Генно клониране, функционална идентификация, структурен и експресионен анализ на захароза синтаза от Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Експресионен анализ на CtSus в различни части на Cistanche tubulosa и в система от клетъчни култури при стрес от суша

4.1 Експресионен анализ на CtSus в различни части на Cistanche tubulosa

In vitro експерименти с трансформация на цели клетки и експерименти с ензимна каталитична реакция потвърдиха, че протеинът, кодиран от гена CtSus, има способността да катализира синтеза на UDP-глюкоза. За да се проучи допълнително връзката между този ген и биосинтезата на гликозидни съединения в Cistanche tubulosa, нивото на експресия на този ген в различни части наCistanche tubulosaбеше анализиран.

ПРОДАВАМ ВИСОКОКАЧЕСТВЕНИ СУРОВИНИ ЗА СИСТАНЧЕ

Поддържаща услуга на Wecistanche - Свържете се с нас, за да получите информация за отстъпка:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/телефон:+86 15292862950

ехинакозиде най-представителното гликозидно съединение в Cistanche tubulosa и съдържанието му може да достигне повече от 30% от сухото тегло на растенията Cistanche tubulosa [23]. Изследователската група преди това е измерила съдържанието на ехинакозид в различни части на растенията Cistanche tubulosa и специфичното представяне е: съдържанието наechinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>въздушна част; сред тях съдържанието на ехинакозид в хаусториум е най-високо. Количествената PCR флуоресценция в реално време беше извършена с използване на cDNA от различни части на Cistanche tubulosa като шаблони и резултатите бяха анализирани от 2–ΔΔCT метод и беше извършен диференциален анализ. Резултатите са показани на Фигура 4А. Нивото на експресия на гена CtSus в хаусториума е най-високо, 1,5 пъти по-високо от това в надземната част, а нивото на експресия в подземната част е значително по-високо от това в надземната част, което е в съответствие с модела на натрупване на фенилетанол гликозиди представена от ехинакозид в различни части наCistanche tubulosa.

Фигура 4 Относителни нива на експресия на CtSus в различни части на C. tubulosa и в суспензионни клетки, третирани с PEG6000. A: Относително ниво на експресия на CtSus в различни части на C. tubulosa; B: Относително ниво на експресия на CtSus в суспензионни клетки на C. tubulosa, третирани с PEG6000 в различни времеви точки n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

ВИСОКОКАЧЕСТВЕНИ СУРОВИНИ ЗА CISTANCHE

4.2 Експресионен анализ на CtSus в суспензионни клетки на Cistanche deserticola при условия на стрес от суша

Това показаха предварителните проучвания по проектастрес от суша, предизвикан от PEG6000можезначително се увеличаватнанатрупване на фенилетанол гликозидив суспензионни клетки Cistanche. От 3 до 9 дни след индукцията съдържанието на ехинацеазид се повишава значително. От 12 до 15 ден,темп на растеж на ехинацеазидсъдържанието се забави и достигна максималната си стойност на 15-ия ден. След това, когато времето за култивиране се увеличи, съдържанието на ехинацеазид се увеличи значително. Съдържанието на фруктозид постепенно намалява [24]. Въз основа на това изследване тази статия използва cDNA на нетретирани суспензионни клетки на Cistanche deserticola и PEG6000-индуцирани суспензионни клетки на Cistanche deserticola като шаблони за провеждане на флуоресцентно количествено PCR откриване в реално време за изследване на CtSus гена в суспензия на Cistanche deserticola клетки в условия на стрес от суша. промени в нивата на експресия. Резултатите са показани на Фигура 4В. В суспензионни клетки на Cistanche deserticola, индуцирани от PEG6000, експресията на CtSus се повишава значително на 6-ия ден след индукцията и достига най-високата стойност на 9-ия ден, след което пада обратно до същото ниво като контролата. групи от едно и също ниво. Горните резултати показват, че стресът от суша може значително да повиши експресията на CtSus ген в суспензионната клетъчна линия на Cistanche deserticola, което е в съответствие с модела на натрупване на ехинацеазид при стрес от суша. Въпреки това, пиковата експресия на CtSus гена се появява по-рано от пика на съдържанието на ехинацеазид, тъй като активният гликозил донор, синтезиран чрез CtSus катализа, е важен прекурсор, необходим за реакцията на многоетапно гликозилиране в последващия биосинтетичен път на ехинацеазид. , следователно се спекулира, че след като бъдат подложени на стрес от суша, организмите ще мобилизират за предпочитане гени, свързани с първичния метаболизъм, за да постигнат натрупване на активни донори и след това да постигнат натрупване на важни вторични метаболити.

ВИСОКОКАЧЕСТВЕНИ СУРОВИНИ ЗА CISTANCHE

5 Изследване на триизмерна структура на протеин CtSus и анализ на ключови активни места

Въз основа на функцията на CtSus при катализиране на производството на UDP-глюкоза от гликозил донор, структурната основа на каталитичната активност на CtSus беше допълнително проучена. Онлайн инструментът SOPMA беше използван за прогнозиране на вторичната структура на протеина. Резултатите показват, че вторичната структура на CtSus съдържа 55,28% -спирали, 25,47% произволни намотки, 12,80% удължени нишки и 6,46% -навивки (Фигура 5А), което показва, че -спиралите са най-важните вторични структурни единици в CtSus протеина, последвано от произволни намотки, които също представляват голяма част от протеина. Удължените нишки и навивки са разпределени в целия протеин. Съгласно съществуващи изследвания захароза синтазата обикновено съществува под формата на тетрамер, който се счита за нейната активна форма. Следователно, тази статия допълнително използва AlphaFold2 за предсказване на структурата на протеина CtSus и получи неговата триизмерна структура на протеинови тетрамери. Сравнението на PDB (Protein Data Bank) база данни установи, че сходството на последователността между Arabidopsis thaliana захароза синтаза AtSus1 (PDBID 3S28) и CtSus може да достигне 77,93%. Предсказаната структура на CtSus беше сравнена с триизмерната структура на AtSus1 и стойността на средното квадратно отклонение (RMSD) след суперпозиция на протеин беше 1.11 Å, което показва, че пространствените структури на двете са силно последователни (Фигура 5B).

Докладваната структура на кристален комплекс протеин-лиганд на Arabidopsis AtSus1 с UDP и фруктоза (PDBID3S29) беше използвана като шаблон [16] за анализиране на режима на свързване на CtSus с UDP и фруктоза. Резултатите от молекулярния докинг са показани на фигура 5C. Може да се наблюдава, че джобовете за свързване на субстрата на AtSus1 и CtSus са много сходни по отношение на тип аминокиселина, пространствено разпределение и конфигурация и припокриването е високо, което доказва, че последователността на захароза синтазата е силно запазена в растенията. Конформациите на двата лиганда, UDP и фруктоза, в джоба за свързване на протеиновия субстрат са показани на Фигура 5D. Най-благоприятната конформация за молекулярно докинг на UDP и CtSus има добро припокриване с конформацията на UDP в кристалния комплекс AtSus1-UDP, което доказва точността на резултатите от молекулярното докинг. Взаимодействието между UDP и ключовите аминокиселинни остатъци в джоба за свързване на протеиновия субстрат е показано на Фигура 5E. UDP и CtSus са свързани главно чрез водородни връзки и хидрофобни взаимодействия. Ключовите аминокиселинни остатъци в джоба за свързване на субстрата включват: eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 и Glu681.

Референции

[1] Песен ZH, Lei L, Tu PF. Напредък в изследването на фармакологичната активност в растенията на CistancheHoffing. et Link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ и др. Chemome сравнение между култивирана и дива Cistanchetubulosa с помощта на ¹H-NMR спектроскопия [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y и др. Cistanches Herba, от застрашен вид до голяма марка китайска медицина [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.

[4] Liu Y, Wang H, Yang M, et al. Полизахаридите на Cistanche deserticola предпазват PC12 клетките от OGD/RP-индуцирано увреждане [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X и ​​др. Еволюция на ензимите за взаимно преобразуване на растителни нуклеотиди и захар [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Образуване на растителна нуклеотидна захар, взаимно преобразуване и спасяване чрез рециклиране на захар [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Биохимично характеризиране на UDP-GlcNAc/Glc4-епимераза от Escherichia coli O86:B7 [J]. Биохимия, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et al. Идентифициране на UDP-N-ацетилглюкозамин4-епимераза, участваща в гликозилирането на екзоспориум протеин в Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Идентификация на гени на захароза синтаза в транскриптом в Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10] Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, et al. Захароза синтаза: уникална гликозилтрансфераза за развитие на процеса на биокаталитично гликозилиране [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.

[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. Биосинтезата на захароза [J]. J Biol Chem, 1955, 214: 149-155.[12]Stein O, Granot