме за цел да конструираме химерни HPV16 L1 VLP, носещи множество запазени HIV-1 CTL епитопи в комбинация с rBCG, експресиращи ThivconsvX или HTI Т-клетъчни имуногени, за да индуцират по-широк CTL имунен отговор срещу HIV-1. Високата плътност и множеството копия на HIV-1 CTL епитопа, представени върху химерен HPV: HIV VLP могат да подобрят доставката на антиген към имунната система и да индуцират по-висока честота на CTL отговори. Обратно, рекомбинантният BCG е по-вероятно да генерира по-ниска честота на CTL отговори поради бавна репликация in vivo. Тъй като BCG има ясно изразено влияние върху диференциацията на Т клетките, което означава, че BCG може да индуцира памет на CD8+ Т клетки чрез участието на CD4+ Т-хелперни клетки [105], това имуногенно свойство може да направи BCG подходящ като иницииращ агент в хетероложни режими на първично усилване. По този начин очаквахме, че нашите HPV: ХИВ VLPs може да изглеждат обещаващ бустер за увеличаване на величината и обхвата на ХИВ-1 CTL отговорите при праймиране с рекомбинантен BCG, експресиращ нов HIV-1 Т-клетъчен имуноген .

Пептидът Т20 съдържа силно запазен линеен епитоп 2F5 (ELDKWA). Съобщава се, че антитялото 2F5, събрано от дългосрочно инфектирани с HIV пациенти, има широко неутрализираща ефикасност [106,107]. MPER на gp41 се счита за слабо имуногенен, вероятно свързан с местоположението му близо до клетъчния и вирусния фосфолипиден двоен слой [108]. Използването на ДНК вектори, представящи MPER в липидна среда, е полезно за индуциране на gp41-специфични nAbs [109–111]. Например HIV-1 T20-кодиращите ДНК ваксини, проектирани от д-р Britta Wahren, са демонстрирали, че индуцират кръстосани реакции на неутрализиращи антитела (nAb) [109]. Обратно, много ранни опити за индуциране на nAbs, насочени към gp41, чрез използване на стратегии за ваксина с пептид или субединица, са се провалили [112–116]. Напоследък някои проучвания показват, че BPV L1 VLPs, експресиращи 2F5 епитоп или MPER на HIV-1 gp41 индуцирани 2F5-специфични антитела при мишки, са довели до кръстосана неутрализация [20,21]. Подобен модел на имуногенност беше открит, когато повърхностният антиген на хепатит В (HBsAg) беше слят с HIV-1 2F5 епитоп или MPER [59,117–119]. Тук демонстрирахме, че представянето на HIV-1 T20 и P18I10 пептид в нашия химерен HPV16 L1 VLP може да индуцира отговори на антитела срещу HIV-1 и HPV16. Неутрализиращи епитопи, стабилизирани върху конформационно скеле, като HIV-1 функционални шипове или VLPs, биха могли да бъдат основното течение на В-клетъчния имуногенен дизайн за постигане на широки неутрализиращи антитела (bnAbs) [93]. Въпреки това, повечето нови bnAb епитопи (приблизително 90%) са непостоянни и съставляват региони, обединени в 3-измерни конфигурации [120]. Въпреки че представянето на прекъснати епитопи върху протеиново скеле може да бъде предсказано чрез изчислително моделиране [121], тези bnAb епитопи могат да бъдат предизвикани да бъдат вградени в необвито HPV16 L1 протеиново скеле. Обратно, малка част от HIV-1 B-клетъчни имуногени, като MPER (2F5) на HIV-1 gp41 или V3 бримка (P18IIB) на gp120, съдържат линейни неутрализиращи епитопи и може да са подходящи за HPV: HIV протеинов гръбнак. Следователно, ние избрахме линейния 2F5 неутрализиращ епитоп, който е включен в разширен Т20 пептид на HIV-1 MPER по отношение на благоприятната структура за образуване на -спирала [122]. Т20 пептидите могат да бъдат слети и стабилизирани върху L1 капсидни скелета, за да предизвикат неутрализиращи реакции на антитела, ако може да бъде представена естествената конфигурация на 2F5 епитопа. В това проучване открихме, че 2F5 nAbs са свързани с химерни HPV: HIV (L1:T20) VLP in vitro. Освен това L1:T20 VLP могат също да индуцират T20-специфични свързващи антитела в BALB/c мишки. Имаше все повече доказателства, че индуцираните от HIV-1 фузионен пептид (T20) антитела имат подобни свойства като анти-HIV-1 фузионния пептид Enfuvirtide за свързване на хидрофобния трансмембранен T20 остатък, разположен в MPER на gp41 по време на ХИВ-1 се слива и допринася за вирусния контрол [109,123,124]. Според нашите предишни рецензии, рационалният дизайн на химерни VLP-базирани ваксини за индуциране на HPV и HIV-специфични неутрализиращи антитела и CTL отговори винаги трябва да се разглеждат по отношение на селекция на имуноген, вектори за доставяне на антиген и режими на основно усилване. В заключение, това проучване показа алтернативна експресионна платформа на базата на клетки от бозайници и мащабируем хроматографски метод за пречистване за конструиране на химерни HPV: HIV VLP. Считаме, че нашите нови методи за пречистване ще помогнат за възстановяването на антигенни HPV: HIV VLPs от клетки на бозайници с цел намаляване на времето, разходите и труда, като същевременно увеличим капацитета за промишлено производство. Освен това, ние демонстрирахме HPV16 L1 VLPs могат да работят като платформа за доставяне за пренасяне на HIV-1 пептиден антиген, тъй като вмъкването на P18I10 или T20 пептиди в DE бримката на HPV16 L1 капсидни протеини не повлиява in vitro стабилността, самосглобяването и морфологията на химерните HPV: HIV VLP и не пречат на индуцирането на HPV16 L1-специфични антитела in vivo. От друга страна, химерните HPV: HIV VLP могат да предизвикат HPV16 и HIV-специфични В и Т-клетъчни имунни отговори срещу двата вируса. Този доклад изследва възможността за разработване на HIV-1 ваксини на базата на рекомбинантни BCG, експресиращи HIV-1 имуногени и HPV: HIV VLPs, които могат да се използват за детска имунизация срещу HIV-1. Тъй като разработването на ефективна химерна ваксина срещу HPV16 и ХИВ -1 все още е предизвикателство, тази работа допринася за стъпка към разработването на новата ваксина на базата на химерна HPV: HIV VLP платформа за контролиране на HPV16 и ХИВ{{118 }} инфекция, която е спешно необходима в развиващите се и индустриализираните страни.

Препратки

1. Глобална статистика на UNAIDS за ХИВ и СПИН-2018 Информационен лист. 2019 г. Налично онлайн: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (достъп на 15 юни 2020 г.).

2. Baeten, JM PrEP за ХИВ: Степен A за доказателства, но в очакване на въздействие. Нац. преп. Урол. 2019, 16, 570–571. [CrossRef]

3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Chiu, J.; Парис, Р.; Премсри, Н.; Namwat, C.; Де Соуза, М.; Адамс, Е.; et al. Ваксинация с ALVAC и AIDSVAX за предотвратяване на HIV-1 инфекция в Тайланд. Н. англ. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [CrossRef]

4. Нгуни, Т.; Часара, С.; Ndhlovu, ZM Основни научни препятствия в разработването на ваксина срещу ХИВ: Историческа перспектива и бъдещи насоки. Преден. Immunol. 2020, 11, 590780. [CrossRef]

5. Robinson, HL ваксини срещу ХИВ/СПИН: 2018 г. Клин. Pharmacol. Там. 2018, 104, 1062–1073. [CrossRef]

6. Wang, Q.; Zhang, L. Широко неутрализиращи антитела и дизайн на ваксина срещу HIV-1 инфекция. Преден. Med. 2020, 14, 30–42. [CrossRef]

7. Колинс, ДР; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ Т клетки в контрола, лечението и превенцията на ХИВ. Нац. Rev. Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]

8. Полард, Ей Джей; Bijker, EM Ръководство за ваксинология: От основни принципи до нови разработки. Нац. Rev. Immunol. 2021, 21, 83–100. [CrossRef]

9. Shapiro, SZ Уроци за общи ваксинологични изследвания от опити за разработване на ваксина срещу ХИВ. Vaccine 2019, 37, 3400–3408. [CrossRef]

10. Ахмед, Х.Г.; Bensumaidea, SH; Алшамари, FD; Аленази, FSH; ALmutlaq, BA; Алтуркстани, MZ; Aladani, IA Разпространение на човешки папиломен вирус подтипове 16 и 18 сред йеменски пациенти с рак на маточната шийка. Asian Pacific J. Cancer Prev. 2017, 18, 1543–1548. [CrossRef]

11. Олсезе, Вирджиния; Чен, Й.; Schlegel, R.; Yuan, H. Характеризиране на HPV16 L1 бримкови домейни при образуването на тип-специфичен, конформационен епитоп. BMC Microbiol. 2004, 4, 29. [CrossRef]

12. Dupuy, C.; Buzoni-Gate, D.; Touze, A.; Le Cann, P.; Bout, D.; Coursaget, P. Клетъчно-медииран имунитет, индуциран при мишки от HPV 16 L1 вирусоподобни частици. Microb. Патоген. 1997, 22, 219–225. [CrossRef] [PubMed]

13. Шилер, Й.; Lowy, D. Обяснения за високата ефективност на HPV профилактичните ваксини. Vaccine 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]

14. Марковиц, LE; Schiller, JT Ваксини срещу човешки папиломен вирус. J. Инфектирайте. дис. 2021, 224, S367–S378. [CrossRef] [PubMed]

15. Чен, CW; Сауби, Н.; Joseph-Munné, J. Концепции за проектиране на ваксини срещу HIV-1 на базата на вирусоподобни частици. Преден. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]

16. Ето, Й.; Сауби, Н.; Ферер, П.; Джоузеф, Дж. Проектиране на ваксини, базирани на частици, подобни на химерни вируси, за човешки папиломен вирус и ХИВ: Научени уроци. СПИН Rev. 2019, 21, 218–232. [CrossRef]

17. Liu, WJ; Лиу, XS; Zhao, KN; Leggatt, GR; Frazer, IH Папиломавирус вирусоподобни частици за доставяне на множество цитотоксични Т клетъчни епитопи. Вирусология 2000, 273, 374–382. [CrossRef]

18. Лю, XS; Абдул-Джабар, И.; Qi, YM; Frazer, IH; Zhou, J. Мукозна имунизация с частици, подобни на вируса на папиломавирус, предизвикват системен и мукозен имунитет при мишки. Вирусология 1998, 252, 39–45. [CrossRef]

19. Пенг, С.; Frazer, IH; Фернандо, GJ; Zhou, J. Папиломавирусните вирусоподобни частици могат да доставят дефинирани CTL епитопи към пътя на MHC клас I. Вирусология 1998, 240, 147–157. [CrossRef]

20. Джай, Й.; Zhong, Z.; Зарифард, М.; Копие, GT; Qiao, L. Говежди папиломавирус-подобни частици, представящи запазени епитопи от мембранно-проксималната външна област на HIV-1 gp41 индуцирани мукозни и системни антитела. Vaccine 2013, 31, 5422–5429. [CrossRef]

21. Джан, Х.; Huang, Y.; Фаяд, Р.; Копие, GT; Qiao, L. Индуциране на лигавични и системни неутрализиращи антитела срещу вирус на човешка имунна недостатъчност тип 1 (HIV-1) чрез орална имунизация с говежди папиломен вирус-HIV-1 gp41 химерни вирусоподобни частици. J. Virol. 2004, 78, 8342–8348. [CrossRef]

22. Сяо, SL; Wen, JL; Конг, Нова Зеландия; Юе, HL; Leggatt, G.; Frazer, IH Пътят на приложение на химерен BPV1 VLP определя характера на индуцираните имунни отговори. Immunol. Cell Biol. 2002, 80, 21–29. [CrossRef]

23. Кирнбауер, Р.; Тауб, ДЖАНЕТ; Грийнстоун, ХЕДЪР; Роден, РИЧАРД; Дюрст, М.; Gissmann, L.; Lowy, DR; Schiller, JT Ефективно самосглобяване на човешки папиломен вирус тип 16 LI и L1-L2 във вирусоподобни частици. J. Virol. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]

24. Джао, К.; Потър, CS; Carragher, B.; Lander, G.; Sworen, J.; Таун, В.; Абрахам, Д.; Дънкан, П.; Washabaugh, MW; Sitrin, RD Характеризиране на вирусоподобни частици в GARDASIL® чрез криотрансмисионна електронна микроскопия. тананикам Ваксини Immunother. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]

25. Achour, A.; Lemhammedi, S.; Picard, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrim, Z.; Уилър, А.; Beix, F.; Бърни, А.; Zagury, D. Цитотоксични Т лимфоцити, специфични за HIV-1 gp160 антиген и синтетичен P18IIIB пептид в HLA-A11-имунизирано лице. СПИН Res. тананикам Ретровируси 1994, 10, 19–25. [CrossRef]

26. Накагава, Й.; Кикучи, Х.; Takahashi, H. Молекулярен анализ на TCR и взаимодействието пептид/МНС, използвайки пептиди, получени от P18-I10-, с единично D-аминокиселинно заместване. Biophys. J. 2007, 92, 2570–2582. [CrossRef]

27. Qiu, Z.; Chong, H.; Яо, X.; Su, Y.; Cui, S.; Той, Y. Идентифициране и характеризиране на суб-джоб на N-тримера на HIV-1 Gp41: Последици за вирусно навлизане и лекарствена цел. Помощи 2015, 29, 1015–1024. [CrossRef]

28. Питърс, BS; Чейнсонг-Попов, Р.; Калоу, Д.; Foxall, R.; Patou, G.; Ходжкин, К.; Weber, JN Пилотно проучване фаза II на безопасността и имуногенността на HIV p17/p24:VLP (p24-VLP) при асимптоматични HIV серопозитивни субекти. J. Инфектирайте. 1997, 35, 231–235. [CrossRef]

29. Чеге, ГК; Бъргърс, Вашингтон; Stutz, H.; Майерс, AE; Чапман, Р.; Кираву, А.; Бунджун, Р.; Shephard, EG; Якобс, WR; Рибицки, Е.П.; et al. Стабилен имунитет към Auxotrophic Mycobacterium bovis BCG-VLP Prime-Boost кандидат за ХИВ ваксина в нечовешки модел на примати. J. Virol. 2013, 87, 5151–5160. [CrossRef]

30. Чеге, ГК; Томас, Р.; Shephard, EG; Майерс, А.; Bourn, W.; Williamson, C.; Maclean, J.; Сив, CM; Рибицки, Е.П.; Уилямсън, Алабама Режим на имунизация с основно усилване, използващ рекомбинантни BCG и Pr55gag вирусоподобни ваксини с частици, базирани на ХИВ тип 1 подтип С, успешно предизвиква Gag-специфични отговори при бабуини. Vaccine 2009, 27, 4857–4866. [CrossRef]

31. Джоузеф, Дж.; Сауби, Н.; Im, EJ; Фернандес-Льорис, Р.; Гил, О.; Кардона, PJ; Gatell, JM; Ханке, Т. Ваксинирането на новородени мишки с BCG.HIVA222 + MVA.HIVA подобрява HIV-1-специфичните имунни отговори: Влияние на възрастта и пътищата на имунизация. Clin. Dev. Immunol. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]

32. Сауби, Н.; Геа-Майорки, Е.; Ферер, П.; Hurtado, C.; Sánchez-Úbeda, S.; Eto, Y.; Gatell, JM; Ханке, Т.; Joseph, J. Проектиране на нов дизайн на микобактериална ваксина за ХИВ-ТБ педиатрична ваксина, векторизирана от лизин ауксотроф на BCG. Mol. Там. Методи Clin. Dev. 2014, 1, 14017. [CrossRef]

33. Махант, А.; Сауби, Н.; Eto, Y.; Китара, Н.; Gatell, JM; Ханке, Т.; Joseph, J. Предклинично развитие на BCG.HIVA2auxo.int, съдържащо интегративен експресионен вектор, за ХИВ-ТБ педиатрична ваксина. Подобряване на стабилността и специфичния HIV-1 Т-клетъчен имунитет. тананикам Ваксини Immunother. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]

34. Ханке, Т.; McMichael, AJ Проектиране и конструиране на експериментална ХИВ-1 ваксина за едногодишно-2000 клинично изпитване в Кения. Нац. Med. 2000, 6, 951–955. [CrossRef] [PubMed]

35. Durocher, Y.; Perret, S.; Камен, А. Производство на рекомбинантен протеин на високо ниво и с висока производителност чрез преходна трансфекция на човешки 293-EBNA1 клетки, растящи в суспензия. Nucleic Acids Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]

36. Ким, HJ; Ким, SY; Лим, SJ; Ким, JY; Лий, SJ; Kim, HJ Едноетапно хроматографско пречистване на човешки папиломен вирус тип 16 L1 протеин от Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr. Пуриф. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]

37. Ето, Й.; Сауби, Н.; Ферер, П.; Joseph-Munné, J. Експресия на химерен HPV-HIV протеин L1P18 в pichia pastoris; пречистване и характеризиране на вирусоподобните частици. Pharmaceutics 2021, 13, 1967. [CrossRef]

38. GE. Използването на CaptoTM Core 700 и Capto Q ImpRes при пречистването на подобни на човешки папилома вирус частици. J. Asia's Pharm. Biopharm. Ind. 2014, 1–4.

39. Маклийн, CS; Чърчър, MJ; Meinke, J.; Smith, GL; Хигинс, Г.; Стенли, М.; Minson, AC Производство и характеризиране на моноклонално антитяло към човешки папиломен вирус тип 16 с помощта на рекомбинантен ваксиниа вирус. J. Clin. Патол. 1990, 43, 488–492. [CrossRef]

40. Merck Canada Inc. Продуктова монография Gardasil®. произв. Моногр. Monopril Prod. Моногр. 2015, 1–71.

41. Achour, A.; Persson, K.; Harris, RA; Sundbäck, J.; Сентман, CL; Lindqvist, Y.; Schneides, G.; Kärre, K. Кристалната структура на H-2D(d) MHC клас I в комплекс с получен от HIV-1- пептид P18-110 при разделителна способност 2,4 Å: Последици за Т клетки и NK клетки признание. Имунитет 1998, 9, 199–208. [CrossRef]

42. Панг, У.; Том, SC; Zheng, YT Текущи пептидни инхибитори на сливане тип -1 на HIV. Антивирусна. Chem. Chemother. 2009, 20. [CrossRef]

43. Чен, XS; Гарсеа, RL; Голдбърг, И.; Casini, G.; Harrison, SC Структура на малки вирусоподобни частици, сглобени от L1 протеин на човешки папиломен вирус 16. Mol. Cell 2000, 5, 557–567. [CrossRef] [PubMed]

44. Ден, следобед; Weisberg, AS; Томпсън, CD; Hughes, MM; Панг, YY; Lowy, DR; Schiller, JT Човешки папиломен вирус 16 Капсиди посредничат за навлизане на ядро ​​по време на инфекция. J. Virol. 2019, 93, e00454-19. [CrossRef]

45. Джоу, Дж.; Doorbar, J.; Слънце, XY; Crawford, LV; Маклийн, CS; Frazer, IH Идентифициране на сигнала за ядрена локализация на човешкия папиломен вирус тип 16 L1 протеин. Вирусология 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Vlps, A.; Миделберг, APJ; Lua, LHL Биообработка на вирусоподобни частици: Предизвикателства и възможности. Pharm. Биопроцес. 2013, 1, 407–409.

47. Bousarghin, L.; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Положително заредени последователности на човешки папиломен вирус тип 16 капсидни протеини са достатъчни, за да опосредстват генния трансфер в целевите клетки чрез рецептора на хепаран сулфат. J. Gen. Virol. 2003, 84, 157–164. [CrossRef]

48. Сасагава, Т.; Пушко, П.; Steers, G.; Gschmeissner, SE; Насър Хаджибагери, MA; Финч, Дж.; Crawford, L.; Tommasino, M. Синтез и сглобяване на вирусоподобни частици от човешки папиломавируси тип 6 и тип 16 в дрожди на делене Schizosaccharomyces pombe. Вирусология 1995, 206, 126–135. [CrossRef]

49. Бимелт, С.; Sonnewald, U.; Galmbacher, P.; Willmitzer, L.; Müller, M. Производство на човешки папиломен вирус тип 16 вирусоподобни частици в трансгенни растения. J. Virol. 2003, 77, 9211–9220. [CrossRef]

50. Захин, М.; Joh, J.; Khanal, S.; Husk, A.; Мейсън, Х.; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Милър, DM; Матоба, Н.; Jenson, AB Мащабируемо производство на HPV16 L1 протеин и VLPs от тютюневи листа. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [CrossRef]

51. Айрес, Калифорния; Cianciarullo, AM; Carneiro, SM; Вила, LL; Бокардо, Е.; Pérez-Martinez, C.; Перес-Арелано, И.; Оливейра, MLS; Ho, PL Производство на вирусоподобни частици от човешки папиломен вирус тип 16 L1 от рекомбинантни клетки на Lactobacillus casei. Приложение Environ. Microbiol. 2006, 72, 745–752. [CrossRef]

52. Shank-Retzlaff, ML; Zhao, Q.; Anderson, C.; Хам, М.; Високо, К.; Нгуен, М.; Wang, F.; Wang, N.; Wang, B.; Wang, Y.; et al. Оценка на термичната стабилност на Gardasil®. тананикам Ваксина. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

53. Mukherjee, S.; Thorsteinsson, MV; Джонстън, LB; ДеФилипс, Пенсилвания; Zlotnick, A. Количествено описание на in vitro сглобяване на човешки папиломен вирус 16 вирусоподобни частици. J. Mol. Biol. 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]

54. Маккарти, MP; Уайт, Уисконсин; Palmer-Hill, F.; Кьониг, С.; Suzich, JA Количествено разглобяване и повторно сглобяване на човешки папиломен вирус тип 11 вирусоподобни частици in vitro. J. Virol. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]

55. Кирнбауер, Р.; Буй, Ф.; Cheng, N.; Lowy, DR; Schiller, JT Папиломен вирус L1 основен капсиден протеин се самосглобява във вирусоподобни частици, които са силно имуногенни. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 1992, 88, 12180–12184. [CrossRef]

56. Пател, MC; Patkar, KK; Басу, А.; Мохандас, KM; Mukhopadhyaya, R. Производство на вирусоподобни частици, получени от имуногенен човешки папиломен вирус-16 основен капсиден протеин. Indian J. Med. Рез. 2009, 130, 213–218.

57. Ши, Л.; Sanyal, G.; Ni, A.; Луо, З.; Дошна, С.; Wang, B.; Греъм, TL; Wang, N.; Volkin, DB Стабилизиране на частици, подобни на вируса на човешкия папиломен вирус, чрез нейонни повърхностноактивни вещества. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538–1551. [CrossRef]

58. Картър, Джей Джей; Wipf, GC; Бенки, С.Ф.; Christensen, ND; Galloway, DA Идентификация на тип 16-специфичен епитоп на човешкия папиломен вирус върху С-терминалното рамо на основния капсиден протеин L1. J. Virol. 2003, 77, 11625–11632. [CrossRef]

59. Von Brunn, A.; Бранд, М.; Reichhuber, C.; Morys-Wortmann, C.; Deinhardt, F.; Schdelt, F. Основният неутрализиращ домен на HIV-I е силно имуногенен, когато се експресира върху повърхността на сърцевината на хепатит В. Vaccine 1993, 11, 817–824. [CrossRef]

60. Денисън, SM; Анасти, К.; Scearce, RM; Sutherland, L.; Паркс, Р.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Горни, МК; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; et al. Неутрализиращите HIV-1 gp41 Envelope Cluster II човешки моноклонални антитела показват полиреактивност за свързване с фосфолипиди и протеинови автоантигени. J. Virol. 2011, 85, 1340–1347. [CrossRef]

61. Тркола, А.; Kuster, H.; Rusert, P.; Joos, B.; Фишер, М.; Leemann, C.; Манрике, А.; Хубер, М.; Рер, М.; Оксениус, А.; et al. Забавяне на възстановяването на HIV-1 след прекратяване на антиретровирусната терапия чрез пасивен трансфер на човешки неутрализиращи антитела. Нац. Med. 2005, 11, 615–622. [CrossRef]

62. Шанк-Рецлаф, М.; Wang, F.; Морли, Т.; Anderson, C.; Хам, М.; Браун, М.; Роуланд, К.; Панцари, Г.; Зорман, Дж.; Нисък.; et al. Корелация между ефикасността при мишка и относителната ефикасност in vitro за вирусоподобни частици от човешки папиломен вирус тип 16 и проби от ваксина Gardasil. тананикам Ваксина. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]

63. Kilpeläinen, A.; Мая-Хойос, М.; Сауби, Н.; Сото, CY; Joseph Munne, J. Напредък и предизвикателства при разработването на ваксина срещу ХИВ на базата на рекомбинантна Mycobacterium bovis BCG: Научени поуки. Expert Rev. Ваксини 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]




Може да харесаш също