Cistanche Tubulosa защитава допаминергичните неврони чрез регулиране на апоптозата и невротрофичния фактор, получен от глиалните клетки: in vivo и in vitro-Ⅰ

ВЪВЕДЕНИЕ

Болестта на Паркинсон (PD) е често срещано невродегенеративно заболяване, възникващо при възрастни хора с патологични прояви на загуба на допаминергични неврони в substantia nigra (SN) поради дегенерация. Тежестта на заболяването е свързана със загубата на невронни клетки на допамин (DA) в SN, което е в съответствие с мнението, че невродегенеративниятпроцесът прогресира в продължение на много години, преди да се появят някакви симптоми (Соул и Майерс, 1993 г). Прогресивният характер на заболяването предлага интересни възможности за терапевтична интервенция чрез блокиране на подлежащия невродегенеративен процес. Следователно търсенето на индуцирани от терапия мощни и специфични действия на невротрофични фактори върху оцеляването на DA неврон е от значителен интерес.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ЗАЩИТА НА ДОПАМИНЕРГИЧНИТЕ НЕВРОНИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Невротрофичните фактори са основни протеини, включително нервен растежен фактор (NGF), невротрофичен фактор, получен от мозъка (BDNF) и невротрофичен фактор, получен от глиални клетки (GDNF), които насърчават растежа на нервите, неврологичното развитие, аксоналното насочване и невронната функция. Сред всички невротрофични фактори, които защитават и насърчават възстановяването на допаминергичните неврони, GDNF има най-силните ефекти (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Доказано е, че GDNF притежава мощни невротрофични ефекти върху DA неврони in vitro (Lin et al., 1993) и упражнява неврозащитни ефекти in vivo. Доказано е, че GDNF спасява нигрални DA неврони от индуцирана от лезия клетъчна смърт след индуцирана от хирургия или токсин аксотомия при плъхове (Beck et al., 1995; Kearns and Gash, 1995; Sauer et al., 1995) и частично също след системно приложение наN-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрахидропиридин (MPTP)при мишки (Tomac et al., 1995). Повишената честота на невронална апоптоза и намалените защитни ефекти на невротрофичните фактори, потенциално предизвикани от различни патологични фактори, са в основата на дегенерацията на допаминергичните неврони (Holden et al., 2006).

C. tubulosa е билково лекарство, произхождащо от няколко растения от рода Cistanche. Това е основна терапевтична възможност за синдром на бъбречна недостатъчност, който е тясно свързан с андрогенните хормони в традиционната китайска медицина (ТКМ). Към днешна дата много клинични и фундаментални изследвания върху C. tubulosa показват активността на невродегенеративните заболявания. Идентифицирането на рецепти за тонизиране на бъбреците от TCM при лечението на PD може по този начин да осигури алтернативно клинично лечение на PD.Ехинакозид (ECH)е основен биоактивен компонент, открит в лечебната билка C. tubulosa. Проучванията показват терапевтичните ефекти на гликозидите на Cistanche и ECH,вербаскозид(VER) и икариин (ICA) при пациенти с болестта на Алцхаймер (AD), PD и други пациенти със съдова деменция (Urano and Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu и др. (2014) предполагат, че екстрактите от C. tubulosa, които съдържат достатъчно ECH и актеозид, подобряват когнитивната дисфункция, причинена от A -42 чрез блокиране на отлагането на амилоид и обръщане на холинергичната и хипокампалната допаминергична невронна функция. Тао и др. (2015) откри товафенилетаноидни гликозидиот C. tubulosa (Ph Gs-Ct) предотвратява мозъчен оток на голяма надморска височина чрез намаляване на експресията на протеин и иРНК на AQP4 в мозъчната тъкан на модели на плъхове.

НАТУРАЛЕН ЕКСТРАКТ ОТ CISTANCHE TUBULOSA СНАКС ПОДОБРЯВА ПАМЕТТА PHGS75% ECH 30% ДЕЙСТВИЕ 12%

Предишни проучвания показват, че китайските билкови съединения, включително трите съставки на C. tubulosa, epimedium и rhizoma polygonati, облекчават увреждането на допаминергичните неврони и повишават нивата на допамин чрез регулиране на експресията на невротрофични фактори (Wu et al., 2013). По този начин, все още не е известно дали индуцираните от C. tubulosa невропротективни ефекти са дълготрайни и до каква степен спасяването на нигрални DA неврони чрез прилагане на GDNF може да позволи значително запазване на двигателното поведение, което е от значение за симптоматологията на PD животни. Това проучване използва рецепта за тонизиране на бъбреците на TCM, C. tubulosa нанопрах, който е получил национален патент (номер на патент: 2011103028541) в Китай и преди това е показал определен терапевтичен ефект при PD. Следователно настоящото проучване е предназначено да изследва невропротективните и регенеративните ефекти на лечението с C. tubulosa и да изследва апоптозата на клетките MES23.5 и поведенчески дефинитивни плъхове и регулирането на GDNF, измерено чрез набор от целеви тестове .

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Материали, реактиви и оборудване

C. tubulosa е закупен от Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Пекин, Китай. ECH, VER и ICA идват от Националните институти за контрол на храните и лекарствата, Китай. Допаминергичната невронна клетъчна линия MES23.5 беше подарък от професор Биао Чен, Лаборатория по невробиология, Столичен медицински университет, Пекин, Китай. Петдесет мъжки мишки C57BL/6 (с тегло 20–25 g всяка) бяха закупени от Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (номер на лиценза: SCXK2012-0002), Шанхай, Китай.

MPP+, MTT и глутамин са закупени от Sigma-Aldrich (Карлсбад, Калифорния, САЩ); DMEM/F12 среда и фетален говежди серум са закупени от Gibco Co. (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ); и стандарт MPTP, DA и стандарт на хомованилова киселина (HVA) бяха закупени от Sigma-Aldrich (Карлсбад, Калифорния, САЩ). -актин, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF семейство рецептор алфа (GFR 1) и Ret антитела бяха закупени от Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA); Комплект реагент за оцветяване на 3,3'-диаминобензидин (DAB) е закупен от Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, Китай); и комплект за подготовка на SDS-PAGE гел проби, комплект за ултрачувствителна усилена хемилуминесценция (ECL) и анализ на бицинхонинова киселина (BCA) бяха закупени от Beyotime Institute of Biotechnology (Пекин, Китай).

Това проучване използва следните инструменти: ELX800 четец на микроплаки (Bio Tek Winooski, VT, САЩ); CO2 инкубатор (Heraeus, Hanau, Германия); Gel DOC 2000 система за анализ на изображения с гел, клетка за електрофореза и резервоар за електрофореза (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, САЩ); DU-650 протеинов анализатор (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Калифорния, САЩ); 5417R високоскоростна хладилна центрофуга (Eppendorf, Хамбург, Германия); Двойна планетарна топкова мелница SXQM (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, Китай); Смесителна мелница MM400 (Retsch GmbH, Haan, Германия); Agilent 1200 високоефективна течна хроматография (HPLC; Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ); PowerPac Basic електрофореза, PowerPac Basic система за трансмембранен трансфер, Universal Hood II хемилуминесцентна камера, S1000 Thermal Cycler RNA система за обратна транскрипция (Bio-Rad); Motic Med 6.0 система за анализ на изображения на тъкани и клетки (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, Китай).

Изготвяне наC. tubulosaНанопрах

C. tubulosa се претегля, след това се пречиства и дехидратира. След конвенционално пулверизиране финият прах от C. tubulosa се прекарва през 200-мрежесто сито и се изсушава чрез замразяване. Вакуум с контролирана температура и високоенергийна топкова мелница бяха използвани за приготвяне на нанопраха C. tubulosa. Първо, суров нанопрах от C. tubulosa беше поставен във вакуумен резервоар за топкова мелница, който беше зареден с карбидни смилащи топки. Съотношението между смилащите топки и нанопраха C. tubulosa варира от 15:1 до 5:1. За да се получи фин прах, скоростта и продължителността на високоенергийната топкова мелница бяха настроени съответно на 300 rpm и 20 min. Финият прах се претегля за обработката на наномащабни материали и се обработва в смесителна мелница с честота 25/s и трептене 20s за три повторения. PBS се използва за разтваряне и приготвяне на изходен разтвор от 25 mg/mL, последвано от 30 минути обработка с ултразвук, автоклавиране и накрая съхранение при -20 °C.

Контрол на качеството на активните компоненти наC. tubulosaчрез HPLC

ECH и VER съдържат градиентно елуиране със свързан с октадецилсилан силициев диоксид като пълнител, метанол като подвижна фаза А и 0.1% разтвор на мравчена киселина като подвижна фаза В. Дължината на вълната на откриване е 330 nm. ICA съдържа градиентно елуиране с октадецилсилан-свързан силициев диоксид като пълнител и ацетонитрил-вода (30:70) като подвижна фаза. Дължината на вълната на детекция е 270 nm. Пробата, контролата и отрицателната контрола бяха измерени като 10 µL всяка за теста.

Клетъчна култура и МТТ анализ за измерване на жизнеспособността на MPP+- Третирани клетки

Клетките MES23.5 бяха инокулирани с 5% фетален телешки серум, 1% глутамин, 2% 50× разтвор на Sato и DMEM/F12 среда с 2% пеницилин/стрептомицин. Те бяха инкубирани при 37 ° C в 5% CO2 инкубатор с наситена влажност. Клетките бяха изолирани и пасирани с 0.25% трипсин и клетъчната суспензия беше събрана във фазата на логаритмичен растеж. Изолирани клетки с плътност 1 × 105 се посяват в покрити с полилизин 96-ямкови плаки, последвано от добавяне на различни крайни концентрации (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 и 800 µmol/L ) на MPP+ медия. MES23.5 клетки, които се инкубират с нормална културална среда за 24 часа и 48 часа, се използват като отрицателни контроли в in vitro експериментите. Клетките от различните третирани групи се инкубират с МТТ реагент в продължение на 4 часа. След това разтворът в ямките се изхвърля и се добавят 150 uL DMSO и се осцилира в продължение на 10 минути. Абсорбцията на всяка проба при дължина на вълната 570 nm се измерва с помощта на автоматичен четец на микроплаки. Процентът на клетъчна жизнеспособност (%)=средна абсорбция на експерименталната група/средна абсорбция на отрицателната контролна група × 100%.

Бяха добавени съответните концентрации на MPP+ среда за 24--часово третиране в MES23.5 клетки, като се използва същият подход, както при in vitro културата. След третирането разтворът в ямката се изхвърля. Среда, съдържаща различни концентрации (10, 50, 100, 200, 250, 500 и 1000 µg/mL) от C. tubulosa нанопрах, се добавя към клетките MES23.5 в различни ямки и се оставя да се инкубира за 24 часа и 48 часа. Клетките MES23.5, които се инкубират с нормална културална среда за 24 часа и 48 часа, се използват като отрицателни контроли. Клетките MES23.5, които бяха инкубирани с MPP+ среда, бяха използвани като носител. Измерванията бяха извършени в три екземпляра за всяка проба. Измерва се абсорбцията на съответните третирани и контролни групи, за да се изчисли клетъчната жизнеспособност.

НАТУРАЛЕН ЕКСТРАКТ ОТ CISTANCHE TUBULOSA ПРОТИВ УМОРА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

TH експресия, измерена чрез имуноцитохимия

Когато нанопрахът от C. tubulosa беше в 100, 200 и 250 µg/ml, степента на оцеляване на клетките се увеличи значително (Фигура 2G). Така в следващите експерименти тествахме трите концентрации: групи с ниска доза, средна доза и групи с висока доза. Бяха тествани три репликации за всяка от групите C. tubulosa. Стерилизирани, покрити с полилизин покривни стъкла се поставят в 6-плаки с ямки. След това 5 × 104 клетки се посяват във всяка ямка и се инкубират в продължение на 24 часа. Конвенционалната прясна среда беше заменена в нормалната контролна група и крайна концентрация от 100 µmol/L MPP+ среда беше заменена в останалите третирани групи за инкубиране в продължение на 24 часа. След това конвенционалните пресни среди бяха заменени в групите с нормална контрола и носител и крайни концентрации от 100, 200 и 250 µg/mL C. tubulosa нанопрах бяха инкубирани с клетките в продължение на 24 часа в ниска, умерена и висока доза C. tubulosa групи за лечение, съответно. Клетките MES23.5 в различните групи се промиват три пъти в PBS за отстраняване на супернатантата и допълнително се фиксират в 4% параформалдехид за 15 минути. След промиване с PBS, клетките се инкубират с пероксидазен блокер при 37 ° С за 30 минути и след това се промиват отново с PBS. 0,2% разтвор на Triton X-100 се използва за клетъчна пермеабилизация в продължение на 10 минути, последвано от промиване с PBS. Към всяка проба се добавя нормален кози серум и се инкубира при стайна температура за 30 минути. След това нормалният кози серум се отстранява и първичното антитяло, разредено 1:400 в PBS, се добавя към всяка проба и се инкубира при 4°C за една нощ. Клетките в отрицателната контролна група се инкубират с PBS при 4 ° C за една нощ. След промиване с PBS, клетките се инкубират с маркирани с биотин вторични антитела във влажна камера при 37 ° С за 20 минути. След това всяка проба се промива в PBS и се маркира с конюгати на пероксидаза-стрептавидин от хрян (работен разтвор С) при 37 ° С в продължение на 20 минути. След промиване с PBS, клетките се оцветяват с DAB реагент на тъмно за приблизително 1-10 минути и развитието на кафяв цвят се наблюдава под светлинна микроскопия. След това всяка проба се промива два пъти в дестилирана вода за 1–2 минути и ядрата се оцветяват с хематоксилинов разтвор за 0, 5–1 минути. След щателно изплакване на всяка проба с вода, клетките бяха потопени в 1% алкохол на солна киселина за диференциация и 1% воден разтвор на амоняк, последвано от щателно измиване на клетките във вода. След това клетките от всяка проба се дехидратират в 70% етанол в продължение на 2 минути, 80% етанол в продължение на 2 минути, 90% етанол в продължение на 2 минути два пъти, 95% етанол в продължение на 2 минути два пъти и 100% етанол в продължение на 2 минути два пъти. След това клетките се потапят в разтвор на ксилен за 2 минути два пъти и се монтират върху предметно стъкло с неутрални смоли. Под светлинна микроскопия, всяка проба е подложена на заснемане на изображение и произволен избор на 5-10 ефективни зрителни полета, за да се определи експресията на избрани протеини в допаминергичните неврони, обозначени от интензитета на кафявите частици, и да се определи полу-количествено съдържанието на протеин чрез неговата средна сива стойност .

Скорост на апоптоза на MES23.5 клетки, измерена чрез поточна цитометрия

Прилепналите клетки се промиват веднъж с PBS. За изолиране на клетки се добавя подходящо количество разтвор на трипсин без EDTA при стайна температура и разтворът се пипетира внимателно, за да се позволи на прилепналите клетки да се отделят. След това се добавя среда за клетъчна култура, за да се спре трипсинизацията. Сместа се прехвърля в нова центрофужна епруветка и след това се центрофугира в продължение на 5 минути при 1500 rpm за събиране на изолираните клетки. След изхвърляне на супернатантата, клетъчната пелета внимателно се ресуспендира с използване на PBS и клетките се преброяват. Приблизително 1 × 105 до 5 × 105 ресуспендирани клетки се центрофугират за 5 минути при 1500 rpm и супернатантата се изхвърля. Пет микролитра от разтвора за свързване на Анексин V-FITC бяха добавени към клетъчната пелета за внимателно ресуспендиране на клетките. Други 5 µL от Annexin V-FITC се добавят и се смесват старателно. Пет микролитра разтвор на пропидиев йодид бяха използвани за клетъчно оцветяване чрез инкубиране при стайна температура за 10 минути малко преди поточната цитометрия.

Уестърн блот анализ заинвитро

Клетките бяха разделени на нормална група, MPP+ група за лечение, ниска дозаC. tubulosaгрупа за лечение, група за лечение с умерена доза C. tubulosa и група за лечение с висока доза C. tubulosa. Експресията на Bcl2 и Bax беше измерена във всеки. Общо 1 × 105 клетки на ямка в 6-плаката с ямки бяха използвани за моделиране и лечение във всяка група преди събирането на клетките. Смесен лизат, съдържащ RIPA буфер, протеазен инхибитор и фосфатазен инхибитор, се добавя за лизиране на клетките за 30 минути върху лед. След центрофугиране, супернатантата се използва за протеинов анализ. Общият протеин се определя количествено с помощта на BCA анализ и се разделя с 10% SDS-PAGE. Отделените протеини се прехвърлят върху мембрана и се инкубират с 5% буфер за блокиране на обезмаслено мляко при стайна температура в продължение на 2 часа. След това мембраната се инкубира в първично антитяло (Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, разреждане 1:200) при 4°C за една нощ. След етап на промиване, мембраната се инкубира във вторично антитяло (0, 5 mg/ml, разреждане 1: 5000) при 4 ° С за 1 час и след това в ECL проявител за 2 минути за конвенционално развитие. Софтуерът Quantity One беше използван за полуколичествен анализ на протеиновата експресия.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ЗАЩИТА НА ЧЕРНИЯ ДРОБ ПРОТИВ УМОРА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Експериментално моделиране на животни и прилагане на лекарства

Петдесет 8-седмични мъжки мишки без специфични патогени бяха разделени на случаен принцип в пет групи: нормална група, група за лечение с МРТР (носител), група за лечение с ниска доза C. tubulosa, лечение с умерена доза C. tubulosa група и група за лечение с висока доза C. tubulosa. Животните бяха настанени при 20–22 °C със свободен достъп до храна и вода. Мишките в нормалната група са инжектирани интраперитонеално с равен обем нормален физиологичен разтвор в продължение на седем последователни дни. Мишките в другите групи на лечение бяха интраперитонеално инжектирани с MPTP (30 mg/kg/d) в продължение на седем последователни дни за установяване на носители.

По време на PD моделиране, на мишките в групите за лечение с ниска доза, средна доза и висока доза C. tubulosa бяха приложени интрагастрално еквивалентни клинични обеми от 4 g/kg/d, 8 g/kg/d и 16 g/ кг/денC. tubulosa нанопрах, съответно за 14 последователни дни. На мишките в контролната група и групата с носител бяха приложени интрагастрално еквивалентни обеми нормален физиологичен разтвор за 14 последователни дни. Всички експериментални процедури бяха одобрени от Комитета по етика на университета Фуджиан към TCM и бяха извършени в съответствие с международно приетите принципи за използване и грижа за лабораторни животни. Бяха положени всички усилия, за да се сведе до минимум страданието на животните в това проучване.