Полизахаридът Cistanche Deserticola инхибира OVX-индуцирана костна загуба при мишки и RANKL-индуцирана остеокластогенеза

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

АБСТРАКТ

Остеопорозата е сериозно заболяване на костите, засягащо застаряващото население. Cistanche deserticola (CD), тонизираща и лечебна храна, широко използвана в Китай, е доказано, че осигурява ефективно лечение на остеопороза. Полизахаридът на Cistanche deserticola (CDP), извлечен от CD, притежава различни фармакологични свойства, но ролята му востеокластиченобразуването и функцията, както и остеопорозата, остават неизвестни. Целта на това проучване беше да се извлече и пречисти CDP, за да се изследва по-нататък потенциалният му механизъм на действие върху остеопорозата. Резултатите показват, че лечението с CDP предотвратява индуцирана от OVX остеопороза и подобрява костната загуба чрез потискане на активността и функцията на остеокластите. Освен това, лечението с CDP значително инхибира RANKL-индуцирана остеокластогенеза, костна резорбция и експресия на специфичен за остеокластите ген. Механично, CDP инхибира RANKL-индуцираното NF-κB и MAPKs активиране на сигналните пътища и следователно повлиява низходящото NFATc1 активиране. Резултатите от това проучване показват, че CDP е потенциално безопасно лекарство за лечение на остеопороза. (10 предимства, които Cistanche може да даде)

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Въведение

Остеопорозата - заболяване, характеризиращо се с намалена костна маса, анормална микроструктура на костната тъкан, повишена чупливост на костите и фрактури (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, & Ginaldi, 2006) - понастоящем засяга повече от 200 милиона души по света и представлява значителна медицинска и социално-икономическа тежест върху съвременното общество (Strom et al., 2011). Клиничното лечение на остеопорозата се фокусира главно върху хормонално заместване,бифосфонат, или терапия с денозумаб. Тези методи са ефективни, но водят до дългосрочни странични ефекти, като потенциален риск от рак на гърдата и атипични фрактури на бедрената кост (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof Bauer, 2011). Следователно има спешна нужда да се проучат лекарства, които могат не само да инхибират остеопорозата, но и да притежават по-малко нежелани странични ефекти. Cistanche deserticola (CD), тонизираща и лечебна храна, широко използвана в Китай, известна като „пустинен женшен“, е изсушеното сочно стъбло с люспести листа на C. deserticola YC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) и има разнообразни и ефективни фармакологични дейности, като имунна регулация,анти-оксидация, и антиостеопорозни свойства (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Предишни проучвания върху активните субстанции на CD при лечение на остеопороза се фокусираха главно върху фенилетаноидни гликозиди (Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). CD обаче съдържа и други ефективни компоненти като иридоиди, лигнани, полизахариди (Wang, Zhang, & Xie, 2012). Клиничното приложение на традиционната китайска медицина (ТКМ) е основно отваряване с вода. Полизахаридите са водоразтворими компоненти и е най-вероятно да бъдат основните фармакодинамични компоненти на TCM. За полизахаридите, извлечени от TCM, се съобщава, че имат антиостеопорозен ефект и няколко нежелани странични ефекти, които обикновено се използват в клиниките (напр. полизахариди, извлечени отEpimedium brevicornum(Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018) и Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Следователно ние предположихме, чеCistanche deserticola полизахарид(CDP), извлечен от CD, може да бъде потенциално безопасно лекарство за лечение на остеопороза. Обикновено костната резорбция и костното образуване поддържат динамичен баланс по време на костното ремоделиране в координация с няколко типа клетки, включително остеокласти,остеобласти, клетки на костната обвивка и остеоцити (Kular, Tickner, Chim и Xu, 2012). Нарушаването на този баланс може да доведе до различни заболявания на костния метаболизъм, като остеопороза (Zhu et al., 2018) и остеосклероза (Ihde et al., 2011). Остеокластите, като крайно диференцирани клетки, получени от мононуклеарната/макрофагалната линия, са единствените клетки с функция за костна резорбция (Teitelbaum, 20{{106}}0). Има два ключови цитокина, които участват в диференциацията и съзряването на остеокластите (Koga et al., 2004): фактор, стимулиращ колонията на макрофагите (M-CSF) и рецепторен активатор на лиганда на ядрения фактор κB (NF-κB) (RANKL). M-CSF медиира диференциацията на хемопоетичните стволови клетки в остеокластите прогенитори и насърчава диференциацията на остеокластите чрез регулиране на експресията на RANK рецептора (Takayanagi, 2007). Свързването на RANKL и RANK върху остеокластната клетъчна повърхност води до следното: (1) набиране на сигнални адапторни молекули като TNF рецептор-свързан фактор 6 (TRAF6); (2) активиране на множество цели надолу по веригата, включително NF-kB и митоген-активирани протеин кинази (MAPKs); и (3) повишаване на нивата на експресия на ядрен фактор на активирани Т-клетки, цитоплазмени 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Активирането на тези сигнални пътища директно регулира експресията на остеокластни гени, включително кисела фосфатаза 5 (Acp5) [кодираща устойчива на тартарат кисела фосфатаза (TRAcP)], матрична металопротеиназа 9 (MMP9) и катепсин К (CTSK) (Boyle, Simonet , & Лейси, 2003). Следователно, инхибирането на RANKL-индуцираните сигнални пътища, свързани с остеокластната диференциация, е потенциален терапевтичен метод за остеопороза. В това проучване ние имахме за цел да определим ефектите от лечението с CDP върху миши модел с индуцирана от овариектомия (OVX) остеопороза in vivo и върху RANKL-индуцирана остеокластна активност in vitro, с фокус върху експресията на остеокласт-специфични гени и активирането на NFATc1 и NF-κB и MAPKs сигналните пътища. Нашите открития могат да предоставят нови прозрения за потенциала на CDP като безопасно и ефективно лекарство за лечение на остеопороза. 2. Материали и методи 2.1. CD с химикали и колекция от проби (№ 180801) е закупен от Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Анхуей, Китай) и е идентифициран от професор Хайбо Хуанг от Училището по фармацевтични науки, Гуанджоуски университет по китайска медицина, Гуанджоу, Китай . Таблетките естрадиол валерат са закупени от Bayer (Леверкузен, Северен Рейн Вестфалия, Германия). Алфа-модифицирана минимална есенциална среда (-MEM) и фетален говежди серум (FBS) бяха получени от Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Пеницилин/стрептомицин и комплектът за оцветяване с TRAcP са придобити от Solarbio (Пекин, Китай). Рекомбинантен миши M-CSF и рекомбинантен миши RANKL бяха осигурени от R&D Systems (Минеаполис, Минесота, САЩ). Покрити с хидроксиапатит плаки бяха закупени от Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). Първичните антитела за NFATc1 и CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния, САЩ); IkB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK и P-JNK (технология за клетъчно сигнализиране, Dan vers, MA, САЩ); и -актин (CWBIO, Пекин, Китай) също беше получен. Другите реагенти, използвани в това изследване, са с аналитичен клас и водата е пречистена от системата за пречистване на вода Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). 2.2. CDP екстракция CD се смила на фин прах и се смесва с петролеев етер три пъти, за да се унищожи. Твърдият остатък се събира чрез филтруване и след това се суши при стайна температура. Полизахаридите се екстрахират от предварително обработените проби три пъти с вода в продължение на 2 часа, концентрират се, утаяват се чрез добавяне на безводен етанол до крайна концентрация от 80 процента (v/v) и се съхраняват при 4 ◦C в продължение на 24 часа. Утайките се събират чрез центрофугиране при 3000 rpm за 20 минути, разтварят се в дестилирана вода и се пречистват (отстраняване на свободни протеини) с помощта на метода Sevag (Zhao et al., 2019). Възстановените полизахариди бяха диализирани, изсушени и съхранени до следваща употреба. Освен това резултатите от химичния състав показват, че общото съдържание на захар, уронова киселина, сулфат и протеин в CDP е 67,63 ± 0,98 процента, 21,05 ± 0,49 процента, 1,90 ± 0,24 процента и 8,81 ± 0,36 процента. Монозахаридният състав и инфрачервеният анализ на трансформацията на Фурие на CDP са показани на допълнителна фигура 1 и 2. 2.3. Миши модел на индуцирана от OVX остеопороза Всички експерименти с животни бяха одобрени от Комитета по етика на животните към Университета по китайска медицина в Гуанджоу (одобрен SYXK 2019-0202). Тридесет 6-седмични женски мишки C57BL/6 бяха доставени от Центъра за експериментални животни към Университета по китайска медицина в Гуанджоу. След аклиматизация в продължение на 1 седмица, една група мишки беше подложена на фиктивна операция (Sham group), докато останалите мишки бяха подложени на операция за овариектомия (OVX група). След операцията мишките бяха оставени да се възстановят за 1-седмица. След това успешно моделираните мишки бяха разделени на случаен принцип в 5 групи, с 6 мишки на група: (1) фалшива група: третирани с дестилирана вода, (2) OVX група: третирани с дестилирана вода, (3) OVX плюс E2 група (E2) : лекувани с 0,13 mg/kg таблетки естрадиол валерат, (4) OVX плюс CDP група с ниска доза (CDP-L): лекувани с 300 mg/kg CDP, (5) OVX плюс CDP група с висока доза (CDP H): лекувани с 600 mg/kg CDP. Дестилирана вода, E2 или CDP се прилага чрез сонда веднъж дневно. Всички мишки бяха умъртвени след 12--седмичния период на лечение (Фиг. 1А). Матките бяха събрани и претеглени, а левите пищяли бяха събрани за последващи изследвания. Бяха събрани проби от цяла кръв и центрофугирани при 5000 rpm за 15 минути при 4 °C. Серумните супернатанти се аспирират и съхраняват при -80 ◦C до по-нататъшен анализ. 2.4. Анализ с микрокомпютърна томография (микро-CT) и костна хистоморфометрия. Левите пищяли бяха фиксирани с 4 процента параформалдехид за 48 часа и след това поставени в центрофужни епруветки, съдържащи нормален физиологичен разтвор. Фиксираните проби бяха сканирани с апарат Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Белгия) при следните настройки: напрежение, 80 kV; ток на източника, 100 μA; Al, 0,5 mm филтър; размер на пиксела, 9.76 μm; и стъпка на въртене, 0.6◦. Няколко параметъра на трабекуларната кост, включително костна минерална плътност (BMD), костна обемна фракция (BV/TV), костна повърхност спрямо общ обем (BS/TV), трабекуларен брой (Tb. N) и трабекуларно разстояние (Tb.Sp ) бяха измерени с помощта на софтуер CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Триизмерни изображения бяха генерирани с помощта на софтуер CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). След микро-КТ анализ левите пищяли бяха декалцифицирани в 14% разтвор на EDTA и поставени в парафин за нарязване. Пробите бяха нарязани на 5 µm секции с помощта на микротом преди експериментите за оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) и TRAcP. Оцветените срезове бяха изследвани и документирани с помощта на микроскоп Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Токио, Япония). 2.5. Серумен анализ Концентрациите на калций (Ca) и фосфор (P) се определят съгласно инструкциите на комплекта, разработени от Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Китай). Нивата на TRAcP-5b и RANKL в серума бяха анализирани с помощта на TRAcP-5b ELISA комплект (CUSABIO, Ухан, Китай) и RANKL ELISA комплект (Cloud-CloneCorp., Ухан, Китай), съответно.

CD с химикали и колекция от проби (№ 180801) е закупен от Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Анхуей, Китай) и е идентифициран от професор Хайбо Хуанг от Училището по Фармацевтични науки, Университет по китайска медицина в Гуанджоу, Гуанджоу, Китай. Таблетките естрадиол валерат са закупени от Bayer (Леверкузен, Северен Рейн Вестфалия, Германия). Алфа-модифицирана минимална есенциална среда (-MEM) и фетален говежди серум (FBS) бяха получени от Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Пеницилин/стрептомицин и комплектът за оцветяване с TRAcP са придобити от Solarbio (Пекин, Китай). Рекомбинантен миши M-CSF и рекомбинантен миши RANKL бяха осигурени от R&D Systems (Минеаполис, Минесота, САЩ). Покрити с хидроксиапатит плаки бяха закупени от Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). Първичните антитела за NFATc1 и CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния, САЩ); IkB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK и P-JNK (технология за клетъчно сигнализиране, Dan vers, MA, САЩ); и -актин (CWBIO, Пекин, Китай) също беше получен. Другите реагенти, използвани в това изследване, са с аналитичен клас и водата е пречистена от системата за пречистване на вода Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). 2.2. CDP екстракция CD се смила на фин прах и се смесва с петролеев етер три пъти, за да се унищожи. Твърдият остатък се събира чрез филтруване и след това се суши при стайна температура. Полизахаридите се екстрахират от предварително обработените проби три пъти с вода в продължение на 2 часа, концентрират се, утаяват се чрез добавяне на безводен етанол до крайна концентрация от 80 процента (v/v) и се съхраняват при 4 ◦C за 24 ч. Утайките се събират чрез центрофугиране при 3000 rpm за 20 минути, разтварят се в дестилирана вода и се пречистват (отстраняване на свободните протеини) с помощта на метода Sevag (Zhao et al., 2019). Възстановените полизахариди бяха диализирани, изсушени и съхранени до следваща употреба. Освен това резултатите от химичния състав показват, че общото съдържание на захар, уронова киселина, сулфат и протеин в CDP е 67,63 ± 0,98 процента, 21,05 ± 0,49 процента, 1,90 ± 0,24 процента и 8,81 ± 0,36 процента. Монозахаридният състав и инфрачервеният анализ на трансформацията на Фурие на CDP са показани на допълнителна фигура 1 и 2. 2.3. Миши модел на индуцирана от OVX остеопороза Всички експерименти с животни бяха одобрени от Комитета по етика на животните към Университета по китайска медицина в Гуанджоу (одобрен SYXK 2019-0202). Тридесет 6-седмични женски C57BL/6 мишки бяха доставени от Центъра за експериментални животни към Университета по китайска медицина в Гуанджоу. След аклиматизация в продължение на 1 седмица, една група мишки беше подложена на фиктивна операция (Sham group), докато останалите мишки бяха подложени на операция за овариектомия (OVX група). След операцията мишките бяха оставени да се възстановят за 1-седмица. След това успешно моделираните мишки бяха разделени на случаен принцип в 5 групи, с 6 мишки на група: (1) фалшива група: третирани с дестилирана вода, (2) OVX група: третирани с дестилирана вода, (3) OVX плюс E2 група (E2) : лекувани с 0,13 mg/kg таблетки естрадиол валерат, (4) OVX плюс CDP група с ниска доза (CDP-L): лекувани с 300 mg/kg CDP, (5) OVX плюс CDP група с висока доза (CDP H): лекувани с 600 mg/kg CDP. Дестилирана вода, E2 или CDP се прилага чрез сонда веднъж дневно. Всички мишки бяха умъртвени след 12--седмичния период на лечение (Фигура 1А). Матките бяха събрани и претеглени, а левите пищяли бяха събрани за последващи изследвания. Бяха събрани проби от цяла кръв и центрофугирани при 5000 rpm за 15 минути при 4 °C. Серумните супернатанти се аспирират и съхраняват при -80 ◦C до по-нататъшен анализ. 2.4. Анализ с микрокомпютърна томография (микро-CT) и костна хистоморфометрия. Левите пищяли бяха фиксирани с 4 процента параформалдехид за 48 часа и след това поставени в центрофужни епруветки, съдържащи нормален физиологичен разтвор. Фиксираните проби бяха сканирани с апарат Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Белгия) при следните настройки: напрежение, 80 kV; ток на източника, 100 μA; Al, 0,5 mm филтър; размер на пиксела, 9.76 μm; и стъпка на въртене, 0.6◦. Няколко параметъра на трабекуларната кост, включително костна минерална плътност (BMD), костна обемна фракция (BV/TV), костна повърхност спрямо общ обем (BS/TV), трабекуларен брой (Tb. N) и трабекуларно разстояние (Tb. Sp ) бяха измерени с помощта на софтуер CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Триизмерни изображения бяха генерирани с помощта на софтуер CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). След микро-КТ анализ левите пищяли бяха декалцифицирани в 14% разтвор на EDTA и поставени в парафин за нарязване. Пробите бяха нарязани на 5 µm секции с помощта на микротом преди експериментите за оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) и TRAcP. Оцветените срезове бяха изследвани и документирани с помощта на микроскоп Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Токио, Япония). 2.5. Серумен анализ Концентрациите на калций (Ca) и фосфор (P) се определят съгласно инструкциите на комплекта, разработен от Nanjing

Институт по биоинженерство Jiancheng (Нанкин, Китай). Нивата на TRacP{{0}}b и RANKL в серума бяха анализирани с помощта на комплект TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Ухан, Китай) и комплект RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Ухан, Китай) , съответно. 2.6. In vitro анализ на остеокластогенезата BMM бяха изолирани от тибията и бедрената кост на 6-седмични женски C57BL/6 мишки. Изолираните клетки се култивират в -MEM среда, съдържаща 25 ng/mL M-CSF, 1 0 процента FBS и 1 процент пеницилин/стрептомицин. При достигане на сливане, BMMs (1 × 104 клетки/ямка) се посяват в 96-плаки с ямки и се третират с CDP в присъствието на 50 ng/mL RANKL. Средата и CDP се сменят на всеки 2 дни. След 7 дни клетките се фиксират с 4% параформалдехид и се оцветяват за наличие на следи. Броят на остеокластите, определени като TRAcP положителни клетки с три или повече ядра, беше преброен и документиран с помощта на светлинен микроскоп. 2.7. Анализ на клетъчна пролиферация BMMs (1 × 104 клетки/ямка) се посяват в 96-плака с ямки и се инкубират за една нощ. След това клетките бяха третирани с различни концентрации на CDP (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 и 40 ug/mL) в продължение на 48 часа. Клетъчното сливане беше открито и анализирано с помощта на IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA), дългосрочна динамична система за изображения на живи клетки в реално време. 2.8. Тест за резорбция на хидроксиапатит BMM (1 × 104 клетки/ямка) се посяват в покрита с хидроксиапатит плака, третират се с CDP при посочените концентрации (0, 5 и 10 µg/mL) и се култивират в пълен -MEM, съдържащ 25 ng/ mL M-CSF и 50 ng/mL RANKL. След 7 дни клетките се промиват с 10% разтвор на белина, за да се отстранят клетъчните компоненти. Изображенията на областите на резорбция на хидроксиапатит бяха заснети с помощта на IncuCyte ZOOM® и анализирани с помощта на софтуер ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003). 2.9. Изолиране на РНК и обратна транскрипция-количествен PCR (RT-qPCR) анализ в реално време BMMs (1 × 105 клетки/ямка) се посяват в 6-ямкова плака и се стимулират с RANKL и M-CSF в присъствието на CDP при различни концентрации (0, 5 и 10 µg/mL) за 5 дни. Общата РНК се изолира от клетките или костната тъкан на мишки с помощта на TRIzol реагент (Sigma Aldrich). Допълнителна ДНК се синтезира от 2 µg обща РНК с помощта на комплект за обратна транскриптаза (TransGen Biotech, Пекин, Китай). RT-qPCR реакциите бяха приготвени с помощта на PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) и открити от ABI 7500 система (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, САЩ). Параметрите на цикъла за PCR бяха зададени както следва: 95 °C за 5 минути, последвани от 40 цикъла от 95 °C за 15 s и 60 °C за 30 s. Използваните специфични праймери са показани в таблица 1 и количеството на всеки целеви ген се нормализира до GAPDH (вътрешен контрол).

2.10. Western blot анализ BMMs (5 × 105 клетки/ямка) се посяват в 6-плака с ямки. За експерименти с кратък период от време клетките бяха предварително инкубирани с различните концентрации на CDP (0, 5 и 10 µg/mL) за 1 час и след това третирани с 5{{ 58}} ng/mL RANKL за 30 минути. За дълго време клетките бяха стимулирани с 50 ng/mL RANKL на дни 3, 5 и 7 в присъствието на CDP (0, 5 и 10 ug/mL). Общите протеини се екстрахират с помощта на RIPA лизисен буфер (CWBIO). Протеините бяха разделени с 10 процента SDS-PAGE и прехвърлени към PVDF мембрани. Мембраните бяха блокирани с 5% обезмаслено мляко при стайна температура в продължение на 2 часа, инкубирани с първични антитела за една нощ при 4 ◦C и след това със съответните вторични антитела в продължение на 1,5 часа. Мембраните са разработени с помощта на ECL реагенти (Millipore Corp., Billerica, Масачузетс, САЩ), а изображенията са направени с помощта на Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, China). 2.11. Откриване на NFATc1 транслокация с помощта на имунофлуоресцентен тест BMMs се посяват върху 12-покривни стъкла на ямки, стимулират се с RANKL и M-CSF и се третират с 10 µg/mL CDP в продължение на 5 дни. Клетките се фиксират с 4 процента параформалдехид за 15 минути, промиват се три пъти с PBS и се пропускат с 0,1 процента Triton X -100 за 10 минути. Клетките се смесват с 10% кози серум (CWBIO) и се инкубират в продължение на 2 часа. Впоследствие клетките се инкубират с първичното антитяло за една нощ при 4 ◦C и след това с Alexa Fluor 488 козе анти-мише вторично антитяло (Abcam, Cambridge, MA, USA) на тъмно за 1 час. Покривните стъкла се промиват с PBS, монтират се в реагент Prolong Gold Antifade с 4', 6-диамидино-2-фенил индол (DAPI) (Solar) и се инспектират с помощта на Zeiss LSM 800 с конфокален микроскоп Airyscan ( Carl Zeiss, Оберкохен, Германия). 2.12. Статистически анализ Всички експериментални данни бяха анализирани с помощта на статистически софтуер SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Данните за изследвания върху животни и клетки са изразени съответно като средно ± SEM и средно ± SD. Резултатите се използват с еднопосочен дисперсионен анализ или t-тест на Student. Стойностите на p <0,05 се="" считат="" за="" статистически="" значими.="" 3.="" резултати="" 3.1.="" cdp="" предотвратява="" индуцирана="" от="" ovx="" костна="" загуба="" in="" vivo="" използвахме="" миши="" модел="" на="" индуцирана="" от="" ovx="" остеопороза,="" за="" да="" изследваме="" ефектите="" от="" лечението="" с="" cdp="" върху="" остеопороза="" in="" vivo.="" в="" сравнение="" с="" групата="" sham,="" телесното="" тегло="" на="" ovx="" мишки="" значително="" се="" увеличава,="" докато="" индексът="" на="" матката="" намалява,="" което="" показва,="" че="" моделът="" на="" остеопороза="" е="" конструиран="" успешно="" (фиг.="" 1b="" и="" d).="" микро-кт="" анализът="" на="" пищялите="" в="" групата="" ovx="" показа="" обширна="" костна="" загуба.="" в="" сравнение="" с="" групата="" ovx,="" броят="" на="" костните="" трабекули="" се="" увеличава="" в="" групата="" cdp-l,="" докато="" увеличението="" в="" групите="" cdp-h="" и="" e2="" е="" по-значително,="" а="" трабекулите="" в="" последните="" две="" групи="" стават="" по-груби="" и="" разликата="" става="" по-малка="" (="" фиг.="" 1c).="" количественият="" анализ="" потвърди,="" че="" няколко="" костни="" хистоморфометрични="" параметъра,="" включително="" bmd,="" bv/tv,="" bs/tv="" и="" tb.="" n="" има="" значително="" повишени="" стойности,="" докато="" tb.="" sp="" показва="" намалени="" стойности="" в="" групата="" на="" cdp-h="" (фиг.="" 1e="" и="" f).="" неговото="" патологично="" изследване="" с="" помощта="" на="" h&e="" оцветяване="" разкрива,="" че="" броят="" на="" костните="" трабекули="" в="" групите="" cdp-h="" и="" e2="" е="" значително="" по-висок="" от="" този="" в="" групата="" ovx,="" докато="" няма="" значително="" подобрение="" в="" групата="" cdp-l="" (фиг.="" 1g).="" освен="" това,="" оцветяването="" с="" tracp="" показа,="" че="" броят="" на="" остеокластите="" значително="" се="" е="" увеличил="" в="" групата="" ovx,="" но="" е="" намалял="" в="" групите="" cdp-h="" и="" e2="" (фиг.="" 1н).="" групите="" cdp-l,="" cdp-h="" и="" e2="" показват="" инхибиране="" на="" индуцираното="" от="" ovx="" повишаване="" на="" съдържанието="" на="" p,="" но="" повишават="" съдържанието="" на="" ca="" в="" кръвния="" серум.="" маркерите="" за="" костна="" абсорбция,="" rankl="" и="" tracp-5b="" показват="" тенденция="" на="" намаляване="" на="">

групата без статистическа разлика, докато те са значително намалени в групата на CDP-H (фиг. 1I). Освен това, ние изследвахме ефекта на CDP върху експресията на остеокластни маркерни гени в костните тъкани чрез RT-qPCR. Нивата на mRNA на NFATc1, Acp5, Mmp9 и CTSK в групата OVX са значително по-високи от тези в групата Sham. Групите CDP-H показват понижение на нивото на иРНК на NFATc1, Acp5 и CTSK с 1.74-, 1.70- и 2.{14}}пъти в сравнение с групата на OVX. (Фиг. 1J). 3.2. CDP потиска RANKL-индуцираната остеокластогенеза in vitro Ние наблюдавахме клетъчната пролиферация на BMM, третирани с CDP, използвайки дългосрочен динамичен анализатор за изображения на живи клетки в реално време. В сравнение с контролната група, клетъчното сливане в групите, третирани с CDP, не се променя при доза<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="" cdp="" on="" ranklinduced="" osteoclastogenesis,="" bmms="" were="" stimulated="" with="" rankl="" and="" mcsf="" in="" the="" presence="" of="" cdp="" for="" 7="" days.="" tracp,="" a="" characteristic="" enzyme="" of="" osteoclasts,="" is="" considered="" as="" an="" indicator="" of="" osteoclast="" function="" (minkin,="" 1982).="" tracp="" staining="" showed="" that="" the="" osteoclasts="" treated="" with="">1,25 µg/mL CDP показва значително намален размер и брой (Фиг. 2B и C). Тези резултати показват, че CDP ефективно инхибира очакваната RANKL-индуцирана остеокластогенеза, без да засяга клетъчната жизнеспособност. 3.3. CDP инхибира RANKL-индуцираната остеокластична резорбционна активност и остеокластно-специфична генна експресия Ние допълнително определихме ефектите от лечението с CDP върху костната резорбционна активност на остеокластите, използвайки покрити с хидроксиапатит плаки. Костната резорбция е основната функция и стандарт за измерване на активността и способността на остеокластите (Novack & Faccio, 2011). Резултатите показват, че CDP може значително да намали костно-резорбтивната област на остеокластите по дозозависим начин, което показва, че CDP инхибира активността на костна резорбция, индуцирана от RANKL (Фиг. 3A и B). По-специално, остеокластичната костно-резорбтивна област намалява до приблизително 6,3 процента след лечение с 10 µg/mL CDP. За да разберем по-добре препятствието на CDP върху остеокластогенезата, ние измерихме нивата на транскрипция на гени, свързани с остеокласти. Без лечение с CDP, индукцията с RANKL насърчава експресията на NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 и Mmp9 гени. Напротив, едновременното прилагане на CDP и RANKL значително понижи тези пет гена (фиг. 3C и D).

3.4. CDP инхибира RANKL-индуцираното активиране на NFATc1. TRacP оцветяването разкрива, че лечението с CDP значително намалява очакваното увеличение на броя на зрелите остеокласти след RANKL стимулация за 3-7 дни (Фигури 4A и B). Освен това, ние изследвахме дали лечението с CDP може ефективно да увреди диференциацията на остеокластите чрез инхибиране на експресията на NFATc1. Резултатите показват, че NFATc1 е силно експресиран след RANKL стимулация в продължение на 5 дни, което е значително инхибирано след лечение с CDP (фиг. 4C и D). В допълнение, лечението с CDP потиска нивата на експресия на CTSK, протеин, необходим за нормално образуване и функция на остеокласти (Bossard et al., 1996) (Фиг. 4E и F). Ние избрахме моментно представяне на RANKL стимулация за 5 дни, за да проучим допълнително ефекта от 10 µg/mL лечение с CDP върху NFATc1 транслокация. Както се очакваше, лечението с CDP значително инхибира RANKL-индуцираната NFATc1 ядрена транслокация (фиг. 4G и H).

Фиг. 4. CDP потиска RANKL-индуцираното NFATc1 активиране. (A) BMM се посяват в 6-плака с ямки и се стимулират с RANKL и M-CSF в присъствието на CDP (0, 5 и 10 µg/mL) за посочените дни. Представителни изображения, показващи TRacP-положителни многоядрени клетки. Увеличение, ×100. Скалови ленти {{10}} μm. (B) Количествено определяне на TRacP-положителни многоядрени клетки (ядра, по-големи или равни на 3). (CF) Western blot анализ на NFATc1 и CTSK протеинови експресии, в BMMs, стимулирани с M CSF и RANKL за 3–7 дни в присъствието на CDP. (G) BMM бяха третирани с 1 0 ug/mL CDP и стимулирани от M-CSF и RANKL в продължение на 5 дни, след това имунооцветени с NFATc1 (зелен) и DAPI (син) и наблюдавани с помощта на конфокален микроскоп. Увеличение, ×200. Скала=20 μm. (H) Интензитетът на флуоресценция се анализира с помощта на Image-Pro Plus. Стойностите са изразени като средни стойности ± SD (n=3). *p <0.05, **p=""><0.01, ***p=""><0.001 спрямо="" контролната="" група;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" спрямо="" rankl="" група.="" 3.5.="" cdp="" инхибира="" rankl-индуцираното="" активиране="" на="" nf-κb="" и="" mapks="" сигналните="" пътища.="" за="" да="" изясним="" механизмите,="" включени="" в="" cdp-индуцираното="" инхибиране="" на="" остеокластната="" диференциация,="" ние="" изследвахме="" въздействието="" на="" лечението="" с="" cdp="" върху="" nf-κb="" и="" mapks="" пътищата.="" резултатите="" разкриха,="" че="" лечението="" с="" cdp="" има="" потискащи="" ефекти="" върху="" разграждането="" на="" ikb="" и="" фосфорилирането="" на="" p65="" по="" дозозависим="" начин="" (фиг.="" 5a="" и="" b).="" фосфорилирането="" на="" три="" членове="" на="" семейството="" mapks,="" по-специално="" екстрацелуларна="" сигнал-регулирана="" киназа="" (erk),="" c-jun="" n-терминална="" киназа="" (jnk)="" и="" p38="" бяха="" регулирани="">

Дискусия

Остеопорозата е често срещано и дегенеративно заболяване на костите. Понастоящем има много лекарства с химически синтез, използвани в клиничните лечения на остеопороза, като естроген и бифосфонат. Въпреки това, дългосрочната употреба на тези лекарства постепенно ще отслаби клиничната ефикасност и дори ще причини много сериозни странични ефекти, включително повишен риск от рак на яйчниците, гърдата и ендометриума и остеонекроза на челюстта (Beral, 2003 ; Khan et al., 2009; Lacey et al., 2002). Докато в това проучване ние избрахме CDP, ефективен компонент, извлечен от CD, като терапевтичен агент и демонстрирахме, че CDP има защитен ефект срещу загуба на кост при OVX мишки и инхибира RANKL-индуцираното образуване и функция на остеокласти. Междувременно, според теорията на традиционната китайска медицина за "бъбреците, управляващи костите", загубата на кост се дължи на бъбречни недостатъци. Като тонизираща бъбреците медицинска храна, CD е доказано, че осигурява ефективно лечение на остеопороза (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li, & Zhang, 2016). По този начин CDP, извлечен от тази естествена билка, е по-добър и по-безопасен вариант за лекарство. Понастоящем моделът на мишка OVX е класически модел на костна загуба след менопауза при жени, изследвайки причините за костна загуба и провеждайки интервенция (Wehrle et al., 2015). Съответно, извършихме двустранна оофоректомия на C57BL/6J женски мишки, за да конструираме модел на остеопороза. В предишни проучвания дозите на CDP, давани на животни, са били 50–200 mg/kg (ниска доза) и 1800 mg/kg (висока доза) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). Тук високата доза CDP при мишки е 600 mg/kg, което се основава на високата клинична доза от 30 g CD в отвара; по този начин е подобно на настоящата клинична практика. В това проучване лечението с CDP значително инхибира OVX-индуцираното наддаване на телесно тегло, което е често срещано явление, наблюдавано при OVX мишки (Davis et al., 2019). Чрез използване на микро-CT сканиране и 3D реконструкция ние открихме, че OVX води до забележимо намаляване на BMD, BV/TV, BS/TV и Tb.N и повишаване на Tb.Sp, докато лечението с CDP обръща всички тези промени . По-специално, в сравнение с положителното лекарство, CDP може значително да подобри BMD на OVX мишки, което е важен маркер за качество на костите и се използва за отразяване на степента на остеопороза (Fuggle et al., 2019), което показва, че CDP има предимство над положителното лекарство за подобряване на BMD. Освен това, хистологичните резултати показват, че лечението с CDP може да намали повишеното количество на TRacP-положителни остеокласти, индуцирани от OVX. Тези резултати предполагат, че администрирането на CDP ефективно смекчава костната загуба при индуцирана от OVX остеопороза, вероятно чрез инхибиране на образуването на остеокласти. В съответствие с горните резултати, ние открихме, че CDP зависи от дозата инхибира RANKL-индуцираното остеокластично образуване и функция, докато CDP има малък ефект върху M-CSF-индуцираната пролиферация на прекурсорни клетки на остеокласти в нашите in vitro експерименти. Свързването на RANKL и RANK може да доведе до набиране на TRAF6 и последващо активиране на няколко низходящи сигнални пътища, като NF-κB и MAPKs (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). NF-κB сигнализиращият път играе важна роля в регулирането на диференциацията на остеокластите и заглушаването на гени, кодиращи ключови протеини в този път, може да доведе до анормално развитие на костите (Leibbrandt & Penninger, 2008). Добре установено е, че NF-κB присъства в цитоплазмата на нестимулирани клетки в комплекс с IκB, но бързо навлиза в ядрото след RANKL стимулация (Boyle et al., 2003). Освободеният IκB след това бързо се разгражда, докато NF-κB активира специфична генна транскрипция, като впоследствие насърчава диференциацията на остеокластите, узряването и апоптозата (Abdelmagid et al., 2015). В това проучване резултатите показват, че лечението с CDP потиска RANKL индуцираното активиране на NF-κB сигналния път, както се демонстрира чрез инхибиране на разграждането на IκB и фосфорилирането на p65 по дозозависим начин, което може да включва неговия антиостеокластогенен ефект . В допълнение, MAPKs сигнализиращият път, включително ERK, JNK и p38, са тясно включени в индуцираната от RANKL остеокластогенеза (Li et al., 2002). Освен това, доминиращите инхибитори на p38 и JNK могат да предотвратят RANKL-индуцирана остеокластогенеза (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), докато ERK играе значителна роля в оцеляването на остеокластите (Miyazaki et al., 2000). Добре установено е, че RANKL активира MAPKs сигналния път чрез увеличаване на фосфорилирането на ERK, JNK и p38 (Mizukami et al., 2002). В нашето проучване ние демонстрирахме, че CDP потиска RANKL-индуцираното фосфорилиране на ключови протеини в сигналния път на MAPKs. Взети заедно, тези резултати показват, че инхибирането на активирането на сигналните пътища на NF-κB и MAPKs допринася за инхибиторния ефект на CDP срещу остеокластогенезата. Активирането на NF-κB и MAPKs сигналните пътища насърчава експресията на няколко ключови транскрипционни фактора, като клетъчен онкоген fos, активаторен протеин 1 и NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, важен член на семейството на NFAT, участва в крайната остеокластна диференциация като главен транскрипционен регулатор (Asagiri et al., 2005). Съобщава се, че ембрионалните стволови клетки с дефицит на NFATc1- не могат да се диференцират в остеокласти при стимулиране на RANKL и ектопичната експресия на NFATc1 кара прекурсорните клетки да претърпят диференциация, заобикаляйки сигнализирането на RANKL, което предполага, че NFATc1 има критична роля в остеокластна диференциация (Takayanagi et al., 2002). Резултатите от нашето проучване показаха потискащия ефект на CDP върху експресията на NFATc1 и неговия следващ протеин CTSK. Интересно е, че наблюдавахме, че нивото на експресия на протеин на NFATc1 първо се повишава и след това намалява, достигайки най-високото ниво на 5-ия ден след RANKL стимулация. Това е в съответствие с резултатите на Baek et al. (2014), които наблюдават M-CSF индуцирано разграждане на NFATc1 по време на късен етап на остеокластогенеза чрез Cbl-индуцирано убиквитиниране на NFATc1 по Src киназа-зависим начин. Резултатите от имунофлуоресцентния анализ последователно подкрепят инхибиторния ефект на CDP върху NFATc1 транскрипционното активиране. Освен това, остеокласт-специфичните гени, включително CTSK, Acp5, Mmp9 и Atp6v0d2, всички се регулират директно от NFATc1 (Y. Kim et al., 2005), бяха потиснати от CDP. Тези констатации илюстрират, че NFATc1 е цел на инхибиторния ефект на CDP върху сигналните пътища на NF-κB и MAPKs.

Заключение

В обобщение, ние извлякохме и пречистихме активния полизахарид от CD и демонстрирахме, че CDP проявява защитен ефект върху индуцирана от OVX остеопороза и подобрена костна загуба чрез потискане на активността и функцията на остеокластите. Освен това, CDP може да инхибира индуцираната от RANKL диференциация и функция на остеокластите чрез намеса в сигналните пътища на NF-κB и MAPKs и следователно повлияване на NFATc1 активирането надолу по веригата. В заключение, нашите открития осигуряват основата за разширяване и прилагане на CDP при лечението на остеопороза.

Тази статия идва от списъците със съдържание, достъпни на началната страница на списание ScienceDirect Journal of Functional Foods: www.elsevier.com/locate/jff