Cistanche Rb1 намалява свързаното с възрастта съдово увреждане чрез модулиране на Gas6 Pathway

Резултати Rb1 облекчава стареенето в аортите на стареещи мишки

За да идентифицираме антисенесцентния ефект на Rb1, първо изследвахме клетъчното стареене, което се характеризира с експресията на протеини, участващи в инхибирането на клетъчния цикъл и необратимо спиране на растежа (Yang et al. 2019). Тъй като имунохистохимичните резултати са показани на Фигура 1(A,B), в сравнение с тези в групата на Young, мишки от групата Old þ Vehicle показват, че стареенето ускорява регулирането на p21Cip1 и p16INK4a в клетките на гръдната аорта. Лечението с Rb1 обаче облекчава клетъчното стареене в кръвоносните съдове, особено в групата Old þ Rb1-20. В допълнение, резултатите от Western blot бяха в съответствие срезултати от имунохистохимия. Както е показано на Фигура 1(C), протеиновата експресия на p21Cip1 и p16INK4a е значително увеличена с приблизително 2-кратно в гръдните аорти на възрастни мишки в сравнение с млади мишки. След третиране с 20 mg/kg Rb1 нивата на протеини на p21Cip1 и p16INK4a бяха току-що повишени с 41,92 процента и 37,52 процента в сравнение с тези на групата Young, които бяха значително по-ниски от тези на групата Old plus Vehicle. В допълнение, няма значителна разлика в експресията на p21Cip1 или p16INK4a между млади мишки с и без лечение с Rb1.

Фигура 1. Ефект на Rb1 върху стареенето на гръдната аорта. Изображения на имунохистохимичното оцветяване (400 ) на p21Cip1 (A) и p16INK4a (B) в напречни срезове на торакална аорта на мишка. (C) Western blot анализ на експресия на p21Cip1 и p16INK4a на мишка на торакалната аорта. Данните са изразени като средна стойност ± SD. p <0.01 спрямо групата Young; # p < 0,05 спрямо групата Oldþ Vehicle.

Rb1 подобрява съдовата реактивност при възрастни мишки

Експеримент с васкуларен пръстен беше използван за оценка на зависимата от ендотелиума вазодилатация. Както е показано на фигура 2, във всички пръстени на торакалната аорта на мишка, прилагането на Ach води до вазорелаксация. При максимални концентрации (10–5 mol/L), Ach индуцира приблизително 88,84 процента ± 1,20 процента и 58,35 процента ± 2,50 процента вазорелаксация съответно в групата Young и групата Old þ Vehicle, което показва, че стареенето е свързано с увреждане на съдовата реактивност. Въпреки това, третирането с 10 и 20 mg/kg Rb1 доведе до приблизително 70,48 процента ± 2,20 процента и 80,90 процента ± 3,24 процента релаксация, съответно, в стареещите миши торакални аортни пръстени в отговор на 10 5 mol/L Ach.

Щракнете тук, за да получите Cistanche за анти-стареене

Rb1 намалява експресията на клетъчна адхезионна молекула в гръдните аорти на стареещи мишки

Изследвахме протеиновата експресия на определени клетъчни адхезионни молекули, за да определимвъзпалителенипротивовъзпалителни ефектина Rb1 върху възрастни мишки. Резултатите показват, че протеиновата експресия на ICAM-1, VCAM-1 и PAI-1 е значително увеличена с приблизително 2-4 пъти в гръдните аорти на възрастни мишки в сравнение с тези в групата на младите (Фигура 3). За разлика от това, лечението с Rb1 значително инхибира тези промени в торакалните аорти на възрастни мишки, но няма ефект върху групите с млади мишки. Количественият анализ показва, че третирането с 20 mg/kg Rb1 води до приблизително 36,58 процента, 46,66 процента и 49,34 процента понижаване на експресията на протеини ICAM-1, VCAM-1 и PAI-1, съответно, в стареещата тъкан на гръдната аорта, в сравнение с тези на мишки от групата Old plus Vehicle.

Rb1 инхибира свързаната с възрастта съдова калцификация и фиброза

Извършихме HE оцветяване и ализариново червено S оцветяване, за да оценим структурата на аортната тъкан и васкуларната медиална калцификация съответно при стареещи мишки. HE оцветяването показа, че предизвиканите от стареенето удебелени стени на гръдната аорта и дезорганизацията на извънклетъчния матрикс на аортата могат да бъдат облекчени чрез лечение с Rb1 (Фигура 4(A)). Както е показано на Фигура 4 (B), стареещите мишки развиват по-тежка медиална калцификация (червено оцветена зона), отколкото младите мишки, докато Rb1 интервенцията намалява тази патологична промяна. След това изследвахме напречните сечения на гръдната аорта чрез трихромно оцветяване на Masson, за да оценим васкуларната медиална фиброза при стареещи мишки. Резултатите показват, че има забележимо увеличение на отлагането на колаген (оцветена в синьо област) в групата на Old þ Vehicle в сравнение с групата Young (Фигура 4(C)) и този ефект е значително инхибиран от намесата на Rb1. Нещо повече, Western blotting показа, че експресията на колаген I и колаген III значително се повишава с 4.34- и 2.62-кратно при мишки от групата Old þ Vehicle в сравнение с млади мишки; обаче, лечението с Rb1 регулира надолу експресията на колаген I и колаген III при възрастни мишки (Фигура 4(D)). Освен това, лечението с Rb1 не оказва влияние върху степента на калцификация на гръдната аорта и фиброза при млади мишки (Фигура 4 (A-D)).

Rb1 регулира сигналния път на Gas6

Допълнително изследвахме дали Rb1 функционира чрез сигналния път Gas6/Axl за подобряване на свързаното с възрастта увреждане на гръдната аорта при мишки. Понижаването на експресията на протеин Gas6 с 41,72 процента и експресията на mRNA с 52,73 процента при възрастни мишки в сравнение с млади мишки беше отменено чрез лечение с Rb1 (Фигура 5(A,B)). Ние също така определихме протеиновата експресия на Axl чрез Western blotting. Интересното е, че няма значителна разлика в експресията на Axl протеин сред петте експериментални групи (Фигура 5 (A)). Също така не открихме значителна разлика в нивата на mRNA на Axl сред групите (Фигура 5 (B)).

Фигура 2. Лечение с Rb1 намалява свързаното с възрастта ендотелиум-зависимо вазорелаксационно увреждане в съдовите пръстени на гръдната аорта. Фигури, показващи резултатите от анализа. Данните са изразени като средна стойност ± SD. p < 0.05, p < 0.01 срещу групата Young; # p < 0,05, ## p < 0,01 спрямо групата Old þ Vehicle.

Фигура 3. Rb1 намалява експресията на клетъчна адхезионна молекула в стари миши торакални аорти. Western blot анализ на експресията на ICAM-1, VCAM-1 и PAI-1 в тъканите на гръдната аорта. Данните са изразени като средна стойност ± SD. p < 0.01 срещу групата Young; # p < 0.05, ##p < 0,01 спрямо групата Oldþ Vehicle.

Дискусия

В настоящото проучване ние показахме, че Rb1 се подобрявасвързано с възрастта съдово уврежданечрез потискане на калцификацията и фиброзата чрез регулиране на експресията на Gas6, но не и на експресията на Axl, което осигурява потенциална терапевтична стратегия за предотвратяване на свързано с възрастта съдово заболяване. Добре прието е, че стареенето на васкуларните клетки, което се характеризира с ендотелна дисфункция и фенотипния преход на гладкомускулните клетки, може да доведе до повишена съдова скованост и увеличена дебелина на съдовите стени (Liu et al. 2019). Стареенето на съдовите клетки е обща характеристика на различни сложни, свързани с възрастта заболявания, особено сърдечно-съдови заболявания (O'Rourke et al. 2010). С развитието на стареене на васкуларните клетки, съдовата функция е нарушена (Gong et al. 2014). Свързаната с възрастта съдова дисфункция се илюстрира чрез патофизиологични промени, включително прогресивно намаляване на зависимата от ендотелиума вазодилатация (Herrera et al. 2010; Gong et al. 2014). В нашето проучване ние потвърдихме клетъчно стареене в гръдните аорти на възрастни мишки, което беше показано чрез повишена експресия на свързаните с възрастта протеини p21Cip1 и p16INK4a, както и намаляване на зависимата от ендотелиума вазодилатация. Съгласуваността на нашите резултати с гореспоменатите проучвания предполага, че има някои важни молекулярни механизми, свързани с промените в патофизиологията на васкуларните клетки по време на стареенето. Агенти, които действат върху тези механизми, вероятно биха намалили значително и забавили стареенето на васкуларните клетки.

Фигура 4. Лечението с Rb1 подобрява индуцираната от стареенето съдова калцификация и фиброза. (A) Оцветяване с хематоксилин и еозин (HE) (400), (B) Оцветяване с ализарин червено S (400) и (C) трихромно оцветяване на Masson (400 ) на представителни секции на гръдната аорта във всяка група. (D) Western blot анализ на експресии на колаген I и колаген III в тъканите на гръдната аорта. Данните са изразени като средна стойност ± SD. p <0.01 спрямо групата Young; # p < 0,05, ## p < 0,01 спрямо Oldþ Vehicle Group

Фигура 5. Влиянието на Rb1 върху сигналния път Gas6/Axl. (A) Извършено е Western blotting, за да се изследва протеиновата експресия на Gas6 и Axl. (B) qPCR беше извършен за изследване на експресията на mRNA на Gas6 и Axl. Данните са изразени като средна стойност ± SD. p < 0.05, p < 0.01 спрямо групата Young; # p < 0,05 спрямо групата Old þ Vehicle.

Натрупаните доказателства разкриха, че Rb1 се счита за обещаващо лекарство за предотвратяване на съдови увреждания (Zhou et al. 2017, 2019a, 2019b; Zheng et al. 2020). Предишни проучвания разкриха, че Rb1 предотвратява стареенето на васкуларните клетки и инхибира съдовата калцификация (Nanao-Hamai et al. 2019; Zhou et al. 2019b; Zheng et al. 2020). Въпреки това, все още не е сигурно дали Rb1 може да защити артериалните функции срещу стареене и съответния молекулярен механизъм. Тук открихме, че Rb1 намалява и забавя артериалното стареене при стари мишки, както се демонстрира чрез намалена експресия на свързани протеини и подобрена съдова вазодилатация, което показва, че Rb1 може ефективно да блокира прекомерното стареене в стареещите гръдни аорти на мишки и може да се използва като ефективен агент за лечение или предотвратяване на свързано с възрастта артериално увреждане.

Предишни доказателства показват натрупване на хронично нискостепенно артериално възпаление с напредване на възрастта, което допринася за свързаните с възрастта васкуларни структурни и функционални изменения (Wang et al. 2014). Допълнителни проучвания показват, че микросреда, обогатена с възпалителни профили, предизвиква фенотипно изместване на VSMC от контрактилен към синтетичен тип. Тази фенотипна промяна се характеризира с атенюираната експресия на SMC-специфични контрактилни протеини и секрецията на допълнителни провъзпалителни цитокини, хемокини, ECM протеини и молекули на клетъчна адхезия, като колаген, ICAM-1, VCAM-1 и PAI-1 (Wang et al. 2011; Lacolley et al. 2018). Освен това, адхезионните молекули допринасят за индуцираното от възпаление ремоделиране на артериите, особено чрез реорганизиране на взаимодействията ECM-VSMC и повлияване на фенотипната модулация на VSMC (Intengan et al. 1999). Освен това проучванията показват, че Rb1 има противовъзпалителни ефекти in vivo и in vitro (Miao et al. 2017; Zhou et al. 2017). В настоящото проучване открихме, че лечението с Rb1 може значително да намали нивата на експресия на молекули на клетъчна адхезия, свързани с възпалителни процеси при възрастни мишки, което предполага, че Rb1 може да действа като противовъзпалително лекарство и да защитава васкулатурата по време на стареене.

Освен възпалителни увреждания, ремоделирането на артериалната стена, характеризиращо се с калцификация и фиброза, е другата основна патофизиологична промяна в свързаните с възрастта аваскуларни модификации и причинява съдова скованост, която допринася за намаляване на вазодилатацията (McEniery et al. 2005; Iyemere et al. 2006; Kovacic et al. 2011). Мащабни проучвания показват, че коронарната атеросклеротична калцификация се увеличава с възрастта (Tesauro et al. 2017). Други изследвания също демонстрират наличието на повишена калцификация със стареенето в областта на каротидната артерия (Wendorff et al. 2015). По същия начин, нашите резултати показват, че стареещите мишки развиват по-тежка съдова медиална калцификация, отколкото младите мишки. Интервенцията на Rb1 значително инхибира тези промени. Този резултат предполага, че прилагането на Rb1 облекчава степента на свързаната с възрастта съдова калцификация in vivo. Достатъчно доказателства показват, че съдовата калцификация включва различни патобиологични процеси, а не просто отлагане на калций, сред които превключването на VSMC в подобни на остеобласти клетки играе критична роля (Zhou et al. 2019b). Едно ограничение на нашето проучване е, че въпреки разкриването, че интервенцията на Rb1 значително инхибира съдовата калцификация в стареещите мишки в гръдните аорти, контрактилни VSMC маркери (като A-гладкомускулен актин и калпонин) и остеогенни VSMC маркери (като свързан с runt-свързан транскрипционен фактор 2) ) изискват допълнително проучване.

Нещо повече, в настоящото проучване ние също наблюдавахме намалени нива на интерстициален колаген и намалена експресия на свързан протеин при третирани с Rb1- възрастни мишки в сравнение с третирани с носител възрастни мишки, което предполага, че Rb1 може да има благоприятен ефект върху съдовата функция при стареене на гръдни аорти чрез облекчаване на индуцирана от възрастта съдова фиброза. Харви и др. (2016) съобщават, че артериалното втвърдяване, причинено от прекомерна фиброза и повишено отлагане на колаген, може да доведе до повишен вазомоторен тонус и променена тъканна перфузия. Счита се, че агентите, които намаляват фиброзата, предпазват от свързани с възрастта съдови заболявания (Kim et al. 2018).

Може да се заключи, чесвързано с възрастта съдово уврежданее сложен процес, който включва различни необичайни промени, включително възпаление, калцификация и фиброза. По-важното е, че открихме, че Rb1 е в състояние да инхибира тези известни анормални промени в гръдните аорти на възрастни мишки. Основният механизъм обаче все още не е известен. Gas6 беше идентифициран като lig и за TAM рецепторното семейство, особено Axl тирозин киназните рецептори (Rothlin et al. 2015). Предишно проучване демонстрира ролята на Gas6/Axl в регулирането на множество клетъчни функции (Chen et al. 2019). Неотдавнашно проучване предполага, че Gas6/Axl играе решаваща роля в съдовата калцификация (Son et al. 2010; Kaesler et al. 2016; Nanao-Hamai et al. 2019) и може също да участва в индуцираното от лечението понижено регулиране на синтеза на колаген в VSMC и старееща сърдечна тъкан (Chen et al. 2016; 2019). Освен това, предишни проучвания разкриват, че Rb1 активира транскрипция на Gas6 в специфичното ARE място в промоторната област (Son et al. 2010; Nanao-Hamai et al. 2019). Тук демонстрирахме, че експресията на протеин Gas6 е понижена при стареещи мишки, но е обърната чрез лечение с Rb1, което показва, че Gas6 може да участва в медиираната от Rb{21}} регулация на артериалното увреждане при възрастни мишки. Нашите резултати обаче показват, че няма промяна в експресията на Axl протеин и иРНК, което не е в съответствие с предишно проучване (Chen et al. 2019). Фамилията TAM рецептори включва Tyro3, ​​Axl и MerTK. Въпреки че Gas6 показва най-силен афинитет към Axl сред тримата членове (Rothlin et al. 2015), Sun et al. (2019) установяват, че активирането на Gas6 отслабва възпалителното увреждане и апоптозата при мишки, но не са настъпили промени в активирането на Axl сред експерименталните групи. Други изследвания предполагат, че експресията на Axl, която инхибира апоптозата и по този начин съдовата калцификация, също е непроменена при Gas6–/– мишки (Kaesler et al. 2016). Нашите резултати ясно показват, че Rb1 специфично отслабва свързаната с възрастта понижаваща регулация на Gas6, но няма влияние върху експресията на Axl, за което се съобщава, че е основното събитие, отговорно за съдова калцификация и фиброза, за подобряване на свързаното с възрастта съдово възпаление и ендотелиум-зависима вазодилатация . Стабилната експресия на Axl може да е резултат от достатъчно количество преди активирането на Gas6 или да показва, че Gas6 функционира чрез други рецептори. Необходимо е по-нататъшно разследване, изследващо ефектите на Rb1 върху други TAM, които също могат да бъдат активирани от Gas6, като Tyro3 и MerTK.

Изводи

В настоящото проучване ние потвърдихме, че Rb1 инхибира съдова калцификация и фиброза и намалява експресията на клетъчни адхезионни молекули, всички от които впоследствие подобряват свързаната с възрастта съдова ендотелиум-зависима вазодилатация поне отчасти чрез регулиране на експресията на Gas6, но не и на експресията на Axl. При неконтролируемото стареене намирането на средства, които могат да предотвратят или лекуват свързаното с възрастта увреждане на съдовите клетки, е от голямо значение. Нашето проучване предоставя доказателства, потвърждаващи ефектите на Rb1 върху съдово увреждане с мелиооценка при стареещи мишки.

Декларация за разкриване

Авторът(ите) не съобщава за потенциални конфликти на интереси.

Финансиране Тази работа беше подкрепена от грантове от Националната природонаучна фондация на Китай [81370447], Проекта за планиране на науката и технологиите на провинция Гуангдонг в Китай [2016A050502014], Фонда за изграждане на ключова медицинска дисциплина в Шенжен [SZXK002] и Медицински научни изследвания Основаване на китайската провинция Гуандун [A2019079].

Декларация за наличност на данни

Данните и материалите се предоставят при поискване от съответния автор.

Авторски принос

SYK, DHL и XXQ допринесоха за концепцията и дизайна на тази работа. LW, GYS и MW допринесоха за анализите на данните. SYK, LW и JMZ са написали ръкописа. Всички автори прочетоха и одобриха окончателния вариант.

Препратки

Acosta JC, O'Loghlen A, Banito A, Guijarro MV, Augert A, Raguz S, Fumagalli M, Da Costa M, Brown C, Popov N, et al. 2008. Сигнализацията на хемокин чрез CXCR2 рецептора подсилва стареенето. клетка. 133 (6): 1006–1018.

Brandes RP, Fleming I, Busse R. 2005. Ендотелно стареене. Cardiovasc Res. 66 (2): 286–294.

Chen FF, Song FQ, Chen YQ, Wang ZH, Li YH, Liu MH, Li Y, Song M, Zhang W, Zhao J и др. 2019. Екзогенният тестостерон облекчава сърдечната фиброза и апоптозата чрез пътя Gas6/Axl при стареещи мишки. Exp Gerontol. 119: 128-137.

Chen YQ, Zhao J, Jin CW, Li YH, Tang MX, Wang ZH, Zhang W, Zhang Y, Li L, Zhong M. 2016. Тестостеронът забавя стареенето на клетките на гладката мускулатура на съдовете и инхибира синтеза на колаген чрез сигналния път Gas6/Axl . Възраст. 38(3):60.

Fridell YW, Villa J, Attar EC, Liu ET. 1998. GAS6 индуцира Axl-медииран хемотаксис на съдови гладкомускулни клетки. J Biol Chem. 273 (12): 7123–7126.

Gong X, Ma Y, Ruan Y, Fu G, Wu S. 2014. Дългосрочният аторвастатин подобрява свързаната с възрастта ендотелна дисфункция чрез облекчаване на оксидативния стрес и нормализиране на дисбаланса на eNOS/iNOS в аортата на плъхове. Exp Gerontol. 52:9–17.

Харви А, Монтезано АС, Лопес РА, Риос Ф, Туиз РМ. 2016. Съдова фиброза при стареене и хипертония: молекулярни механизми и клинични последици. Може ли J Cardiol. 32 (5): 659–668.

Herrera MD, Mingorance C, Rodriguez-Rodriguez R, Alvarez de Sotomayor M. 2010. Ендотелна дисфункция и стареене: актуализация. Стареене Res Rev. 9(2):142–152.

Hsu JJ, Lu J, Umar S, Lee JT, Kulkarni RP, Ding Y, Chang CC, Hsiai TK, Hokugo A, Gkouveris I, Tetradis S и др. 2018. Ефекти на терипаратид върху морфологията на аортна калцификация при възрастни хиперлипидемични мишки. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 314 (6): H1203–H1213.

Hurtado B, Abasolo N, Munoz X, Garcia N, Benavente Y, Rubio F, Garcia de Frutos P, Krupinski J, Sala N. 2010. Изследване на асоциацията между полиморфимите в GAS6-TAM гените и каротидната атеросклероза. Thromb Haemost. 104 (3): 592–598.

Интенган HD, Thibault G, Li JS, Schiffrin EL. 1999. Механика на съпротивителната артерия, структура и извънклетъчни компоненти при спонтанно хипертензивни плъхове: ефекти на антагонизъм на ангиотензин рецептор и инхибиране на конвертиращия ензим. Тираж. 100 (22): 2267–2275.

Iyemere VP, Proudfoot D, Weissberg PL, Shanahan CM. 2006. Фенотипна пластичност на васкуларните гладкомускулни клетки и регулирането на съдовата калцификация. J Intern Med. 260 (3): 192–210.

Kaesler N, Immendorf S, Ouyang C, Herfs M, Drummen N, Carmeliet P, Vermeer C, Floege J, Kruger T, Schlieper G. 2016. Gas6 протеин: неговата роля в сърдечно-съдовата калцификация. BMC Nephrol. 17(1):52. Ким Е.Н., Ким М.Й., Лим Дж.Х., Ким И., Шин С.Дж., Парк CW, Ким Й.С., Чанг Й.С., Юн ХЕ, Чой Б.С. 2018. Защитният ефект на ресвератрол върху съдовото стареене чрез модулиране на системата ренин-ангиотензин. атеросклероза. 270: 123–131. Коршунов VA, Mohan AM, Georger MA, Berk BC. 2006. Axl, рецепторна тирозин киназа, медиира индуцираното от потока съдово ремоделиране. Circ Res. 98 (11): 1446–1452.