Как да изследваме генетичното разнообразие на Herba Cistanches?
Mar 14, 2022
Проучване на генетичното разнообразие на Herba Cistanches от RAPD
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Цуи Гуангхонг, Чен Мин, Хуанг Луки*, Сяо Супин, Ли Да
(Институт по китайска материя медика, Китайска академия по китайска медицина, Пекин 100700)
Резюме
Предназначение:За изследване на населениетогенетично разнообразиенаCistanche deserticolaиCistanche tubulosa.
Методи:Две диви популации наCistanche deserticolaи четири диви популации наCistanche tubulosaбяха анализирани от RAPD игенетично разнообразиеот популациите е анализиран от софтуерната версия 1.31 на POPGENE.
Резултати:Средният процент на полиморфните локуси наCistanche deserticolaе 47,37 процента, полиморфните локуси на двете популации са 39,47 процента и 35,53 процента, а средното генно разнообразие на Nei е 0.135 8. Това на Шанън беше повече. Индексът на информацията за състоянието е 0.207 2, а коефициентът на диференциация на гена Gst {{1{{20}}}}.254 6. Средният процент на полиморфните локуси в Cistanche беше 27,59 процента, а процентът на полиморфните локуси във всяка популация варираше от 19,54 процента до 25,29 процента, от които популацията на Andier имаше най-високите 25,29 процента, а средното генно разнообразие на Nei беше 0. { {21}}, индексът на информация за полиморфизма на Шанън е 0,1258, коефициентът на генна диференциация Gst =0.175 5.
Заключение:Cistanche deserticolaиCistanche tubulosaима известна диференциация между популациите. Theгенетично разнообразиена Desert Cistanche е значително по-висок от този на Cistanche tubulosa и се е диференцирал в два екотипа.
Ключови думи: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; генетично разнообразие
[Класификационен номер на китайската библиотека] S 567 [Идентификационен код на документа] A [Номер на статия] 1001-5302 (2004) 08-0727-04
Cistanche е паразитно растение, принадлежащо към род Cistanche в семейство Lidanaceae, известно също като Dayun, което е ценен китайски медицински материал. Основните изходни растения на Cistanche deserticola в моята страна саCistanche deserticolaYCMa и C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Растенията гостоприемници на Cistanche deserticola са Haloxylon ammodendron и Haloxylon ammodendron, които са разпространени главно в лигата Алашан във Вътрешна Монголия, северен Синдзян, Цинхай, Гансу и други места. Разпространението на Cistanche deserticola е същото като това на растенията гостоприемници. В моята страна Cistanche cistanche е разпространен само в окръзи около пустинята Таклимакан на юг от планините Тяншан в Синдзян и разпространението му не е напълно синхронизирано с гостоприемника Tamarix. Други региони като северен Синдзян, Гансу, Цинхай, Нинся, Вътрешна Монголия, Шанси и други места на растенията Tamarix не са паразитни Cistanche Tubula[2]. Поради бързото нарастване на търсенето на Cistanche през последните години, което доведе до изчезване на неговите ресурси, ресурсите на дивата Cistanche са се свили само до няколко основни производствени района. И двата са включени в списъка на застрашените защитени растителни видове в моята страна [3], сред коитоCistanche deserticolaе включен в приложение II на CITES [4].
След няколко години изследвания, изследванията върху изкуственото размножаване на Cistanche са успешни и са в етап на широкомащабно популяризиране и засаждане. Но как да се предотврати намаляването на видовете Cistanche по време на промишленото производство, как да се възстанови ограничената дива популация възможно най-скоро и да се запазят ценните ресурси на дивата зародишна плазма, са ключовете за постигане на нейното устойчиво използване. Що се отнася до защитеното наследство на Cistanche [Дата на получаване], 2004-03-11 [Проект на фонда] Проект за социално подпомагане на Министерството на науката и технологиите (2001.109); Проект „Десети петгодишен план“ на Министерството на науката и технологиите (2001BA701A09a) [Автор-кореспондент] * Huang Luqi, Тел:( 010) 64014411-2955, E-mail: huangluqi @263.net Изследването на предаването все още е празно. Това изследване използва RAPD технология за изследване на 2 диви популации наCistanche deserticolaи 4 диви популации наCistanche tubulosa, и анализирайте двете Разликата вгенетично разнообразиесе очаква да осигури важна експериментална генетична основа за защитата на Cistanche, ценно китайско лекарство.
1. Материал и методи
1.1 Материали
Cistanche deserticolaе събран от окръг Джимсар в Синдзян и района Джилантай от Древната лига Алкса във Вътрешна Монголия. Популациите на Cistanche бяха събрани от окръг Minfeng и окръг Yutian, Синдзян. Понастоящем окръг Минфенг е зоната с най-голям добив на Cistanche cistanche, с най-висока гъстота и относително пълни съобщества от естествени гори. Точките за вземане на проби Andil, Sawuzek, Yatongguz и Daheyan от окръг Yutian са основните производствени зони, които се намират в река Andir, Yeyike River, Yatongguzi River и Kelaniya. В долното течение на реката разстоянието между популациите е повече от 50 км. Всяка популация произволно взе 19-30 индивида. Пробите бяха бързо изсушени в силикагел и използвани за екстракция на ДНК (Таблица 1).
Таблица 1 Популации за вземане на проби и райони за производство на Cistanche deserticola и Cistanche tubulosa
1.2 Извличане на ДНК
Методът за тотална екстракция на ДНК използва метод с високо съдържание на сол и ниско pH [5]. ДНК пробата беше подложена на спектрофотометър за откриване на концентрацията на ДНК матрица, след това електрофореза с 1% агарозен гел, EB оцветяване, наблюдение и фотография под ултравиолетова светлина, електрофореза на ДНК с ясни ленти и по-малко остатъци бяха използвани за RAPD анализ.
1.3 Скрининг на RAPD праймери
Тъй като експериментът установи, че един и същ праймер има незадоволителен ефект върху едновременното усилване и на дватаCistanche deserticolaи Cistanche tubulosa, праймерите бяха скринирани независимо. 150 произволни праймера (10 bp), 25 μL реакционна система на Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd. бяха използвани за амплификация и скрининг; всеки праймер използва 2 шаблона за популация и 1 стерилизирана двойно дестилирана вода като празна контрола и получава 10 праймера за амплификация на Cistanche deserticola с ясни ленти, силен полиморфизъм и добра повторяемост: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 грундове наCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.
1.4 PCR амплификация и откриване на продукта
Избраните праймери бяха използвани за амплифициране на матричната ДНК наCistanche deserticolaиCistanche tubulosaчрез PCR. Геномната ДНК се разрежда до 50 ng·μL -1 според измерената концентрация като шаблон. Общият реакционен обем е 25 μL, от които 10 × PCR буфер 2,5 μL, Mg2 плюс 1,5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μL, dNTP смес (всеки 2,5 mM) 1 µL, 5 µM праймер 1 µL, матрична ДНК 1 µL, стерилизирана двойно дестилирана вода 18,8 µL, горният разтвор за PCR амплификация е продукт на Shanghai Sangon. Амплификацията беше извършена на PTC-100 термоциклер. Програмата за усилване беше 94 градуса предденатурация за 5 минути и след това 40 цикъла. Всеки цикъл включваше 94 градуса 45 секунди, 34 градуса 1 минута, 72 градуса 1 минута 30 секунди и накрая Удължаване при 72 градуса за 5 минути. Амплифицираните продукти се подлагат на електрофореза върху 2,0 процента агарозен гел (съдържащ EB) в 1 × TAE буфер и се наблюдават и фотографират под системата за изобразяване на гел SYNGENE.
1.5 Статистика и анализ на данни
В спектъра на електрофорезата, съответната позиция на реакционния продукт върху гела се сравнява според стандарта за молекулно тегло и се оценява молекулното тегло на амплифицирания продукт. Лентата с лентата се записва като 1, а лентата без лента се записва като 0, образувайки 0/1 матрична графика и въведена в компютъра, използвайки POPGENE32 за изчисляване на процента на полиморфните сайтове (PPL) на всяка популация, индекс на генно разнообразие на Nei (H), информационен индекс на полиморфизъм на Shannon (I), коефициент на генна диференциация (Gst), генно разнообразие (Ht),Генетично разнообразие(Hs), генетичната идентичност (I) на Nei (1978) и генетичното разстояние (D) в рамките на популация и клъстерен анализ бяха извършени с помощта на метода UPGMA.
2. Резултати и анализ
2.1 Генетично разнообразие на Cistanche
Всички проби са получили ленти с молекулно тегло в диапазона от 200 до 2 200 bp (Фигура 1, 2). Открити са общо 76 локуса в 60 проби от 2 популации наCistanche deserticola, 36 от които са полиморфни локуси, представляващи 47,37 процента, H=0.135 8, I=0.207 2. Сред тях, PPL на Jimsar е 39,47 процента, а Gilanty е 35,53 процента. H е 0. 0 95 3 и 0.1 070 съответно, а I е съответно 0.15 12 и 0.163 7. Общо 87 локуса бяха открити в {{20}} индивиди от 4 популации на Cistanche, 24 от които бяха полиморфни локуса, което представлява 27,59 процента, H=0.084 8, I=0.1278. Най-високият PPL е Andil с 25,29 процента, докато PPL е по-нисък в Savuzek и Yatungusi (и двата с 19,54 процента). H е 0.062 1 -0.080 0, I е 0.095 0 -0.116. Размерът на H и I е в съответствие с тенденцията на размера на PPL на всяка популация и коефициентите са най-големи в Andier, следвани от Dayan. В случая на същия PPL, H=0 на Savuzek.{{40}} Сумата I=0.097 0 е малко по-висока от 0.{{44 }} и 0.095 0 на Ятунгуска (Таблица 2).
Фигура 1 RAPD усилени ленти на някои проби от пустиняCistanche deserticola, буквар S490 1-10. Гаранционни проби; 11-20. Проби на Jimpster M-ДНК маркер (200 - 2 000 bp)
Фигура 2 RAPD амплифицирани ленти на някои проби от Cistanche Tubulosa, праймер S2 042 1-20. Xinjiang Andier проба M-ДНК маркер (200 - 2 000 bp)
Таблица 2генетично разнообразиенаCistanche deserticolaиCistanche tubulosaпопулации
2.2 Анализ на генетични вариации на Cistanche
Според нивото нагенетично разнообразиев популациите (Hs), диференциацията между популациите (Dst) и дела на генетичните разлики между популациите в общите генетични разлики (Gst), може да се види, че общото генетично разнообразие на Cistanche deserticola Ht=0.{{ 1}}, където Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, от които Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (Таблица 3). Горните резултати показват, че има известна степен на генетична вариация сред популациите. Вариацията между пустинните популации на Cistanche deserticola представлява 25,46 процента от общата вариация, а вариацията на популациите на Cistanche tubulosa представлява 17,55 процента от общата вариация.
Таблица 3 Анализ на генетични вариации наCistanche deserticolaиCistanche tubulosa.
2.3 Генетично разстояние и клъстерен анализ сред популациите на Cistanche deserticola
Генетичното разстояние на двете популации наCistanche deserticolaе {{0}}.080 0, а генетичната идентичност е 0.9231. Генетичното разстояние на четирите популации на Cistanche беше 0.012 0-0.031 5, а генетичната идентичност беше 0.9690-0.988 1 (Таблица 4) . Групирането на индивиди от Cistanche deserticola и cistanche tubulosa показва, че Cistanche deserticola могат да бъдат групирани в две отделни групи според популацията, докато различните индивиди от Cistanche tubulosa не могат да бъдат групирани по популация, което също показва, че генетичната диференциация сред Cistanche deserticola населението е сравнително високо. Голяма, но генетичната диференциация сред популациите на Cistanche tubulosa е малка.
Таблица 4 Генетична идентичност (долу вляво) и генетично разстояние (горе вдясно) нацистанче тубулоза.
3. Дискусия
3.1 Генетично разнообразие на Cistanche
Нивото нагенетично разнообразиена растенията е неделима от техните биологични характеристики, местообитания, произход и еволюция. Сред тях най-голямо влияние имат системата на размножаване, ареалът на разпространение, жизнената форма и методите за разпръскване на цветен прашец и семена [6]. Според статистическите резултати от алозимни данни за 499 растителни вида в 165 рода от Ge Song et al. [7], полиморфизмът на Cistanche на видово ниво трябва да бъде около 50 процента, а полиморфизмът на популационно ниво трябва да бъде около 40 процента. Около 0,17. Нивата на полиморфизъм, получени в този експеримент, са по-ниски от тези средни стойности. В същото време, в сравнение с нивата на полиморфни локуси, получени чрез методите на RAPD за няколко често срещани застрашени растения, като 32 процента от застрашения вид сребриста ела[18], 22,5 процента от божура джудже и 27,6 процента от лилавия божур [9] ] Вижда се, че генетичното разнообразие наCistanche deserticola е малко по-ниско от средното ниво, докато генетичното разнообразие на Cistanche tubulosa вече е изключително ниско.
3.2 Причини за ниското генетично разнообразие на Cistanche
Цистанхата е специфично паразитно растение, разпространено едновременно в тесни пустинни райони. Следователно уникалният начин на живот и сравнително тясната жилищна площ може да са присъщата причина, поради коятогенетично разнообразиена Cistanche обикновено е по-нисък от този на обикновените растения.
Разликата вгенетично разнообразиемежду Cistanche deserticola и Cistanche tubulosa може да е свързано с разликата в обхвата на разпространение на двете и дали те са синхронизирани с разпространението на гостоприемника. Ареалът на разпространение на Cistanche tubulosa е значително по-малък от този на Cistanche deserticola и разпространението му е изключително несинхронизирано с растението гостоприемник. Проучванията показват, че има голямо разнообразие сред видовете Tamarix. Например Zhang Juan et al. съобщават, че генетичното разнообразие на Tamarix sibiricus достига 98,7 процента [10], докато генетичното разнообразие на Cistanche е изключително слабо, което показва дългосрочната еволюция. Cistanche tubulosa може да е претърпял сериозни затруднения в историята, водещи до загуба на голямо количествогенетично разнообразие.
В същото време според разследванията е установено, че нито един отCistanche deserticolaв рамките на 20 км от човешките селища могат да бъдат открити и да цъфтят нормално. Бяха изкопани големите и малки ями на Cistanche, особено в основните производствени зони на цветето Cistanche. Следователно това е причинено от голямо количество разкопки. Липсата на произход и унищожаването на местообитанията може да са основните причинени от човека причини за ниското нивогенетично разнообразиена Систанче.
3.3 Генетична диференциация на Cistanche
Поради географското разстояние между Синдзян и Вътрешна Монголия, географската изолация предизвика диференциацията и изолацията междуCistanche deserticolaпопулации, като двете популации формират различни генетично различни екотипове поради адаптирането им към местните условия на местообитание. Поради тесния му обхват на разпространение и честия обмен на гени между популациите, генетичната диференциация между популациите е по-малка от тази на Cistanche deserticola.
3.4 Препоръки за защита на Cistanche
Генетично разнообразиее предпоставката за дългосрочното оцеляване на видовете, за да се избегне изчезването. Намаляването нагенетично разнообразиеще намали способността на населението да се адаптира към промените в околната среда както в краткосрочен, така и в дългосрочен план [11]. Следователно защитата на генетичното разнообразие на Cistanche е много важна за защитата на това рядко и ценно китайско лекарство. Тъй като Cistanche е вид със специален екологичен тип, той трябва да бъде защитен предимно in situ, а естествената защитна база за Cistanche трябва да бъде създадена в съответствие с генетичното му разнообразие. Например заCistanche tubulosa, тъй като генетичното разнообразие идва главно от популацията, популациите с голямо генетично разнообразие ще бъдат обектите с приоритетна защита [12], като Angier на Minfeng и Daheyan на Yutian, могат да бъдат. Той е посочен като естествена защитна база за Cistanche. Колкото доCistanche deserticola, популациите на Вътрешна Монголия и Синдзян са претърпели значителни промени, така че експерименталните изследвания трябва да бъдат допълнително засилени, за да се определят популациите, които са приоритетни за защита. В същото време да се извършат основни изследвания върху репродуктивната биология и екологията на опрашването на Cistanche, за да се предостави информация за по-нататъшната му защита.
Препратки
[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei и др. Идентификация наЦистанчеи изследване на търговски лекарствени материали. Китайски медицински материали, 1997, 20(3):117.
[2] Liu Mingting. Цялостно изследване и общо приложение на растенията Tamarix. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995.
[3] Фу Гуоли. Червена книга на китайските растения. Пекин: Science Press, 1992 г.
[4] Службата за управление на вноса и износа на застрашени видове на Китайската народна република, Научният комитет по застрашените видове на Китайската народна република. Конвенция за международна търговия със застрашени видове от дивата фауна и растения (CITES), Приложение II. 2003.41.
[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding и др. Извличане и идентифициране на тотална ДНК на няколко застрашени растения и техните роднини. Acta Botany, 1994, 36:528.
[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Система за отглеждане на растения, генетична структура и защита нагенетично разнообразие. Биоразнообразие, 1996, 4(2): 92.
[7] Чен Дзякуан, Ян Джи. Еволюционна биология на растенията. Wuhan: Wuhan University Press, 1994.
[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming и др. RAPD анализ на генетичното разнообразие на сребриста ела. Китайска наука (C), 1997, 40 (2): 145.
[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen и др. Предварителен доклад за RAPD анализ на божур джудже и лилав божур. Китайски вестник за таксономия на растенията, 1995, 33(4): 350.
[10] Джан Джуан, Ин Линке, Джан Даоюан. Предварително проучване наГенетично разнообразиена естествените популации на Tamarix lanceolate. Yunnan Botanical Research, 2003, 25(5):557.
[11] Ellstrand NC, Elam DR. Последици от популационната генетика на малкия размер на популацията: Последици за опазването на растенията. Годишен преглед Екология и систематика, 1993, 34:217.
[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Принципът на популационната генетика и приложението му в опазването на редки и застрашени растения. Биоразнообразие, 1999, 7(4): 340.
От: China Journal of Chinese Materia Medica; Vol. 29, брой 8 август 2004 г
