Цистанозид от Cistanche Herba облекчава причинените от хипоксия репродуктивни увреждания при мъжете чрез потискане на оксидативния стрес-Ⅱ

Ефекти на Cis върху индуцираната от хипоксия GC{1}} клетъчна жизнеспособност in vitro.

За да се изследва дали Cis може да предотврати инхибиторните ефекти на хипоксията върху жизнеспособността на GC{{0}} клетките, беше извършен анализ на CCK-8. GC-1 клетки бяха третирани с различни подтипове (Cis-A, B, C, H) и диапазони на концентрация (0.02 μM, 0.2 μM, 2 μM) Cis за 72 часа. Сравнение на моделната група с групата на DMSO показа, че DMSO не насърчава директно жизнеспособността на GC{{10}} клетки (Фигура 2А). Жизнеспособността на клетките обаче беше значително възстановена (P < 0.05) с лечение с Cis. В сравнение с моделната група, всички Cis-A, Cis-B, Cis-C и Cis-H показват определени защитни ефекти върху предизвиканото от хипоксия увреждане на GC{19}} клетъчната жизнеспособност, а Cis-B показва най-значимото ефект (Фигура 2А). Защитните ефекти на Cis при 0.2 μM са значително по-високи от защитните ефекти на Cis при 0.02 μM, докато разликата между 2 μM и 0.2 μM не е очевидна, което показва, че възстановената GC-1 клетъчната жизнеспособност, индуцирана от Cis, демонстрира зависимо от дозата увеличение в диапазона на концентрация от 0.02-0.2 μM (Фигура 2A). Следователно, според експерименталните нужди, 0,2 μM Cis беше избран като оптимална концентрация в следващите in vitro експерименти. За по-нататъшно потвърждаване дали зародишните клетки наистина са били защитени от Cis, беше извършено FCM и Ki-67 оцветяване, за да се оцени промяната в пролиферацията на GC-1 клетки след третиране с Cis. При лечение с Cis делът на GC-1 клетките във фазата G1 беше намален. За разлика от това, повече клетки навлязоха в S фазата, което предполага, че Cis-третирането може да увеличи индекса на пролиферация на зародишни клетки (P <0.01; Фигура 2B). Статистиката за клетъчния цикъл на GC-1 е показана на фигура 2Bb. Резултатите от оцветяването с Ki-67 също показват, че лечението с Cis-A, Cis-B, Cis-C и Cis-H значително подобрява Ki-67-положителното клетъчно съотношение на GC, индуцирана от хипоксия{{54} } клетки in vitro (Фигура 2C).

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Механизмът на Cis предпазва зародишните клетки от хипоксия in vitro.

За да се изследва дали защитните ефекти на Cis върху GC-1 клетките са свързани с отстраняването на прекомерната ROS, флуоресцентното багрило DCFH-DA беше използвано за откриване на нивата на ROS във всяка група. Както е показано на фигури 3A и 3B, лечението с DMSO не променя вътреклетъчното съдържание на ROS или нивото на LPO в сравнение с моделната група. Въпреки това, нивата на ROS в GC-1 клетките бяха значително намалени в групите, третирани с Cis (Фигура 3А). Освен това, намаление на LPO също се наблюдава в GC-1 клетки, подложени на Cis (Фигура 3B).

За по-нататъшно изследване на механизма, чрез който Cis защитава зародишните клетки от хипоксично увреждане, бяха извършени TUNEL оцветяване и Western blot анализи за оценка на апоптозата. TUNEL оцветяването (Фигура 3C) показва значителна апоптоза в модела и DMSO групите. Въпреки това, по-малко апоптотични клетки са наблюдавани при лечение с Cis, което показва, че лечението с Cis намалява GC-1 клетъчната апоптоза. Освен това, експресията на PARP, Caspase-3, Bax и Bcl-2 беше измерена, за да се потвърди молекулярният механизъм. Както е представено на фигура 3D, каспаза-3 и PARP се активират в GC-1 клетки при хипоксия и това активиране се инхибира от лечението с Cis. Освен това съотношението на Bax/Bcl-2 е по-високо в моделната група, отколкото в контролната група, а лечението с Cis намалява съотношението на Bax/Bcl-2 (Фигура 3D). Тези данни показват, че Cis има потенциален капацитет да отслаби предизвиканото от хипоксия оксидантно увреждане и този защитен ефект може да бъде постигнат чрез намаляване на натрупването на ROS и инхибиране на активирането на апоптозния път на Caspaserelated.

Ензимният механизъм, инхибиращ OS, включва ловчи на свободни радикали като глутатион редуктаза (GR), глутатион пероксидаза (GPx) и супероксид дисмутаза (SOD) [23]. Ензимният механизъм, инхибиращ OS, играе съществена роля в предотвратяването на окислително увреждане в клетките и тъканите [23]. За по-нататъшно валидиране на потенциалния механизъм на Cis инхибиране на индуцираната от хипоксия OS в GC-1 клетки, бяха измерени активностите на GR, GPx и SOD. Резултатите разкриват, че активността на GR, GPx и SOD значително (P < 0.01, Фигура 3E) намалява при хипоксия в сравнение с контролните групи, а лечението с Cis значително възстановява техните дейности в GC-1 клетки, изложени на хипоксия (P <0,05, Фигура 3E), което предполага, че тези съединения могат да активират мощната ендогенна антиоксидантна система.

CISTANCHE TUBULOSA ЗА СТИМУЛИРАНЕ НА ПРОИЗВОДСТВОТО НА СПЕРМА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ефекти на Cis върху репродукцията при плъхове, предизвикани от хипобарна хипоксия.

За да определим ефектите на хипобарната хипоксия върху мъжки плъхове, първо тествахме морфологични изменения на тестисите при плъхове, предизвикани от хипобарна хипоксия. Резултатите от оцветяването с HE показват, че в контролната група нормалните сперматогенни клетки на различни етапи са подредени по подреден начин от базалната мембрана до лумена и зрелите сперматозоиди са видими в лумените на тубулите (Фигура 4А). В сравнение с контролите, в моделната група са наблюдавани патологични промени в тестикуларната тъкан, основната мембрана на тестикуларните епителни клетки е подредена свободно, сперматогенният епител е изключително тънък и нивото и броят на зародишните клетки са значително намалени (Фигура 4А) . Въпреки това, лечението с Cis забележително подобрява хистологията на индуцираното от хипобарна хипоксия увреждане на тестисите in vivo (Фигура 4А). Ние също така измерихме телесното тегло, теглото на тестисите, теглото на епидидима и теглото на семенните везикули на жлезите, което доведе до изчисляването на индекса на репродуктивния орган (съотношението репродуктивен орган/телесно тегло). Както е показано на Фигура 4B-D, индексът на репродуктивните органи (тестиси, епидидимис и жлеза на семенните везикули) е значително по-нисък в моделната група (P < 0.01), отколкото в контролната група. Въпреки това, ефектът от хипобарната хипоксия върху индекса на репродуктивните органи на плъхове беше обърнат с лечението с Cis (Фигура 4B-D).

След това, активността на акрозомния ензим и скоростта на живи сперматозоиди на сперматозоидите на мъжки плъх също бяха измерени, за да се изясни увреждането на функцията на тестисите. Както е показано на Фигура 4E, 4F, активността на акрозомния ензим и подвижността на спермата са по-ниски в моделната група плъхове, отколкото в контролната група (P < 0.01). Въпреки това, в сравнение с плъхове в моделната група, активността на акрозомния ензим се възстановява при плъхове, третирани с 8 mg/kg/d Cis (P <0,05) (Фигура 4D). Освен това, както е показано на Фигура 4F, лечението с Cis същоповишава нивото на живите сперматозоиди; всички плъхове, третирани с 8 mg/kg/ден Cis, показват значително повишен процент живи сперматозоиди (55,83 ± 6.03%, P < 0.05; 69.{ {8}} ± 2,29%, P < 0,01; P < 0,05; 53,67 ± 2,25%, P < 0,05 съответно) в сравнение с моделните плъхове (43,83 ± 4,01%) .

Взети заедно, тези резултати предполагат, че хипобарната хипоксична среда води до морфологични изменения на тестисите, загуба на тегло на репродуктивните органи и увреждане на функцията на тестисите при мъжки плъхове, а Cis може ефективно да защити репродуктивните органи от увреждане, предизвикано от хипоксия.

Ефекти на Cis върху OS в тестисите на плъхове, предизвикани от хипобарна хипоксия.

Нивата на ROS и LPO в тестисите на плъхове бяха измерени, за да се анализират ефектите на Cis върху OS, предизвикана от хипобарна хипоксия. Анализът на ROS разкрива, че в сравнение с контролната група нивата на ROS в тестисите в моделната група са значително повишени (P < 0.01 Фигура 5A). Обратно, LPO е драстично повишен в тестисите (P < 0.01) при хипобарна хипоксия в сравнение с нормоксични условия (Фигура 5B). Въпреки това, лечението с Cis промени горните промени (P <0.05), при които Cis-B упражнява по-добри ефекти от други Cis (Фигура 5A, 5B). Cis изглежда предпазва тестисите чрез намаляване на OS при хипобарични хипоксични условия in vivo.

Освен това бяха извършени анализи на апоптоза за допълнителна оценка на механизма, чрез който Cis защитава срещу индуцирано от хипобарна хипоксия увреждане на функцията на тестисите. Резултатите от оцветяването с TUNEL (Фигура 5C) показват, че съществува значителна апоптоза в моделната група в сравнение с контролната група. Въпреки това, след лечение с Cis (8 mg/kg/ден), се наблюдават по-малко апоптотични клетки (P < 0.05) (Фигура 5C). Данните от Western blot също показват, че хипоксията и хипобарното лечение водят до активиране на Caspase-3 и PARP и повишено съотношение Bax/Bcl-2 в тъканта на тестисите, което показва увеличаване на апоптозата (Фигура 5D). Освен това различни видовеCis лечениезначително намалена апоптоза в тъканта на тестисите (Фигура 5D). По същия начин, IHC анализът на тестикуларната тъкан показа подобни резултати (допълнителна фигура 1).

За да проверим механизма на Cis-редуцираната OS, предизвикана от хипобарна хипоксия, тествахме допълнително активността на GR, GPx и SOD в тъканта на тестисите. Както е показано на Фигура 5E, в сравнение с контролната група, лечението с хипобарна хипоксия значително намалява активността на GR, GPx и SOD (P < 0.01). Въпреки това, лечението с Cis възстановява ензимните активности (GR, GPx и SOD) на тъканта на тестисите при плъхове, третирани с хипобарна хипоксия (P <0.05). В заключение, Cis изглежда предпазва тестисите чрез активиране на мощен ендогенен антиоксидантен ензимен защитен механизъм при условия на хипобарна хипоксия.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Дискусия

Известно е, че в райони с висока надморска височина хипобарната хипоксия засяга множество системи при хората, включително мъжката репродуктивна система [4, 20]. Последните експериментални изследвания са насочени към разбирането на механизмите за това как хипобарната хипоксия уврежда мъжката репродуктивна система. В това проучване е изследван терапевтичният ефект на Cis екстракт от Cistanches Herba върху индуцирано от хипоксия репродуктивно увреждане. Резултатите показват, че Cis може да защити мъжката репродуктивна система от хипоксично увреждане чрез намаляване на индуцираното от хипоксия натрупване на ROS и OS чрез повишаване на активността на ендогенни антиоксидантни ензими.

ROS са получени от кислород свободни радикали, които играят жизненоважна роля в човешката физиология и патология. Ниските дози ROS са от съществено значение закапацитет на спермата, акрозомната реакция и сливането на сперматозоиди и яйцеклетки [24, 25]. Въпреки това, прекомерното натрупване на ROS често води до увреждане на зародишните клетки и стромалните клетки, което води до мъжко безплодие [26]. ROS може лесно да увреди клетъчните мембрани, нуклеиновите киселини, протеините, ензимите и други биологични макромолекули чрез пероксидация. Нещо повече, те също водят до потенциални клетъчни и ДНК увреждания, когато превишат капацитета за пренасяне на антиоксиданти. Натрупаните доказателства подкрепят основната роля на ROS в патогенезата на мъжкия фертилитет [27, 28]. Производството на ROS се регулира от напрежението на кислорода. При хипоксични условия наличният кислород в околната среда намалява и вискозитетът на кръвта се увеличава, като по този начин засяга много кислород-зависими метаболитни процеси в организма [29, 30]. Въпреки това, по-ниското атмосферно налягане на голяма надморска височина причинява лошо венозно връщане и намаляване на количеството на кислорода, транспортиран от кръвния поток до всички клетки на организма, което допълнително увеличава хипоксията на органите и клетките [29, 30]. По този начин излагането на голяма надморска височина води до поредица от хипоксични физиологични реакции, включително производството и натрупването на ROS, когато търсенето на кислород надвишава васкуларното снабдяване. Както бе споменато по-рано, натрупването на ROS води до различни вътреклетъчни ефекти, най-критичният от които е да предизвика OS в клетките.

OS се отнася до дисбаланс между реакциите на окисление и редукция, водещ до генериране на излишни окислители или молекули, които приемат електрон от друг реагент, който от своя страна произвежда ROS [31, 32]. Известно е, че ОС може да бъде предизвикана от серия от ендогенни и екзогенни фактори, включително излагане на голяма надморска височина. Сперматозоидите са клетки, които са особено податливи на OS, предвид техните неадекватни системи за възстановяване на клетките и високо съдържание на полиненаситени мастни киселини в плазмената мембрана [33]. Тъканите на тестисите и епидидима не са изключение, тъй като наличието на тежка OS е наблюдавано в кръгли сперматиди при плъхове, подложени на хипоксия [4]. OS засяга стабилността на ДНК, като по този начин застрашава целостта на генетичния материал на гаметата [34-36]. Въпреки това е потвърдено, че високото ниво на увреждане на ДНК в мъжките гамети води до активиране на сигнализирането на апоптоза, което води до намаляване на броя на епидидималните сперматозоиди и увеличаване на процента на дефектните клетки [28, 37]. В настоящото изследване хипоксията значително намалява жизнеспособността на GC-1 клетките чрез индуциране на апоптоза и спиране на клетъчния цикъл. По-важното е, че значително повишени нива на ROS бяха показани чрез FCM анализ след стимулиране на хипоксия, с повишена скорост на апоптоза и по-високо активиране на съотношението Caspase-3, PARP и Bax/Bcl-2, което показва, че ROS може да се активира апоптоза чрез активиране на каспазния сигнален път по време на индуцирано от хипоксия увреждане на фертилитета. Настоящите открития показват, че хипоксията води до прекомерно натрупване на ROS, причинявайки окислително увреждане на репродуктивните клетки. По този начин е важно да се идентифицират нови антиоксиданти, които могат да служат като ефективен подход за облекчаване на увреждане на фертилитета, причинено от хипоксия.

За да се предпази от OS, в тялото съществува сложна антиоксидантна система, съставена главно от ензимни фактори. При физиологични условия съдържанието на ROS и антиоксидантната система поддържат определен баланс. Свръхпроизводството на ROS обаче изчерпва антиоксидантната система на сперматозоидите, което води до OS, което причинява увреждане на ДНК на спермата и води до по-ниска плодовитост и нива на бременност [23]. По този начин, за справяне със свръхпроизводството на ROS и свързаните с него вредни ефекти на клетъчно ниво в мъжката репродуктивна система, са тествани различни антиоксидантни стратегии [23]. Понастоящем литературата относно използването на съединения с антиоксидантна активност иподобряване на функцията на сперматае обширна. Важно е, че повечето доклади описват подобрение в параметрите на спермата след перорален прием на антиоксиданти, включителноподобряване на концентрацията на сперматозоидии подвижност или намаляване на увреждането на ДНК [38]. По този начин нарастващ брой уролози предписват перорални антиоксиданти за безплодие поради проблеми, свързани с OS [39]. Тези антиоксиданти включват главно карнитини, витамини, цинк, мелатонин и естествени съединения [23, 40]. Понастоящем, с развитието на технологията за извличане на лекарства, все по-голям брой екстракти от TCM също се разглеждат за смекчаване на мъжкото безплодие, тъй като тези антиоксиданти могат да намалят разрушителните ефекти на OS [41]. Yüce A. и др. съобщава през 2013 г., че канелата има благоприятен ефект върху окислителния и антиоксидантния баланс в тестисите и качеството на спермата [42]. Zhang L и др. показват, че куркуминът значително подобрява подвижността на сперматозоидите при пациенти и намалява H2O2 [43]. В допълнение, различни други растителни екстракти като боровинка, минзухар, семена от нар и зелен чай също са показали, че защитават репродуктивната система чрез антиоксидантни механизми [27, 44-47]. Cistanches Herba е важен TCM, който притежава благоприятен профил на безопасност и широки медицински функции за лечение на безплодие, наред с други състояния [13]. Съвременните фармакологични проучвания показват, че Cistanches Herba притежава различни дейности, като антиоксидантни, противовъзпалителни, хепатопротективни и анти-невродегенеративни заболявания [13, 48]. Следователно, екстракти, фракции или съединения от Cistanches Herba може да имат потенциални антиоксидантни свойства за лечение на безплодие.

Активните вещества в растенията, които подобряват плодовитостта, включват различни химични групи като PhGs, сапонини, кислородни летливи съединения и алкалоиди [41]. Изследванията на фармакологичната активност на PhG показват, че PhGs проявяват широк спектър от биоактивности, като антиоксидантна, антирадиационна невропротекция и подобряване на сексуалната функция [49, 50]. Сред тези дейности антиоксидацията постепенно привлича вниманието. Съобщава се, че някои отделни компоненти или фракции на PhG инхибират апоптозата на зародишните клетки, предизвикана от различни химикали, и техните антиоксидантни способности in vitro също са демонстрирани in vivo в няколко животински модела [51, 52]. Тези резултати показват, че PhGs може да бъде привлекателен кандидат залечение на мъжко безплодие. Cis е активен PhG, който може да бъде изолиран от Cistanches Herba. В настоящото проучване изследвахме ефектите на Cis върху клетки, третирани с хипоксия, или модел на плъх и изследвахме основните молекулярни механизми. Cis проявява защитна активност при намаляване на индуцираната от хипоксия жизнеспособност и увеличаване на апоптозата в GC-1 клетките и също така показва защитен ефект върху индуцирано от хипоксия увреждане в репродуктивната система на плъхове in vivo. Наблюдава се значително намаляване на активностите на GR, GPx и SOD при хипоксия в сравнение с нормоксичните групи, докато специфичните активности на GR, GPx и SOD значително се увеличават в тестисите или GC-1 клетките, третирани с Cis. Cis изглежда защитава тестисите и GC-1 клетките при хипоксични условия чрез засилване на активността на антиоксидантните ензими.

Ензимните антиоксиданти функционират главно чрез пречистване на супероксидните аниони, като по този начин предотвратяват липидната пероксидация и увреждането на ДНК, за да предотвратят безплодието. Ензимните антиоксидантни механизми играят решаваща роля в предотвратяването на оксидативно увреждане [23]. Ензимният механизъм срещу OS включва ловчи на свободни радикали и зависими от глутатион ензими, включително GR, GPx и SOD [12]. Добре известно е, че антиоксидантните ензими са от съществено значение за мъжката репродуктивна система. В настоящото проучване ефектът от намалената активност на антиоксидантните ензими при хипобарна хипоксия беше придружен от повишени ROS и LPO в моделната група, което е в съответствие с предишни доклади [12]. Въпреки това, приложението на Cis доведе до възстановяване на активността на антиоксидантните ензими в клетките на GC-1 и тестисите на плъхове, което прави възможно генерирането на стратегии за прилагане на Cistanches Herba за предотвратяване на увреждане, предизвикано от хипобарна хипоксия, както беше предложено по-рано. Въпреки че настоящите резултати показват, че лечението с Cis частично намалява увреждането на зародишните клетки, предизвикано от хипоксия при плъхове, са необходими допълнителни изследвания, за да се разкрие пълната картина на неговите репродуктивни защитни ефекти. Например, специфичният механизъм на Cis засяга активността на антиоксидантните ензими. В допълнение, има въпрос дали други механизми също могат да бъдат уместни, тъй като Cis само частично се възстановява от репродуктивните увреждания, причинени от хипоксия. И накрая, трябва да се вземе предвид дали Cis има директен стимулиращ растежа ефект върху зародишните клетки.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДДЪРЖАНЕ НА АКТИВНОСТТА НА СПЕРМАТОЗА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Изводи

Като цяло, резултатите от това проучване подчертават потенциала на Cis като антиоксидант за лечение на индуцирано от хипоксия мъжко репродуктивно увреждане. Cis може да предпази от предизвикано от хипоксия мъжко репродуктивно увреждане чрез възстановяване на активността на антиоксидантния ензим, намаляване на ROS-индуцираната OS, едновременно с това повишаване на клетъчната жизнеспособност и намаляване на апоптозата. Важно е, че подтиповете Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C и Cis-H), изследвани в това проучване, показват известен защитен ефект върху репродуктивната система, а Cis-B показва най-значимия ефект. Следователно, ние спекулираме, че Cis може да бъде добър кандидат-антиоксидант залечение на индуцирано от хипоксия мъжко репродуктивно увреждане, въпреки че точният основен механизъм изисква допълнително изследване.