Клониране, функционална идентификация и експресионен анализ на халкон синтаза от Cistanche Tubulosa Ⅱ
Mar 25, 2024
3 Резултати и анализ
3.1 Клониране на CtCHS ген
Четири последователности, анотирани като "халконова синтаза", бяха отсеяни с помощта на данните за транскриптома на цветята на Cistanches tubulosa. Чрез Blast сравнението на NCBI беше установено, че само една последователност има пълната дължина на CHS гена и има FPKM по-голям от 10. Специфични праймери са проектирани на базата на тази последователност и фрагмент от около 1200 bp е получен чрез PCR амплификация с използване на кДНК на цвете на Cistanches tubulosa като шаблон (Фигура 1). PCR продуктът беше гел възстановен и свързан към pCE2TA/Blunt-Zero вектора. Резултатите от секвенирането са в съответствие с анализа на транскриптома. Генът е наречен CtCHS. Дължината на последователността е 1173 bp и кодира 390 аминокиселини.
Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:
Имейл:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/телефон:+86 15292862950
Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
3.2 Биоинформатичен анализ на CtCHS
3.2.1 CtCHS физични и химични свойства и анализ на трансмембранен домейн
Онлайн софтуерът ProtParam беше използван за анализ на физичните и химичните свойства на протеина, кодиран от гена CtCHS. CtCHS кодира 390 аминокиселини, молекулната формула е C1908H3041N511O562S22, относителната молекулна маса е 42 836.54, теоретичната изоелектрична точка е 5,85 и е нестабилна. Коефициентът II е 43.24, което е нестабилен протеин, а общата средна хидрофилност (GRAVY) е -0.052, което е хидрофилен протеин. Онлайн инструментът Prot Scale беше допълнително използван за анализ на хидрофилността/хидрофобността на протеина. Резултатите от анализа показват, че максималната стойност на хидрофилността/хидрофобността на CtCHS протеин е 2.422 (342), а минималната стойност е -2.489 (119). Аминокиселинната пептидна верига, кодирана от CtCHS гена, има повече хидрофилни аминокиселинни остатъци, отколкото хидрофобни аминокиселинни остатъци, така че това е хидрофилен протеин. Онлайн софтуерът TMHMM беше използван за прогнозиране на трансмембранната структура на протеина. Протеинът CtCHS няма трансмембранен домен.
Фиг. 1 PCR амплификация на CtCHS ген
3.2.2 Прогноза за вторична структура и третична структура на CtCHS протеин
Онлайн инструментът SOPMA беше използван за прогнозиране на вторичната структура на протеина. Резултатите са показани на фигура 2-A. 44,87% -спирали, 31,03% произволни намотки, 15,64% удължени вериги и 8,46% -листове съставляват вторичната структура на протеина CtCHS. ниво структура. Софтуерът за онлайн анализ SWISS-MODEL беше използван за прогнозиране на третичната структура на протеина и кристалната структура на ориз CHS1 беше използвана като шаблон за прогнозиране на триизмерната структура на протеина CtCHS. Резултатите са показани на фигура 2-B. Консистенцията между Cistanche tubulosa CtCHS и ориз CHS1 е 83,55%.
3.2.3 Сравнение на последователности и анализ и приложение на филогенетично дърво
Софтуерът DNAMAN извършва хомоложно сравнение между CtCHS и CHS аминокиселинните последователности на други видове. Резултатите са показани на фигура 3-C. Аминокиселинната последователност на CtCHS е в съответствие със Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) и Antirrhinum majus L. (P06515.1), Mazus pumilus (NL Burman)Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1) и Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Аминокиселинните последователности на CHS са много сходни, като сходството е 90,93%, 90,68%, 90,18%, 89,42%, 89,42% и 81,61%.
НАТУРАЛЕН ОРГАНИЧЕН ЕКСТРАКТ ОТ ЦИСТАНКА С 30% ЕХИНАКОЗИД И 12% АКТЕОЗИД
В допълнение, множественото подравняване на последователности също показа, че CtCHS има запазени каталитични остатъци Cys164, His303 и Asn336. За да се разбере по-нататък еволюционната позиция на Cistanche tubulosa CtCHS в растителното семейство CHS, софтуерът MEGA-X беше използван за конструиране на филогенетично дърво между CtCHS и CHS протеините на други растения. Резултатите са показани на фигура 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS е тясно свързан.
3.3 CtCHS прокариотна експресия и пречистване
Плазмидът pET-28a-CtCHS се трансформира в експресионен щам на Е. coli BL21 (DE3) и протеиновата експресия се индуцира от IPTG при ниска температура. Протеинът се пречиства като се използва хроматографска колона с афинитет към никелови йони и пречистеният протеин се открива чрез 10% SDSPAGE. Резултатите са показани на Фигура 3. Ивицата CtCHS протеин се появява близо до 40, 000, което е в съответствие с относителната молекулна маса на CtCHS протеина от 42 800.
3.4 Анализ на ензимната активност на CtCHS
За да се идентифицира функцията на CtCHS, пречистеният протеин CtCHS се инкубира с малонил-CoA, 4-кумароил-CoA и продуктите се откриват с помощта на HPLC и MS. При естествени условия нарингенин-халконът е нестабилен в разтвор и лесно се циклизира в нарингенин. Следователно, нарингенин-халкон и нарингенин бяха избрани като стандартни контроли.
Резултатите от HPLC теста са показани на фигури 4-A и B. Времето на задържане на продукта от ензимната реакция е подобно на това на стандарта нарингенин. И двата имат максимална абсорбция при 289 nm в спектъра на UV абсорбция, което е различно от времето на задържане на нарингенин-халкон. Времевият и UV абсорбционният спектър са различни, но като отрицателна контрола, продуктът след инкубиране на инактивирания при висока температура CtCHS протеин със субстрата не съдържа нарингенин, халкон и нарингенин. По-нататъшно откриване чрез масова спектрометрия, масовият спектър от първо ниво (Фигура 4-C, D) показа, че продуктът от ензимната реакция има [MH]-пик m/z271.060 97, докато нарингенинът има [MH ]-пик m/z 271.060 91.
Сравнявайки MS2 спектрите (Фигура 5-E, F), продуктът на ензимната реакция CtCHS и нарингенинът имат характерни пикове на фрагменти при m/z 107, 151 и 177, което е в съответствие с литературния доклад [19], което показва, че CtCHS има халконов комплекс. Ензимна активност, той може да катализира реакцията на малонил-CoA и 4-кумароил-CoA в нарингенин-халкон.
3.5 Анализ на субклетъчната локализация
За да се изследва ролята на протеина CtCHS в клетките, плазмидът pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS беше конструиран и трансформиран в протопласти на Arabidopsis thaliana, за да се наблюдава неговата субклетъчна локализация. Резултатите са показани на Фигура 5. Като контрола протеинът pCAMBIA1300-35S-GFP се разпределя в ядрото и цитоплазмата, докато слетият протеин pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS се разпределя главно в цитоплазмата, което показва, че протеинът CtCHS може да функционира в цитоплазмата на растителните клетки. функция.
3.6 Анализ на модела на изразяване на CtCHS
qRT-PCR се използва за откриване на относителната експресия на CtCHS в цветя на Cistanche deserticola с три цвята: бяло, лилаво и червено. Резултатите са показани на фигура 6. Експресията на CtCHS в лилави и червени цветя е значително по-висока от тази в бели цветя. количество. В сравнение с бели цветя, нивото на експресия на CtCHS в лилави цветя е 8,44 пъти по-високо, а нивото на експресия на CtCHS в червени цветя е 3,21 пъти по-високо. Тези резултати показват, че промените в нивата на експресия на CtCHS могат да бъдат свързани с разликата в цвета на цветята на Cistanche deserticola. Колкото по-високо е нивото на изразяване, толкова по-тъмен е цветът на цветето. , колкото по-ниско е нивото на изразяване, толкова по-светъл е цветът на цветето.
****P＜0.000 1Фиг. 6 Относително ниво на експресия на CtCHS в цветя с различни цветове
4. Дискусия
CHS е aключов ензим в биосинтетичния път на флавоноидитеи е свързано с thрегулиране на цвета на цветятав много растения. Например цветът на цветето наDianthus chinensisL.[20] и Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] всички са засегнати от CHS. контрол.Cistanches tubulosaосновно има три цвята на цветята: бяло, червено и лилаво, но неговият механизъм за регулиране на цвета на цветята все още не е докладван. В това изследване, CtCHS ген беше клониран с помощта на RT-PCR чрезанализ на транскриптомни данни на цветя на Cistanches tubulosa, и е
Биоинформатичен анализбеше проведено и резултатите показаха, че CtCHS има голямо сходство и тясна генетична връзка с аминокиселинната последователност на ElCHS на Physalis nigra (AHJ80976.1). CHS е тип III поликетид синтаза (PKSIII) и проучванията са установили, че CHS има запазена каталитична триада Cys-His-Asn [23]. В това проучване анализът на подравняването на аминокиселинната последователност показа, че CtCHS има запазени каталитични остатъци Cys164, His303 и Asn336, което показва, че CtCHS може да има типична функция на халкон синтаза.
способен. Анализът на ензимната активност се извършва с помощта на прокариотна експресия на CtCHS протеин в Escherichia coli и се открива чрез HPLC и MS. Установено е, че протеинът CtCHS може да катализира 4-кумароил-КоА и малонил-КоА, за да произведе нарингенин-халкон.
CHS участва в синтеза на флавоноиди в много растения, но субклетъчното му местоположение е различно при различните видове. Например Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. Всички EaCHS[26] са разположени в цитоплазмата, докато Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS
[27], патладжанът Solanum melongena L. SmCHS [28] се намира в цитоплазмата и ядрото, а при гроздето Vitis vinifera L. VvCHS се намира в цитоплазмата, ядрото и клетъчната стена [29]. В това проучване плазмидът pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS е използван за трансформиране на протопластите на Arabidopsis thaliana и е наблюдавано, че протеинът CtCHS е локализиран главно в цитоплазмата и може да катализира производството на нарингенин-халкон в цитоплазмата до насърчават натрупването на флавоноиди.
Фенилпропаноидният път се разклонява от 4-кумароил-КоА в пътя на синтеза на флавоноиди и пътя на биосинтезата на лигнан. CHS катализира 4-кумароил-КоА и малонил-КоА за генериране на нарингенин и халкон за иницииране на флавоноиди. Биосинтетичният път на съединения, подобни на съединения, е първият ключов ензим в този път [30]. Следователно, силно изразеният CHS е полезен за растенията да натрупват по-високи нива на флавоноиди и да произвеждат по-тъмни цветя. Например, нивото на експресия на CHS в сортове с лилави цветя на Hosta plantaginea (Lam.) Aschers е по-високо от това на сортове с бели цветя. Hosta HpCHS се трансформира в тютюн, за да се получи В сравнение с дивия тип тютюн, растенията със свръхекспресия имат по-тъмни венчелистчета и по-високо общо съдържание на антоцианин [31].
В това изследване нивото на експресия на гена CtCHS е свързано с цвета на цветята на Cistanches tubulosa. Той е силно изразен в по-тъмно лилави цветя и червени цветя и е слабо изразен в светло оцветени бели цветя. Разликата в експресията на CtCHS може да се дължи на разликата в цветовете на Cistanches tubulosa. Една от причините да имаме различни костюми и цветове. В обобщение, това проучване клонира CtCHS ген от цветя на Cistanche deserticola и провежда биоинформатичен анализ върху него. Рекомбинантният протеин CtCHS се получава чрез екзогенна експресия в Escherichia coli. Анализът на ензимната активност доказа, че протеинът CtCHS може да катализира 4-кумароил коензим. А и малонил-коензим А генерират нарингенин-халкон. Установено е, че генът CtCHS е силно експресиран в лилави и червени цветя и слабо в бели цветя. Тези резултати показват, че генът CtCHS може да регулира производството на различни цветове на цветята в Cistanche deserticola, което е от полза за по-нататъшни изследвания на регулаторния механизъм на цвета на цветята на Cistanche tubulosa и предоставя референция за последващи изследвания на ролята на CtCHS в регулирането на цвят на цветя в Cistanche deserticola.
