Cistanche Deserticola Polysaccharides засилва диабетната нефропатия при мишки, като влияе на чревната флора и инхибира рецептора на тол-подобен рецептор 4/ядрен фактор-κB сигнална пътека

Резюме: Целта на това проучване беше да се проучи амиоративният ефект иПотенциален механизъм на полизахаридите на Cistanche Deserticola (CDP)надиабетна нефропатия (DN)при мишки. Моделът на мишка DN е установен чрез хранене с високо съдържание на мазнини (HFD), комбинирано с интраперитонеална инжекция на стрептозотоцин (STZ). Тридесет и шест C57BL/6N мъжки мишки бяха разделени на случаен принцип на шест групи (n=6 всяка). Всички групи се прилагат перорално с дестилирана вода (контрол и модел), дапаглифлозин или CDP за 4 седмици. Промени във физиологичните индекси, бъбречната функция,Възпалителни фактории бяха оценени чревната микробиота. Резултатите показват, че CDP значително подобряват общото състояние и намаляватбъбречни хистопатологични промениинамали нивата на кръвната глюкоза, уринарен протеиниВъзпалителни факториВ DN мишки. Освен това, CDP повлияха на баланса на чревната микробиота, увеличиха изобилието от полезни бактерии и намаляват потенциалните патогенни бактерии, което от своя страна подобри функцията на чревната бариера. CDP също инхибират активирането на сигналния път на рецептора 4/ядрен фактор-фактор-фактор (TLR4/NF-κB) и намаляват освобождаването на липополизахарид (LPS). В заключение, CDP проявяват амелиоративен ефект върху DN при мишки, като влияят на чревната микробиота и инхибират възпалителните сигнални пътища. Тази констатация предлага нова представа за лечението на DN.

 

Ключови думи: Cistanche Deserticola Polysaccharides;диабетна нефропатия; чревна бариера; чревна флора; Рецептор, подобен на тол 4; ядрен фактор-κB

 

Екстракт от Cistanche Deserticola с висококачествени суровини

Щракнете, за да получите повече подробности

 

 

 

Диабет нефропатия (DN)е водещата причина за бъбречно заболяване в краен стадий и сериозно заплашва живота и здравето на пациентите [1]. Проучванията потвърждават, че дисбалансът на чревната флора играе важна патогенна роля в процеса на диабет, развиващ се в DN [2-3]. Теорията на „оста-кидни“ вярва, че промените в чревната микросреда могат да повлияят на прогресията на хроничното бъбречно заболяване чрез директно регулиране на метаболитите на чревната флора [2-3]. Чревната флора играе важна роля за регулиране на бъбречната функция в DN миши модели [4-5]. Задълбочените изследвания на „оста-кидни“ ще помогнат да се изясни патогенезата на DN и да открие нови цели за превенция и лечение.
Cistanche Deserticola е традиционно лекарствено и ядливо растение, известно още като Cistanche Deserticola, Dijing, Jinsun и др., Обикновено известен като Dayun, и има репутацията на „пустинен женшен“ [6]. Според фармакопеята на Китайската народна република, Cistanche Deserticola е изсушеното месесто стъбло с люспести листа на Cistanche Deserticola YC Ma или C. Tubulosa (Schenk) Wight, растение от рода Cistanche в семейството Orobanchaceae.
Сред тях Cistanche Deserticola има дълга история да се използва както като лекарство, така и като храна. Cistanche Deserticola е сладка, солена и топла по природа и влиза в меридианите на бъбреците и дебелото черво. Той има ефектите от тонизиращия бъбречен ян, облагодетелствайки същността и кръвта и навлажняване на червата и облекчаване на запека [7-8]. Полизахаридите са една от основните активни съставки на Cistanche Deserticola. Съдържанието на полизахаридите в извличането на вода на Deserticola Cistanche е сравнително високо. Той е съставен главно от монозахариди като глюкоза, галактоза, рамноза, арабиноза и фруктоза. Той има много фармакологични ефекти като регулиране на имунната активност, анти-стареене, подобряване на обучението и паметта, защита на нервите, съпротива на увреждане на черния дроб, антивирус и антитумор [9-12]. Предишни проучвания на изследователската група показват, че водният екстракт от Deserticola Cistanche има потенциален терапевтичен ефект върху DN [13]. Въз основа на това този експеримент прие чревната флора и възпалителната реакция като отправна точка за изследване на ефекта на полизахаридите на Cistanche Deserticola (CDP) върху подобряването на DN при мишки и възстановяване на функцията на бъбреците, за да се осигури научна основа за ролята на CDP при лечението на DN.

1 Материали и методи

1.1 Животни, материали и реагенти

36 6- Седмичен C57BL/6J Мъжки мишки са закупени от Центъра за експеримент на животни на Медицинския университет Xinjiang, лиценз за производство на животни №: SCXK (XIN) 2023-0006; Резолюция на етиката №: IACUC -20210331-04.
Пустинни CDP (полизахаридна масова фракция ＞ 80%, номер на партида: 2306019) Shaanxi Xintianyu Company; Dapagliflozin (DAPA; номер на партида: 2108119) Astrazeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.; Общият протеин на урината (общият протеин на урината, UTP; партиден номер: C 035-2-1), азот на урея (кръвен урея азот, кифличка; партиден номер: C 013-2-1), креатинин (креатинин, CRE; партиден номер: C {011-2-1), Utic Acid (Uricacid, UA; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; lipopolysaccharide (LPS; batch number: YX-121619M), interleukin-6 (IL-6; batch number: YX-E20012), IL-1 (batch number: YX-E20533), transforming growth factor- (TGF- ; batch number: YX-E20217), фактор на тумор некроза- (TNF-; номер на партида: YX-E20220) Kit Shanghai Youxuan Biological Co., Ltd.; Enhanced Chemiluminescene (ECL) Kit Beijing Pulilai Gene Technology Co., Ltd.; Streptozotocin (STZ; номер на партида: 20230503), диета с високо съдържание на мазнини (60% съотношение на мазнини с високо съдържание на мазнини Диета Пречистен тип, Номер на материала: Boaigang12492m) Beijing Boaigang Biotechnology Co., Ltd.
Основната храна (съдържаща 22% царевично брашно, 12% трици, 18% маслени остатъци, 8% рибено брашно, 12% соево хранене, 0. 17% сол, 0. 25% витамини, {9}}. 25% следи елементи, {0}. Медицински университет.

 

1.2 Инструменти и оборудване

AE240 Аналитичен баланс, Mettler-Toledo Instrument Co., Ltd., Швейцария; DHG -9053 Електрическо отоплително изсушаване на фурна, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.; DK-S22 Водна баня с постоянна температура, Shanghai Jinghong Experimental Instrument Co., Ltd.; 3-18 KS високоскоростен нискотемпературен центрофуга, Sigmaaldrich, САЩ; BS -380 напълно автоматичен биохимичен анализатор, Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.; EM KMR3 Slicer, Hi1220 Slicer, Leitz Optilux Digital Microscope, Leica, Германия; FluorChem E Chemiluminescion System System, Proteinsimple, САЩ.

1.3 Методи

1.3.1 Експеримент за животни

36 C57BL/6J Мъжки мишки са били хранени в лабораторията на SPF на Медицинския университет Xinjiang и се хранят свободно. Експериментът се провежда след 7 дни адаптивно хранене. Шест мишки са избрани на случаен принцип като нормална (контролна) група и са получили основна диета. Останалите от експерименталните групи се хранят с диета с високо съдържание на мазнини и се съхраняват в отделни клетки. Теглото на тялото беше тествано веднъж седмично. Мишките бяха свободни да ядат и пият вода. След 6 седмици диетично хранене с високо съдържание на мазнини, експерименталните мишки от групата се инжектират със STZ 4 0 mg/kg интраперитонеално в продължение на 5 последователни дни в допълнение към безплатна диета с високо съдържание на мазнини всеки ден. Глюкозата на кръвта на гладно след моделиране е 11,1 mmol/L, което се счита за успешен модел на диабет. Thirty mice with successful modeling were randomly divided into five groups, with six mice in each group, namely the model (distilled water + high-fat diet, Model) group, Dapa (Dapa 4 mg/kg + high-fat diet, Dapa) group, CDPs low-dose (50 mg/kg + high-fat diet, CDPs-L) group, CDPs medium-dose (100 mg/kg + high-fat diet, CDPs-M) group, and CDPS висока доза (200 mg/kg + диета с високо съдържание на мазнини, CDPS-H) група. Контролната група (дестилирана вода + нормална диета) получи равно количество дестилирана вода. Всяка мишка се изписва с 0,1 ml/10 g, веднъж на ден едновременно, общо 4 седмици. Промените на телесното тегло и кръвната глюкоза на мишките се регистрират седмично.

1.3.2 Определяне на индекса

След 4 седмици прилагане на Gavage, пробите от урина (24 часа) и пресни изпражнения се събират чрез метаболитни клетки в края на 4 -та седмица и се съхраняват съответно на -20 градус и -80 градус. Мишките бяха гладни, но не са напоени в продължение на 12 часа. На следващия ден се измерва телесното тегло на гладно на мишките. Мишките се анестезират чрез интраперитонеална инжекция на 3 ml/kg 10% хлорален хидрат разтвор. Кръвта се събира от орбитите и се центрофугира в центрофуга (4 градуса, 3 500 r/min) в продължение на 15 минути. Супернатантата се аспирира, опакова и съхранява в хладилник {-80 за по -късна употреба. Серумът се измерва за Bun, Cre, Ua, Il -6, IL -1, TGF-, TNF- и LPS съгласно комплекта. Урината се измерва за 24 h UTP съгласно комплекта.

 

1.3.3 Морфологично и патологично наблюдение на бъбреците и червата

1.3.3.1 Определяне на коефициента на бъбреците

След събирането на кръв, мишките се анестезират до смърт чрез предозиране, а бъбреците и колоните се отстраняват напълно и веднага се изплакват с предварително охладен физиологичен разтвор, изцедени върху филтърна хартия и се претеглят. Коефициентът на бъбреците се изчислява съгласно следната формула: коефициент на бъбреците/%= × 100 m1m, където M1 е мокрото тегло на бъбреците/g; M е телесното тегло на мишката/g.

 

1.3.3.2 Патологично наблюдение на бъбреците

Мишовите бъбреци се фиксират в 4% параформалдехиден фиксатор, дехидратиран от градиент на разтвор на етанол, прозрачен от ксилол, вграден в парафин, нарязан (дебелина 2 μm), обезмаслен от ксилол и хидратиран от градиент на етанол и след това и след това оцветен с хематоксилин и еозин (H & E), и след това се оцветява с хематоксилин и хидратиран от градиент на етанол и след това и след това оцветени с хематоксилин и еозина (H & E), и след това оцветени с хематоксилин и хидратиран от градиент на етанола и след това и след това оцветени с хематоксилин и еозина (H & E), и след това се оцветяват с хематоксилин и хидратиран от градиент на етанол и след това с хематоксилин и еозина (h & e Запечатаните и изображенията се събират и наблюдават под микроскоп.

 

1.3.3.3 чревно патологично наблюдение

Мишката в червата се фиксира с 4% параформалдехиден фиксатор, дехидратиран с градиент на разтвор на етанол, прозрачен с ксилол, вграден в парафин, нарязан (дебелина 2 µm), е разточен с ксилоп и хидратиран с етанолов градиент, след това оцветени с H & E и алково син наблюдение.

 

 

1.3.4 Анализ на състава на чревната флора

Съдържанието на дебелото черво на мишки в контролната група, моделната група и CDPS-H група са открити чрез 16S rRNA ген с висока пропускателна способност. Извличането на ДНК и изграждането на библиотеки и секвенирането на микроорганизми в съдържанието на дебелото черво са завършени от Lianchuan Biotechnology Co., Ltd., а получените данни са анализирани на облачната платформа Lianchuan.

 

1.3.5 Откриване на експресия на протеин, свързана с бъбреците и дебелото черво

Екстрахират протеините на мишката и тъканите на дебелото черво и протеинът се определя количествено чрез метода на количествено определяне на протеина на бицинхонинова киселина. След денатурация на протеин, протеинът се съхранява в хладилник -20. 10% натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел електрофореза, трансфер на поливинилиден дифлуорид, мембраната се поставя в трис буфериран физиологичен разтвор с инкубационен резервоар с трис и блокиран при стайна температура. Откриване
The primary antibodies to Toll-like receptors (TLR) 4, nuclear transcription factor (NF)-κB p65, p-NF-κBp65, and -actin in kidney tissue (antibody diluted 1:2 000 (V/V) with TBST solution) and occludin and zonula occludens-1 (Zo -1) в тъканта на дебелото черво (разредено антитяло 1: 1 000 (v/v) с разтвор на TBST) се инкубират на 4 градуса за една нощ. TBST разреждане, вторично антитяло (антитяло
разреден с TBST разтвор 1∶ 2 000 (v/v)), инкубиран при стайна температура в продължение на 1 час, промива се с TBST 3 пъти и след това се открива чрез добавяне на ECL луминесцентния реагент и гел изобразяване се използва за откриване на експресия на протеин. -актинът се използва като вътрешна референция и стойността на протеиновото сиво беше анализирана от ImageJ Software. Протеиновата експресия на всяка група се изразява като относителна стойност на сивата стойност на контролната група.

 

1.4 Статистика на данните

Всички резултати от данни бяха изразени като ± S, а SPSS 21. 0 се използва за статистически анализ. За непрекъснати данни, ако те следват нормално разпределение, е използван еднопосочен анализ на дисперсията за сравнение между групите. Ако разликата между групите е статистически значима, методът на Турция е допълнително използван за двойно сравнение; Ако данните следваха нормално разпределение, тестът Kruskal-Wallis H беше използван за сравнение между групите. Когато имаше статистическа разлика между групите, най -малко значимият метод на разликата на Дърбин беше допълнително използван за множество сравнения. P <0. 05 показва, че разликата е статистически значима.

 

 

2 резултати и анализ

2.1 Ефект на CDP върху кръвната глюкоза, телесното тегло и коефициента на бъбреците на C57BL/6J

Както се вижда от таблици 1 до 3, в сравнение с контролната група, кръвната глюкоза на гладното мишки в моделната група е значително увеличена (P<0.01), and the kidney coefficient was significantly increased (P<0.01); compared with the Model group, CDPs- The body weight of mice in group H increased significantly after 4 weeks of administration (P＜0.05), and blood sugar began to decrease after 3 weeks of administration (P＜0.05). The kidney coefficient of mice in each intervention group decreased, and the CDPs-H group was the lowest (P<0.01); the body weight of mice in the Control group was larger than that of each group, indicating that CDPs can slow down the swelling of the kidneys of DN mice, thereby Reduce the kidney coefficient.

 

Таблица 1 Ефекти на CDP върху кръвната глюкоза на мишки (n=6)

Група	Време/седмица
	0	1	2	3	4
Контрол	7.98±0.55	7.32±0.40	7.58±0.50	7.38±0.87	7.28±0.34
Модел	10.62±2.79#	20.32±2.69#	24.47±4.18#	24.92±3.98#	20.33±2.96#
Cdps-l	16.03±2.97	21.83±4.81	20.13±6.97	23.30±3.77	21.25±1.65
CDPS-M	13.17±3.59	22.6±5.88	19.35±4.45	22.6±4.87	18.38±1.20
CDPS-H	11.07±1.74	21.53±3.71	21.57±6.19	17.43±2.05**	15.87±0.90**
Дапа	10.28±4.75	21.12±4.96	17.72±2.00**	17.35±2.00**	14.55±1.06**

Единица: MMOL/L.

 

Таблица 2 Ефекти на CDP върху индекса на бъбреците на мишки (n=6)

 

Група	Контрол	Модел	Cdps-l	CDPS-M	CDPS-H	Дапа
Бъбрено/телесно тегло %	0.98±0.04	1.69±0.17##	1.42±0.12	1.37±0.10*	1.28±0.10**	1.18±0.10**

 

Таблица 3 Ефекти на CDP върху телесната маса на мишки (N=6)

 

Група	Време/седмица
	0	1	2	3	4
Контрол	28.57±0.82	28.75±0.97	28.70±0.79	29.10±1.24	29.32±1.35
Модел	24.53±1.25##	24.92±1.20##	24.35±1.39##	24.82±1.22##	24.73±1.56##
Cdps-l	25.75±0.69	24.77±0.91	24.83±0.99	25.10±0.83	25.42±0.97
CDPS-M	25.10±0.56	25.00±0.54	24.68±0.48	25.13±0.62	25.25±0.58
CDPS-H	25.38±0.28	25.43±0.49	25.52±0.62	25.73±0.50	26.08±0.34*
Дапа	25.13±1.02	25.52±0.98	25.97±1.00*	26.25±0.63*	26.63±0.78*

 

 

2.2 Ефект на CDP върху бъбречната функция на C57BL/6J мишки

Както е показано в таблица 4, в сравнение с контролната група, концентрациите на BUN, CRE и UA в серума и концентрацията на 24 h UTP в урината на мишките в моделната група са значително повишени (P<0.01); compared with the Model group, CDPs-M and CDPs-H can significantly reduce the concentrations of BUN, Cre, and UA in serum and the 24-hour UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01). CDPs-L can significantly reduce the concentrations of BUN and UA in mouse serum. and 24 h UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01).

 

Таблица 4 Ефекти на CDP върху BUN, CRE, UA и 24 h UTP при DN мишки (N=6)

Група	Концентрация на BUN (mmol/L)	CRE концентрация (μmol/L)	Концентрация на 24H UTP (mg/ml)	Концентрация на UA (μmmol/L)
Контрол	47.51±7.32	12.80±1.36	1.32±0.12	103.9±18.59
Модел	157.97±30.57##	44.85±4.36##	2.38±0.37##	500.43±81.06##
Cdps-l	112.70±16.76*	40.72±3.62	1.37±0.12**	264.07±14.85**
CDPS-M	82.31±14.68**	35.37±6.21*	1.06±0.17**	247.62±11.22**
CDPS-H	64.58±8.64**	30.00±2.87**	0.65±0.17**	222.71±37.52**
Дапа	76.98±10.47**	28.82±3.72**	0.37±0.10**	129.87±17.69**

 

 

2.3 Ефект на CDP върху възпалителните фактори и концентрацията на масата на LPS в серума на C57BL/6J мишки

 

Както е показано в таблица 5, в сравнение с контролната група, серумните нива на TNF-, IL -1, IL -6, TGF- и LPS в мишките в моделната група са значително увеличени (P<0.01); compared with the Model group, Each dose of CDPs can reduce the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, TGF-β and LPS in serum, CDPs-M
Ефектът на CDPS-H групата е значителен (p ＜ 0. 0 5 или p ＜ 0. 01), а ефектът на CDPS-H групата е значителен (p ＜ 0,01).

Таблица 5 Ефекти на CDP върху възпалителни фактори и LPS при мишки (N=6)

 

Група	Масова концентрация (PG/mL)
	Tnf-	Il -1	Il -6	Tgf--	ЛПС
Контрол	111.23±5.47	125.85±11.41	112.27±10.28	152.25±7.28	116.17±15.07
Модел	167.90±16.91##	184.53±21.03##	195.57±31.88##	209.36±16.17##	173.51±15.72##
Cdps-l	144.57±10.15*	160.46±11.84*	169.10±20.32	189.03±8.02*	151.41±9.40*
CDPS-M	133.62±13.24**	154.30±17.39*	150.47±19.28*	171.25±14.35**	135.33±23.92**
CDPS-H	119.30±7.31**	140.54±16.11**	127.12±10.94**	169.47±10.57**	124.98±16.38**
Дапа	114.79±10.48**	135.17±14.37**	120.90±9.32**	159.11±10.92**	113.34±13.14**

 

 

2.4 Ефект на CDP върху бъбречната патология на C57BL/6J мишки

Както е показано на фигура 1, след оцветяването на H&E, беше установено, че гломерулната структура и морфологията на мишките в контролната група са нормални и ясни, мембраната на базата е гладка, гломерулната морфология е редовно, бъбречната интерстициум е нормална, бъбречните тубули са били добре подредени и няма възпалителна клетъчна инфилтрация. В сравнение с контролната група, гломерулният обем на мишките в моделната група е увеличен, базисната мембрана е удебелена, възпалителните клетки се инфилтрират около нея, а бъбречните тубули се нарушават и разширяват; В сравнение с моделната група, групите за администриране на CDP имат различна степен на подобрение на бъбреците на мишката. Гломерулният обем на мишките в групите CDPS-M и CDPS-H е значително намален, дебелината на базата на мембраната е намалена, само малко количество възпалителни клетки са инфилтрирани и бъбречните тубули се възстановяват значително и са плътно подредени. След 4 седмици интервенция на CDP, горните патологични условия бяха възстановени в различна степен.

Оцветяването с Масон показа, че бъбречните тубули на мишките в контролната група са подредени нормално и гломерулите са в нормална форма, не се наблюдава пролиферация на колагенни влакна и се виждат тръбни мембрани на базата; Голямо количество оцветена колаген е наблюдавано в бъбречната интерстициална тъкан на мишките в моделната група и интерстициалната фиброзна тъкан се пролива и ретикуларно се пролиферира; Гломерулният обем на мишките в групата Cdps-M е намален и симптомите на фиброзна тъканна пролиферация са облекчени; Бъбречните тубули на мишките в групата на CDPS-H бяха подредени по-редовно и се наблюдава малко количество пролиферация на колагенни влакна.

Резултатите от оцветяването на PAS показват, че гломерулите на мишките в контролната група са нормални по обем и непокътнати в структурата; Мишките в моделната група са имали увреждане на бъбреците, гломерулният обем е по -голям от нормалния и формата е неправилна, а мезангиалната матрица е отложена; В сравнение с моделната група, увреждането на бъбреците на мишките във всяка група, третирана с лекарства, се облекчава и с увеличаването на дозата, гломерулната форма и размерът са нормални, а степента на отлагане на мезангиална матрица е намалена. Резултатите предполагат, че CDP могат да облекчат увреждането на бъбречната тъкан при DN мишки.

 

Фиг. 1 Ефект на CDP върху бъбречната хистопатологични промени в DN мишки, изследвани от H&E, Masson и PAS оцветяване (× 400)