Полизахаридът Cistanche Deserticola отслабва остеокластогенезата и костната резорбция чрез инхибиране на RANKL сигнализирането и производството на реактивни кислородни видове

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song и др

Остеопорозата е метаболитно заболяване, характеризиращо се с остеопения и влошаване на микроструктурата на костите. Остеокластите са първичните ефекторни клетки, които разграждат костната матрица и тяхната анормална функция води до развитие на остеопороза. Натрупването на реактивни кислородни видове (ROS) по време на клетъчния метаболизъм насърчава пролиферацията и диференциацията на остеокластите, следователно играе важна роля при остеопорозата.Цистанчеdeserticolaполизахарид(CDP) притежава антитуморна, противовъзпалителна и антиоксидантна активност. Въпреки това, влиянието на CDP върху остеокластите е неясно. В това проучване бяха използвани оцветяване с устойчива на тартарат кисела фосфатаза, имунофлуоресценция, полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция и Western blot анализ, за ​​да се докаже, че CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)инхибира остеокластогенезата и резорбцията на хидроксиапатит. В допълнение, CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)също така инхибира експресията на остеокластни маркерни гени, включително Ctsk, Mmp9 и Acp5, и няма ефект върху рецепторния активатор на експресията на ядрен фактор κB (RANK). Механистичните анализи разкриха, че CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)повишава експресията на антиоксидантни ензими, за да намали RANKL-медиираното производство на ROS в остеокластите и инхибира ядрения фактор на активираните Т клетки и активирането на митоген-активирана протеин киназа. Тези резултати предполагат, че CDP може да представлява кандидат лекарство за лечение на остеопороза, причинена от прекомерна остеокластна активност.

КЛЮЧОВИ ДУМИкостна резорбция,Цистанчеdeserticolaполизахарид, MAPK, остеокласти, реактивни кислородни видове

цистанче бодибилдинг

1|ВЪВЕДЕНИЕ

Балансът между образуването на кост, медиирано от остеобласти, и костната резорбция, медиирано от остеокласти, играе жизненоважна роля в поддържането на костната метаболитна хомеостаза (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Когато костната резорбция надхвърли образуването на кост, настъпва остеопороза, която се характеризира с намалена костна маса и костно микроструктурно увреждане (Ikeda, 2008). Остеопорозата е често срещано заболяване при възрастни хора и жени след менопауза и нейната патогенеза не е напълно изяснена (Cooper & Melton, 1992). Дефицитът на естроген е основна причина за остеопороза (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). В допълнение, реактивните кислородни видове (ROS) могат да бъдат индуцирани от рецепторен активатор на ядрен фактор κB лиганд (RANKL) и са свързани с образуването на остеокласти (Yip et al., 2005) и по този начин могат да допринесат за развитието на остеопороза (Manolagas, 2010). Някои проучвания са установили, че дефицитът на Nrf2-антиоксидант повишава нивата на ROS и насърчава индуцираната от RANKL диференциация на остеокласти (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013). Следователно, намаляването на производството на ROS по време на диференциацията на остеокластите трябва да се оцени като терапевтична стратегия за лечение на остеопороза.

Остеокластите произлизат от хематопоетичната линия на моноцитите или макрофагите и са единствените многоядрени клетки, които извършват костна резорбция (Teitelbaum, 2000). Следователно изследванията, включващи образуването на остеокласти, са от голямо значение за разработването на ефективни лечения за заболявания на костния метаболизъм (Lorenzo, 2017). Факторът, стимулиращ колонията на макрофагите (M-CSF) и RANKL, продуцирани от остеобласти и активирани Т клетки, са важни цитокини, които регулират остеокластогенезата (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL индуцира експресията на ядрен фактор на активирани Т клетки (NFATc1), който е критичен транскрипционен фактор, активен по време на образуването на остеокласти (Ishida et al., 2002). Активираният NFATc1 насърчава експресията на остеокластни маркерни гени като устойчива на тартарат кисела фосфатаза (TRAcP) и катепсин К (CTSK), които регулират остеокластогенезата и функцията на остеокластите (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Цистанчеdeserticolaполизахарид(CDP) се изолира от месестите стъбла наЦистанчеи притежава имунна регулация, противотуморни, против стареене и други фармакологични ефекти (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)има инхибиторен ефект върху индуцираното от липополизахарид производство на азотен оксид (NO) в миши микроглиални клетки (BV-2 клетки; Nan et al., 2013). В допълнение, богат на фенилетаноиди екстракт (ECD) отЦистанчеподобрява способността за плуване на мишки чрез намаляване на мускулните увреждания, забавяне на натрупването на млечна киселина и подобряване на съхранението на енергия (Cai et al., 2010). Ефектите на CDP върху функцията и активността на остеокластите обаче остават неизвестни.

В това проучване ние демонстрирахме, че CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)инхибира RANKL-индуцираната остеокластна диференциация и костна резорбция. Основният механизъм беше този CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)подобрява експресията на антиоксидантни ензими, за да намали производството на ROS, и след това потиска RANKL-активираната NFAT и митоген-активираната протеин киназа (MAPK)-сигнални каскади. Тези резултати предполагат, че CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)може да се използва за лечение на остеопороза, причинена от прекомерна остеокластична костна резорбция.

мака женшен цистанче

2|МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

2.1|Материали

CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)(чистота > 98 процента) беше закупен от Solarbio (Пекин, Китай) и приготвен при изходна концентрация от 1 mM във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Антителата са специфични за c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, фосфорилиран (p)-ERK, p-p38, p-JNK и ‐актин са получени от Дядо Коледа Cruz Biotechnology (Сан Хосе, Калифорния). Антителата срещу V-ATPase d2 се произвеждат, както е описано по-горе (H. Feng et al., 2009). 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сулфофенил)-2Н-тетразолий (MTS) и системата за анализ на луциферазата са получени от Promega (Сидни, Австралия) . Рекомбинантният M-CSF е закупен от R&D Systems (Минеаполис, Минесота). Рекомбинантният GST-rRANKL протеин се експресира и пречиства, както е описано по-горе (Xu et al., 2000).

2.2|Клетъчна култура

Клетки RAW264.7 (миши макрофагови клетки) бяха получени от American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) и култивирани в модифицирана минимална есенциална среда (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Австралия), допълнена с 10 процента фетален говежди серум, 2 mM L-глутамин, 100 U/ml пеницилин и 100 ug/ml стрептомицин (пълна среда). Моноцити, получени от костен мозък (BMMs), бяха изолирани от 6-седмични C57BL/6J мишки, които бяха евтаназирани съгласно процедури, одобрени от Комитета по етика на животните към Университета на Западна Австралия (RA/3/100/1244). Дългите кости бяха дисектирани без меки тъкани и костният мозък беше промит от бедрената кост и тибията, който след това беше култивиран в пълна среда в присъствието на M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Тест за остеокластогенеза

BMM се поставят в 96-ямкови плаки за култура при плътност от 6 × 103 клетки на ямка и се третират с пълна среда, съдържаща M-CSF (50 ng/ml) и GST-rRANKL (100 ng/ml), в присъствието или липса на различни концентрации на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>три ядра) бяха идентифицирани като остеокласти.

2.4|Тестове за цитотоксичност

BMM се посяват в 96-ямкови плаки при 6 × 103 клетки на ямка и се оставят за една нощ, за да се залепят. На следващия ден клетките се инкубират с различни концентрации на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид). След още 48 часа се добавя MTS разтвор (20 ul/ямка) и се инкубира с клетки в продължение на 2 часа. Абсорбцията при 490 nm се определя с четец на микроплаки (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Имунофлуоресцентно оцветяване

BMM се посяват при плътност от 6 × 103 клетки на ямка в присъствието на M-CSF (50 ng/ml) за една нощ. След това клетките се стимулират с M-CSF и GST-rRANKL (100 ng/ml), докато се образуват зрели остеокласти. След това остеокластите се третират с различни концентрации на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)за 48 часа преди фиксиране с 4 процента параформалдехид, пермеабилизиране с 0.1 процента Triton X-100–PBS и блокиране с 3 процента говежди серумен албумин в PBS. Приготвените клетки се инкубират с родамин-конюгиран фалоидин за 45 минути на тъмно, за да се оцветят за F-актин. След това клетките се промиват с PBS, ядрата се оцветяват обратно с 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и се монтират с покривни стъкла за конфокална микроскопия.

Cistanche опит

2.6|Тест за резорбция на хидроксиапатит

За измерване на активността на остеокластите BMMs (1 × 105 клетки на ямка), култивирани върху плаки, покрити с колаген с шест ямки (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific), бяха стимулирани с GST-rRANKL (100 ng/ml) и M-CSF (50 ng/ ml), докато се генерират зрели остеокласти (Zhou et al., 2016). След това клетките бяха внимателно отделени от плаката с помощта на разтвор за клетъчна дисоциация (Sigma-Aldrich) и равен брой зрели остеокласти бяха посяти в отделни ямки в покрити с хидроксиапатит 96-ямкови плаки (Corning Osteoassay, Corning, NY). Зрелите остеокласти се инкубират в среда, съдържаща GST-rRANKL и M-CSF със или без CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)при посочените концентрации. След 48 часа, половината от ямките бяха имунохистохимично оцветени за TRacP активност, както е описано по-горе, за да се оцени броят на многоядрените клетки на ямка. Останалите ямки се избелват за 10 минути, за да се отстранят клетките и да се позволи измерване на резорбираните области. Резорбираните зони бяха фотографирани под стандартна светлинна микроскопия и софтуерът Image J (Национални институти по здравеопазване, Bethesda, MD) беше използван за количествено определяне на процентната площ на хидроксиапатитната повърхност, резорбирана от остеокластите.

2.7|Луциферазни репортерни анализи

За да се изследва NFATc1 транскрипционното активиране, клетките RAW264.7 бяха стабилно трансфектирани с NFATc1-реагираща луциферазна репортерна конструкция (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Трансфектираните клетки се култивират в 48-ямкови плаки при плътност от 1,5 × 105 клетки на ямка и се третират предварително с различни концентрации на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)за 1 час. След предварителна обработка, клетките бяха стимулирани с GST-rRANKL (100 ng/ml) за 24 часа и луциферазната активност беше измерена с помощта на луциферазна репортерна система за анализ съгласно протокола на производителя (Promega).

2.8|Количествен анализ на полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT-PCR).

Общата РНК се изолира от клетки с помощта на реагент Trizol съгласно протокола на производителя (Thermo Fisher Scientific). Допълнителна ДНК се синтезира с помощта на обратна транскриптаза на вируса на миша левкемия Moloney с 1 ug РНК шаблон и олиго-dT праймери. Амплификацията на полимеразна верижна реакция на специфични последователности се извършва, като се използва следната програма: 94 градуса за 5 минути, последвани от 30 цикъла от 94 градуса за 40 s, 60 градуса за 40 s и 72 градуса за 40 s, и крайна стъпка на удължаване на 5 минути при 72 градуса. Подробната информация за специфичните праймери е показана в таблица 1. Относителните нива на информационна РНК се изчисляват чрез нормализиране на експресията на домакинския ген Hmbs.

2.9|Western blot анализ

BMM се култивират в пълна среда с M-CSF в шест ямкови плаки и се стимулират с GST-rRANKL (100 ng/ml) за посочените времена. Клетките се лизират в радиоимунопреципитационен лизисен буфер и протеините се разделят чрез електрофореза с натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел и се прехвърлят към мембрани от поли(винилиден флуорид) (GE Healthcare, Silverwater, Австралия). Мембраните се блокират в 5 процента обезмаслено мляко за 1 час и след това се изследват с различни специфични първични антитела с леко разклащане за една нощ при 4 градуса. Мембраните се промиват и след това се инкубират с вторични антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян. След това реактивността на антитялото се открива с усилен хемилуминесцентен реагент (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) и се визуализира с Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Вътреклетъчно откриване на ROS

Вътреклетъчните нива на ROS бяха открити с помощта на 2',7'-дихлорофлуоресцеин диацетат клетъчен комплект за откриване на ROS (Abcam, Мелбърн, Австралия). BMM (5 × 103 клетки на ямка) се култивират в 96-ямкови плаки и се третират с RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) и CDP за 72 часа. Вътреклетъчните нива на ROS се измерват с помощта на 2',7'-дихлорофлуоресцеин диацетат, който се окислява във флуоресцентен DCF в присъствието на ROS. Клетките се промиват в буфер на Ханк и се инкубират на тъмно в продължение на 30 минути с 10 цМ DCFH-DA. Изображенията са получени с помощта на конфокална микроскопия.

2.11|статистически анализи

Всички данни са представителни за най-малко три експеримента, извършени в три екземпляра, освен ако не е посочено друго. Данните са изразени като средно ± SD. Използван е еднопосочен анализ на дисперсията, последван от post hoc тестове на Student–Newman–Keuls, за да се определи значимостта на разликите между резултатите, като p < 0.05="" се="" счита="" за="">

3|РЕЗУЛТАТИ

3.1|CDP инхибира RANKL-индуцирана остеокластогенеза и сливане на остеокласти

За да определите дали CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)може да потисне индуцираното от RANKL образуване на остеокласти, първо проведохме анализ на остеокластогенезата, използвайки BMM на мишки (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM бяха третирани с RANKL и M-CSF в продължение на 5 дни с нарастващи концентрации на CDP. CDP намалява броя на TRacP-позитивните многоядрени клетки, когато концентрацията на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)достига 5 µM или по-висока (Фигура 1a, b). За оценка на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)токсичност и потвърдихме, че тези резултати не са отражение на клетъчна смърт или брой, направихме MTS анализ. BMM бяха третирани с RANKL и M-CSF в продължение на 48 часа с различни дози CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид). CDP няма ефект върху пролиферацията на BMM при концентрация от 15 µM или по-малко (Фигура 1с).

За да тествате ефектите на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)при сливане на остеокласти, остеокластите са индуцирани с лечение с RANKL и M-CSF, със или без различни дози CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид). Остеокластите бяха оцветени с родамин-фалоидин и DAPI, за да се оцени броят на ядрата на остеокласти (Фигура 2а). Както броят на остеокластите, така и средният брой ядра на остеокласти намаляват след CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)лечение (5–10 µM; Фигура 2b,c). Следователно CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)има инхибиторен ефект върху индуцирана от RANKL остеокластогенеза и сливане на остеокласти по дозозависим начин.

3.2|CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)отслабва индуцираната от RANKL активност на резорбция на остеокластичен хидроксиапатит

Проведен е анализ на резорбция на хидроксиапатит, за да се открие ефектът на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)върху функцията на остеокластите (Фигура 3а). След 24-часова инкубация, броят на остеокластите на ямка не се промени, докато зоната на резорбция на хидроксиапатит беше значително намалена чрез третиране с 5 и 10 µM CDP в сравнение с контролните групи (Фигура 3b,c). Тези резултати показват, че CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)има силни инхибиторни ефекти както върху образуването на остеокласти, така и върху активността на резорбция на остеокластите без никакви цитотоксични ефекти.

3.3|CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)инхибира генната експресия на маркера на остеокластите

За по-нататъшно изследване на инхибиторните ефекти на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)върху остеокластогенезата и остеокластичната костна резорбция, BMM са третирани с RANKL и M-CSF в продължение на 5 дни с различни концентрации на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид). След това се извършва RT-PCR за откриване на експресията на маркерни гени на остеокласти. Експресията на Nfatc1, решаващ транскрипционен фактор по време на остеокластогенезата, се инхибира от CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)по дозозависим начин (Фигура 4а). В допълнение, CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)(5 и 10 µM) понижават експресията на гени, свързани с костната резорбция, включително Mmp9, Ctsk и Acp5 (Фигура 4b-d).

3.4|CDP потиска активността на NFATc1 и експресията на протеин надолу по веригата

Да се ​​изследва ефекта на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)върху RANKL-индуцираната NFATc1 активност, беше извършен луциферазен репортерен анализ. Лечение с CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид), при концентрации от 5 µM и по-високи, значително инхибира RANKL-индуцираната NFATc1 активност (Фигура 5а). В допълнение, Western blot анализът показа, че CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)значително потисна протеиновата експресия на NFATc1 и c-Fos в BMMs, третирани с RANKL и M-CSF за 3 и 5 дни (Фигура 5b). Освен това, експресията на протеини, свързани с функцията на остеокластите, като V-ATPase-d2 и CTSK, се регулира надолу в присъствието на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)в сравнение с контролните групи. Въпреки това, CDP няма ефект върху експресията на RANK (Фигура 5b).

3.5|CDP насърчава експресията на антиоксидантни ензими за пречистване на производството на ROS по време на индуцирана от RANKL остеокластогенеза

За изследване на основния механизъм на инхибиране на CDP-зависима остеокластогенеза, BMMs бяха третирани с RANKL (100 ng/ml) и M-CSF (50 ng/ml) заедно с PBS или CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)за 72 ч. Изследвахме ефекта на CDP върху вътреклетъчното производство на ROS, стимулирано от RANKL. Вътреклетъчните нива на ROS бяха повишени чрез лечение с RANKL, което беше отслабено от CDP (5 и 10 цМ; Фигура 6а). Както броят на ROS-позитивните клетки, така и интензитетът на ROS оцветяване бяха намалени чрез лечение с CDP по дозозависим начин (Фигура 6b, c). Western blot анализът показа, че CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)насърчава експресията на тиоредоксин (TRX1) и глутатион редуктаза (GSR), като същевременно потиска експресията на индуцируема азотен оксид синтаза (NOS2) в BMM, които са третирани с RANKL и M-CSF в продължение на 3 дни (Фигура 6d).

За по-нататъшно проучване дали CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)потисна диференциацията на остеокластите чрез намаляване на производството на ROS, след това третирахме BMM с пероксид (10 µM), за да имитираме високото състояние на ROS в клетките. BMM бяха индуцирани от RANKL и M-CSF в продължение на 3 дни и резултатите от Western blot анализ и RT-PCR показаха, че пероксидът насърчава експресията на NFATc1 и c-Fos в сравнение с контролните групи. В съответствие с резултатите на Фигура 5, експресията на NFATc1 и c-Fos беше потисната от CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)докато пероксидът спасява инхибиторния ефект на CDP (Фигура 6e, f). Тези данни показват, че CDP потиска експресията на NFATc1 и c-Fos чрез пречистване на производството на ROS.

3.6|CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)потиска MAPK пътищата по време на индуцирана от RANKL остеокластогенеза

След това изследвахме ефекта на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)лечение на RANKL-медиирана експресия на TRAF6 и активиране на MAPK пътя. След инкубиране в среда без серум за 2 часа, BMMs бяха стимулирани с RANKL, със или без CDP, за 60 минути. Стимулирането с CDP (10 цМ) няма ефект върху експресията на TRAF6 и отслабва фосфорилирането на JNK2 и ERK1/2 на 10 и 20 минути (Фигура 7). В допълнение, фосфорилирането на р38 беше значително инхибирано от CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)лечение от 60 минути в сравнение с контролните групи (Фигура 7). Тези данни разкриват, че CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)потиска RANKL-индуцираните MAPK сигнални пътища, в съответствие с неговия инхибиторен ефект върху образуването и активността на остеокластите.

4|ДИСКУСИЯ

Cistanche, известен като "пустинен женшен", напоследък привлече много внимание заради способността си да модулира имунитета и да действа протективно по време на стареене и оксидативен стрес (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Доказано е, че фенилпропаноид-заместените гликозиди, основните активни компоненти на Cistanche, инхибират активността на NO в макрофагите (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). В допълнение, aЦистанчеекстракт намалява оксидативния стрес в реперфузиран миокард след исхемия и играе значителна роля в инхибирането на апоптотични пътища, водещи до кардиопротекция (Yu, Li, & Cao, 2016). Като важен компонент на Cistanche, CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)има различни фармакологични функции. Нашето текущо проучване установи, че CDP потиска RANKL-активираната остеокластна диференциация и активиране чрез отслабване на производството на ROS, както и NFAT и MAPK активиране.

Като кисела фосфатаза, TRAcP съществува в различни клетки и е в изобилие в остеокластите и алвеоларните макрофаги (Snipes, Lam, Dodd, Gray, & Cohen, 1986). TRAcP е характерен ензим на остеокластите и неговата експресия е тясно свързана с функцията на остеокластите, разглеждана като индикатор за активността на остеокластите и костната резорбция (Minkin, 1982). В нашето проучване CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)инхибира броя на TRAcP-позитивните клетки, което показва, че RANKL-индуцираната остеокластогенеза е блокирана от CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид). Разграждането на костния матрикс от остеокластите зависи от катепсин К (CTSK) и ММР (Gruber, 2015). Тук CDP значително намалява експресията на остеокластни функционални гени като Mmp9, Ctsk и Acp5.

Диференциацията и функцията на остеокластите се регулират от множество сигнални пътища (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). След свързване с RANK, RANKL набира адапторен протеин TRAF6, за да активира експресията на NFATc1, който е важен транскрипционен фактор за образуването на остеокласти, засягащ специфичната за остеокласти генна експресия, включително TRAcP и CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). В това проучване открихме, че CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)няма ефект върху експресията на RANK и TRAF6 в остеокластите. Въпреки това CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)инхибира RANKL-индуцираното NFATc1 активиране по време на остеокластогенезата на BMMs. Освен това беше доказано, че ROS, произведени от митохондриите в процеса на доставяне на електрони, насърчават пролиферацията и диференциацията на остеокластите и регулират разграждането на костния матрикс (Ha et al., 2004). Скорошно проучване установи, че RANKL индуцира ядрен импорт на Bach1 и отслабва Nrf2-медиирано производство на антиоксидантен ензим, като по този начин увеличава вътреклетъчната експресия на ROS и остеокластогенезата при мишки (Kanzaki et al., 2017). В допълнение, повишеното вътреклетъчно генериране на ROS от хомоцистеин повишава образуването и активността на остеокласти (Koh et al., 2006). Нашето проучване установи, че CDP намалява натрупването на ROS в остеокластите чрез инхибиране на експресията на NOS2 и насърчаване на експресията на антиоксидантни ензими, като TRX1 и глутатион редуктаза. Когато третирахме BMM с пероксид, за да подобрим вътреклетъчното натрупване на ROS, резултатите, че повишената ROS може да подобри експресията на NFATc1, разкриха, че ROS е нагоре по течението на NFATc1. Открихме също, че пероксидът спасява инхибиторния ефект на CDP върху експресията на NFATc1. И така, нашите данни предполагат, че CDP потиска натрупването на ROS, за да инхибира експресията на NFATc1, след което да потисне образуването и функцията на остеокласти.

ERK, JNK и p38 принадлежат към семейството MAPK, което също участва в регулирането на диференциацията на остеокластите (Seger & Krebs, 1995). RANKL активира MAPK пътя чрез увеличаване на фосфорилирането на ERK, JNK и p38 (Mizukami et al., 2002). Ние демонстрирахме, че CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)потиска RANKL-медиираното фосфорилиране на ключови протеини в MAPK пътя, като по този начин допринася за инхибиторния ефект на CDP върху експресията на маркерни гени на остеокластите. Доколкото ни е известно, това е първото проучване, показващо инхибиторните ефекти на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)върху производството на ROS, NFAT и MAPK активиране, представляващи нови механизми на действие на CDP in vitro.

В обобщение, ние демонстрирахме, че CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)отслабва остеокластогенезата и резорбцията на хидроксиапатит и експресията на маркерни гени за остеокласти, включително Ctsk, Mmp9 и Acp5. CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)успя да потисне RANKL-медиираното производство на ROS, както и NFAT и MAPK активирането (Фигура 8). Като цяло нашите резултати показват, че CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)може да представлява кандидат лекарство за лечение на състояния, свързани с остеокласти, придружени от свръхпроизводство на ROS.

ФИГУРА 8 Схематична диаграма на CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)функция в диференциацията на остеокластите. CDP(Цистанчеdeserticolaполизахарид)потиска RANKL-индуцираното производство на ROS, както и активирането на NFATc1 и MAPK, като по този начин инхибира остеокластогенезата. CDP,Цистанчеdeserticolaполизахарид; MAPK, митоген-активирана протеин киназа; NFATc1, ядрен фактор на активирана Т клетка; RANKL, рецепторен активатор на лиганд на ядрен фактор κB; ROS, реактивни кислородни видове [Цветната фигура може да се види на wileyonlinelibrary.com]

БЛАГОДАРНОСТИ

Това проучване е подкрепено от Фондацията за природни науки на Китай (81572164), Националната програма за научни изследвания и развитие на ключови технологии на Китай (2017YFC1103300), Фондацията за природни науки на провинция Гуанси (2016GXNSFAA380295) и Университетския изследователски проект за наука и технологии на Гуанси Провинция (KY2015YB054). Той също така е подкрепен отчасти от Проекта за план за научно изследване и технологично развитие на Гуанси (GKG13349003, 1598013-15), Фонд за медицинска и здравна изследователска инфраструктура на Западна Австралия, Фондация за артрит Австралия, Награди за изследователско сътрудничество на Университета на Западна Австралия (UWA) и Австралийски съвет по здравеопазване и медицински изследвания (NHMRC, № 1107828 и 1027932).

КОНФЛИКТ НА ИНТЕРЕСИ

Авторите декларират, че няма конфликт на интереси

От: 'Цистанчеdeserticolaполизахаридотслабва остеокластогенезата и костната резорбция чрез инхибиране на RANKL сигнализирането и производството на реактивни кислородни видове от Dezhi Song et al

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018; 233: 9674–9684