Екстрактът от Cistanche Deserticola увеличава костното образуване в остеобластите--Част I
Mar 15, 2022
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Те-Мао Лиaet a
Резюме
Цели Изследвахме ефекта наЦистанчеdeserticolaмамо (CD) включенкостенобразуванеот култивирани остеобласти. Методи Тестът за образуване на минерализирани нодули беше използван за изследване на in vitro ефектите на CD(Цистанчеdeserticola)Накостенобразуване. Експресията на алкална фосфатаза (ALP), костни морфогенетични протеини (BMP) -2 и остеопонтин (OPN) иРНК бяха анализирани чрез количествена полимеразна верижна реакция в реално време. Механизмът на действие на CD(Цистанчеdeserticola)екстрактът е изследван с помощта на Western blotting. In vivo антиостеопоротичният ефект на CD(Цистанчеdeserticola)екстракт се оценява при овариектомирани мишки.
Ключови констатации
CD(Цистанчеdeserticola)екстрактът няма ефект върху пролиферацията, миграцията или зарастването на рани на култивирани остеобласти, но повишава ALP, BMP-2 и OPN иРНК и минерализацията на костите. Митоген-активирана протеин киназа (MAPK) или инхибитори на ядрен фактор (NF)-kB намаляват CD(Цистанчеdeserticola)предизвикани от екстрактиобразуване на костии ALP, BMP-2 и OPN израз. Въпреки това, CD(Цистанчеdeserticola)екстрактът не повлиява остеокластогенезата. В допълнение, CD(Цистанчеdeserticola)екстракт предотвратява загубата на кост, предизвикана от овариектомия in vivo.
Изводи
CD(Цистанчеdeserticola)може да е романобразуване на костисредство за лечение на остеопороза.
Ключови думиобразуване на кости; Цистанчеdeserticola; китайска билка; остеобласти
Cistanche deserticolaе добър заобразуване на кости
Въведение
Костта е сложна тъкан, съставена от няколко вида клетки, които преминават през непрекъснат процес на обновяване и възстановяване, наречен „костно ремоделиране“. Два основни типа клетки, отговорни за костното ремоделиране, са остеокластите, които резорбират костта, и остеобластите, които образуват нова кост. Костното ремоделиране се регулира от няколко системни хормона (напр. паратироиден хормон, 1, 25-дихидрокси витамин D3, полови хормони и калцитонин) и локални фактори (напр. азотен оксид, простагландини, растежни фактори и цитокини).[1] Остеопорозата възниква, когато резорбцията и образуването на кост са некоординирани и излишното костно разграждане превишава костното изграждане.[2] Текущите лечения за остеопороза включват бифосфонати, калцитонин и естроген, които са инхибитори на костната резорбция, които поддържат костната маса чрез инхибиране на активността на остеокластите [3]. Въпреки това, ефектът от тези лекарства за увеличаване или възстановяване на костна маса е сравнително малък, със сигурност не повече от 2 процента на година.[3] Следователно има нужда от средства за изграждане на кости, като терипаратид, които стимулират новикостенобразуванеи коригиране на промяната в трабекуларната микроархитектура, която е характерна за установена остеопороза [4,5] Тъй като новикостенобразуванее основно функция на остеобластите, агенти, които действат чрез увеличаване на пролиферацията на клетки от остеобластната линия или чрез индуциране на диференциация на остеобластите, могат да подобрят образуването на кост [5,6].
Въпреки че механизмите на остеопорозата остават неясни, те вероятно са свързани с намалената наличност или ефектите на костните растежни фактори, като костни морфогенетични протеини (BMP).[7] BMPs, които са структурно свързани със суперсемейството на трансформиращия растежен фактор-b, първоначално са идентифицирани чрез техния капацитет да индуцират ектопиченкостен образуванепри гризачи.[8] BMP играят важна роля вкостенобразуванеи диференциация на костни клетки чрез стимулиране на активността на алкалната фосфатаза (ALP), както и синтеза на протеогликан, колаген и остеопонтин (OPN).[9] Скорошно проучване установи връзка между остеопорозата и специфични полиморфизми в гените BMP-2, ALP и OPN, което предполага, че те са свързани с развитието на остеопороза.[10]
Цистанчеdeserticolaмамо (Orobanchaceae; съкратено като CD)(Цистанчеdeserticola)е местна билка в Китай и се използва широко в традиционната медицина като терапевтичен агент поради своите седативни, аналгетични и имуностимулиращи свойства.[11] Съвременните фармакологични изследвания показват, че CD(Цистанчеdeserticola)екстрактите могат да стимулират имунитета, [12] да пречистват свободните радикали [13] и да увеличат активността на супероксид дисмутазата [14]. Противовъзпалителните и антиоксидантните агенти имат потенциал за лечение на остеопороза чрез увеличаванекостен образуванеи/или потискане на костната резорбция [15,16] Въпреки това, ефектът на CD(Цистанчеdeserticola)върху функцията на костните клетки все още не е установено. Тук докладваме този компактдиск(Цистанчеdeserticola)екстрактът не повлиява пролиферацията, миграцията или активността за заздравяване на рани на култивирани остеобласти, но повишава експресията на ALP, BMP-2 и OPN и минерализацията на костите. В допълнение, ние показваме, че митоген-активираната протеин киназа (MAPK) и ядрен фактор (NF)-kB сигнални пътища могат да бъдат включени в CD-медиираното повишаване на генната експресия и костната минерализация. За разлика от тях, CD(Цистанчеdeserticola)екстрактът не потиска остеокластогенезата in vitro. По-специално, лечението на мишки с CD(Цистанчеdeserticola)екстракт предотвратява загуба на костна тъкан, предизвикана от овариектомия in vivo. Следователно нашите данни предполагат, че CD(Цистанчеdeserticola)може да се използва за стимулиранекостенобразуванеза лечение на остеопороза.
Cistanche deserticolaзасили имунитета
Материали и методи
Екстракт и материали от Cistanche deserticola
CD(Цистанчеdeserticola)екстрактът е закупен от Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Тайван). Извличане и изолиране на CD(Цистанчеdeserticola)са следвани, както е описано по-горе (въз основа на спектрални данни те са идентифицирали химичния състав, включително бета-ситостерол, даукостерол, янтарна киселина, триаконтанол, актеозид, бетаин и полизахарид).[17] Заешки поликлонални антитела, специфични за p-екстрацелуларни сигнал-регулирани кинази (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-терминални кинази (JNK), JNK, p-p65 и p65 бяха закупени от Santa Cruz Biotechnology ( Санта Круз, САЩ). Остеокалцин ELISA комплектът е закупен от Biosource Technology (Nivelles, Белгия). С-терминалните телопептиди от комплекта ELISA за колаген тип-I са получени от Cross Laps (Herlev, Дания). Доминантно-негативният p38 мутант е предоставен от д-р J. Han (South-Western Medical Center, Далас, САЩ). JNK доминантно-отрицателният мутант е предоставен от д-р М. Карин (Калифорнийски университет, Сан Диего, САЩ). ERK2 доминантно-отрицателният мутант е предоставен от д-р М. Коб (Югозападен медицински център). Всички други реагенти са получени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, САЩ).
Клетъчна култура
Мишата остеобластна клетъчна линия MC3T3-E1 е закупена от American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Клетките бяха култивирани в 95 процента въздух, 5 процента CO2 с a-MEM, който беше допълнен с 20 mm HEPES и 10 процента инактивиран от топлина фетален телешки серум, 2 mm глутамин, пеницилин (100 U/ml) и стрептомицин (100 mg /ml).
Измерване на образуването на минерализирани нодули
Образуването на минерализирани нодули беше оценено, както е описано.[18] Накратко, остеобластите се култивират в среда, съдържаща витамин С (50 mg/ml) и b-глицерофосфат (10 mm) в продължение на две седмици и средата се сменя на всеки три дни. След инкубиране с CD(Цистанчеdeserticola)екстракт за 12 дни, клетките се промиват два пъти с 20 mm Tris-буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 0,15 m NaCl (рН 7,4), фиксират се в ледено студен 75 процента (v/v) етанол за 30 минути и въздушно- изсушени. Отлагането на калций се определя с помощта на оцветяване с ализарин червено-S. Накратко, фиксирани с етанол клетки и матрица се оцветяват в продължение на 1 час с 40 mm ализарин червено-S (рН 4.2) и се изплакват обилно с вода. Свързаното оцветяване се елуира с 10 процента (w/v) цетилпиридиниев хлорид и ализарин червено-S в пробите се определя количествено чрез измерване на абсорбцията при 550 nm и се сравнява със стандартна крива. Един мол ализарин червено-S селективно свързва приблизително два мола калций.
Cistanche deserticolaе добър заобразуване на кости
Количествена полимеразна верижна реакция в реално време
Общата РНК се екстрахира от остеобласти с помощта на комплект TRIzol (MDBio Inc., Тайпе, Тайван). Обратната транскрипция се извършва с помощта на 2 mg тотална РНК и олиго(dT) праймер [19,20] Количествената полимеразна верижна реакция в реално време (qPCR) се провежда с помощта на TaqMan® едноетапен PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, САЩ). Беше добавена обща сДНК (100 ng на 25-ml реакция) със специфични за последователността праймери и сонди Taqman®. Всички целеви генни праймери и проби бяха закупени в търговската мрежа, включително b-актин като вътрешен контрол (Applied Biosystems). qPCR анализите бяха проведени в три екземпляра на система за откриване на последователност StepOnePlus (Applied Biosystems). Условията на цикъла бяха 10-минутно активиране на полимераза при 95 градуса, последвано от 40 цикъла от 95 градуса за 15 s и 60 градуса за 60 s. Прагът беше зададен над нешаблонния контролен фон и в рамките на линейната фаза на амплификацията на целевия ген, за да се изчисли броят на цикъла, при който е открит транскриптът (обозначен CT).
Western blot анализ
Клетъчните лизати се приготвят, както е описано по-горе [21, 22] Протеините се разделят чрез SDS-PAGE и се прехвърлят в мембрани от поливинил дифлуорид Immobilon (Millipore, Billerica, САЩ). Петната се блокират с 4 процента говежди серумен албумин за 1 час при стайна температура и след това се изследват със заешки анти-човешки антитела срещу p-65 или p-p65 (1: 1000) за 1 час при стайна температура. След три промивания блотовете се инкубират с пероксидаза-конюгирано магарешко анти-заешко вторично антитяло (1: 1000) за 1 час при стайна температура. Петната се визуализират чрез подобрена хемилуминесценция, използвайки X-OMAT LS филм (Eastman Kodak, Rochester, USA).
Остеопороза, предизвикана от овариектомия
За това изследване са използвани женски ICR мишки на възраст четири седмици, 22~28 g. Мишките бяха овариектомирани двустранно под анестезия с трихлороацеталдехид (100 mg/kg), а контролните мишки бяха фиктивно оперирани (Sham) за сравнение. Костната минерална плътност и костното минерално съдържание се измерват след перорално приложение на различни концентрации на CD(Цистанчеdeserticola)екстракт на всеки два дни в продължение на четири седмици. Общата минерална плътност на костите на тялото и съдържанието на костни минерали се определят чрез рентгенов абсорбциометър с двойна енергия (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, САЩ), като се използва режим за малки субекти, както е описано по-горе [18, 23] Всички протоколи са в съответствие с институционалните указания и са одобрени от Комитета за грижа за животните на Китайския медицински университет.
Статистически анализ
Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуер Prism 4.01. (GraphPad Software Inc., Сан Диего, САЩ). Дадените стойности са средни SEM. Статистическият анализ между две проби беше извършен с помощта на t-теста на Student. Статистическите сравнения на повече от две групи бяха извършени с помощта на еднопосочен анализ на дисперсията с posthoc теста на Bonferroni. Във всички случаи P <0,05 се="" счита="" за="">
Cistanche deserticolaе добър заобразуване на кости
Резултати
Цистанче deserticolaекстракт повишава минерализацията на костите от остеобласти Добавяне на CD(Цистанчеdeserticola)екстракт за 24 или 48 часа не повлиява пролиферацията на миши остеобластни MC3T3-E1 клетки в МТТ анализ (данните не са показани). Тъй като диференциацията на остеобластите е сложен процес, включващ клетъчна пролиферация и миграция, ние също тествахме миграционната способност на MC3T3-E1 клетки след третиране с CD(Цистанчеdeserticola)екстракт. Използвайки Transwell и анализи за заздравяване на рани, открихме този компактдиск(Цистанчеdeserticola)екстрактът не повлиява миграцията на остеобласти (данните не са показани). Образуването на минерализирани възли е един от маркерите за съзряване на остеобластите. Оцветяването с ализарин червено S показва, че минерализирани възли се образуват, когато остеобластите се култивират в продължение на две седмици в среда, съдържаща витамин С (50 ug/ml) и -глицерофосфат (10 mm), зависимият от концентрацията начин чрез добавяне на CD(Цистанчеdeserticola)(Фигура 1а). Следователно CD(Цистанчеdeserticola)индуцирано от екстракт образуване на костни възли от култивирани остеобласти, но не и тяхната пролиферация или миграция. Разгледахме и ролята на CD(Цистанчеdeserticola)екстракт при RANKL-индуцирана остеокластогенеза, но не откри ефект (данните не са показани).
Екстрактът от Cistanche deserticola повишава алкалната фосфатаза, костния морфогенетичен протеин-2 и експресията на остеопонтин в култивирани остеобласти
Диференцираните остеобласти проявяват повишена активност на ALP, което корелира с високи нива на ензимна експресия.[18] Открихме това лечение с CD(Цистанчеdeserticola)екстракт за 72 часа значително повишава активността на остеобластната ALP (Фигура 1b). Като се има предвид решаващата роля на BMP-2, ALP и OPN в диференциацията на остеобластите, тествахме дали CD(Цистанчеdeserticola)екстракт упражнява своя ефект върху диференциацията на остеобластите чрез регулиране на експресията на BMP-2, ALP и OPN. Третиране на клетки с CD(Цистанчеdeserticola)извлича повишена иРНК експресия на ALP, BMP-2 и OPN по начин, зависим от концентрацията (Фигура 1в), демонстрирайки, че CD(Цистанчеdeserticola)екстрахира индуцираната диференциация на остеобластите чрез регулиране на експресията на ALP, BMP-2 и OPN.
Екстрактът от Cistanche deserticola увеличава образуването на костни възли чрез митоген-активиран протеин киназен път
Съобщава се, че MAPK играе важна роля вкостенобразуване[24,25], така че след това проучихме дали този сигнален път е включен в CD(Цистанчеdeserticola)индуцирана от екстракт костна минерализация. Предварително третиране на клетки с ERK инхибитор U0126, p38 инхибитор SB203580 или JNK инхибитор SP600125 намалява CD(Цистанчеdeserticola)повишена чрез екстракт костна минерализация (Фигури 2а, 3а и 4а). Освен това, инхибиторите също блокират CD(Цистанчеdeserticola)индуцирана от екстракт ALP, BMP-2 и OPN експресия (Фигури 2b–4c). Трансфекция на клетки с ERK2, p38 или JNK мутантно намален CD(Цистанчеdeserticola)екстракт-повишаване на ALP, BMP-2 и OPN mRNA експресия (Фигури 2c, 3c и 4c). След това директно изследвахме ERK, p38 и JNK активирането след CD(Цистанчеdeserticola)лечение с екстракт. Инкубация на клетки с CD(Цистанчеdeserticola)индуцирано от екстракт ERK, p38 и JNK фосфорилиране (Фигури 2d, 3d и 4d). Следователно ERK, p38 и JNK медиират повишенотокостенобразуванепредизвикани от CD(Цистанчеdeserticola)лечение на остеобласти.
Екстрактът от Cistanche deserticola увеличава образуването на костни възли чрез пътя на ядрения фактор-kB
Както бе споменато по-рано, активирането на NF-kB е необходимо закостенобразуване[26,27] След това третирахме остеобласти с инхибиторите на NF-kB пиролидин дитиокарбамат (PDTC) и N-tosyl-L-фенилаланин хлорометил кетон (TPCK) бяха закупени от Calbiochem (Дармщат, Германия), за да определим дали активирането на NF-kB е участва в CD(Цистанчеdeserticola)индуцирана от екстракт костна минерализация. Фигура 5а показва, че предварителното третиране на остеобласти с PDTC или TPCK инхибира CD(Цистанчеdeserticola)индуцирано от екстракта образуване на костни възли и също така намалява увеличаването на експресията на ALP, BMP-2 и OPN (Фигура 5b и 5c). Фосфорилирането на NF-kB p65 субединицата е индикатор за активиране на NF-kB; [28] в съответствие с това открихме, че CD(Цистанчеdeserticola)екстракт повишава фосфорилирането на p65 в остеобластите (Фигура 5d). Тези резултати показват, че активирането на NF-kB е важно за експресията на ALP, BMP-2 и OPN и образуването на костни нодули, предизвикана от екстракт от CD.
Фигура 4 Участие на c-Jun N-терминални кинази (JNK) вЦистанчеdeserticola(CD) индуцирана от екстракт костна минерализация в остеобластите. (a) Клетките се поставят в 24-плаки с ямки и се култивират в среда, съдържаща витамин С (50 mg/ml) и b-глицерофосфат (10 mM) в продължение на две седмици. Клетките бяха едновременно третирани с CD(Цистанчеdeserticola)екстракт (26 mg/ml) плюс SP600125 (3 mM). Образуването на минерализирани нодули се оценява чрез оцветяване с ализарин червено-S (n=5). (b, c) Клетките бяха предварително третирани със SP600125 за 30 минути или трансфектирани с JNK мутант или 24 часа, последвано от стимулиране с CD екстракт и активност на алкална фосфатаза (ALP) и ALP, костен морфогенетичен протеин (BMP) -2 и експресията на мРНК на остеопонтин (OPN) беше измерена чрез ALP комплект и количествена полимеразна верижна реакция в реално време. ( d ) Клетките бяха третирани с CD екстракт за посочените интервали от време и експресията на p-JNK беше изследвана чрез Western blotting. *П< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Цистанчеdeserticola)третирана с екстракт група.
Инхибиране на костната загуба от екстракт от Cistanche deserticola при овариектомирани мишки
За изследване на ефекта от CD(Цистанчеdeserticola)екстракт при загуба на костна маса, остеопорозата е индуцирана при женски мишки чрез овариектомия. Както се очакваше, овариектомираните мишки показаха намалена обща телесна костна минерална плътност и костно минерално съдържание (Фигура 6а и 6b). Лечение с CD(Цистанчеdeserticola)екстракт в продължение на четири седмици инхибира загубата на костна минерална плътност и костно минерално съдържание по дозозависим начин (Фигура 6а и 6b). Кръвните концентрации на ALP могат да отразяват остеобластната активност.[29] Както е показано на фигура 6c, CD(Цистанчеdeserticola)екстракт инхибира намаляването на активността на серумната ALP, предизвикано от овариектомия. В допълнение, CD(Цистанчеdeserticola)екстракт също повишава нивото на остеокалцин, маркер накостенобразуванеи намалява нивото на С-терминалните телопептиди на колаген тип-I, маркер за костна резорбция (Фигура 6d и 6e). По този начин тези открития подкрепят силата и ефикасността на CD(Цистанчеdeserticola)екстракт за предотвратяване на загуба на костна маса in vivo.
Фигура 6 Инхибиране на индуцираното от овариектомия намаляване на костната минерална плътност и костно минерално съдържание чрезЦистанчеdeserticola(CD) екстракт. Женски ICR мишки бяха подложени на фиктивна операция или бяха овариектомирани. Овариектомирани мишки бяха третирани с посочените концентрации на CD(Цистанчеdeserticola)екстракт чрез орално хранене. Общата телесна минерална плътност на костите (a), минералното съдържание на костите (b), активността на серумната алкална фосфатаза (ALP) (c), серумният остеокалцин (d) и серумните С-терминални телопептиди на колаген тип I (e) бяха определени четири седмици след операцията. Данните са представени като средна SE, n=8–10 мишки/група. *P < 0.05,="" в="" сравнение="" с="" фалшиво;="" #p=""><0,05, в="" сравнение="" с="" групата="" с="">
ДИСКУСИЯ
Щракнете тук за информация относно част II (Дискусия и заключение) на тази статия.
От: 'Цистанчеdeserticolaекстрактът се увеличавакостенобразуванев остеобластите' отТе-Мао Лиaи др
---© 2012 Авторите. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Вестник по фармация и фармакология, 64, стр. 897–907
