Клониране, функционална идентификация и експресионен анализ на халкон синтаза от Cistanche Tubulosa

Резюме: Цел Да се ​​изследва функцията на халкон синтазата от Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) и модела на експресия на CtCHS гена в бели, червени и лилави цветя.

Методи Генът CtCHS беше клониран чрез RT-PCR и беше извършен биоинформационен анализ. Плазмидът pET-28a-CtCHS се прехвърля в Escherichia coli, за да индуцира протеинова експресия чрез IPTG. Рекомбинантният протеин CtCHS се инкубира със субстратите р-кумароил СоА и малонил СоА и продуктите се откриват чрез HPLC и MS. Плазмидът pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS се прехвърля в протопласта на Arabidopsis thaliana, за да се наблюдава субклетъчната локализация на протеина CtCHS. Моделът на експресия на CtCHSgene в цветята наC. tubulosaс три цвята беше открит чрез qRT-PCR.

Резултати Беше клониран CtCHS ген. Дължината на отворената рамка за четене (ORF) е 1173 bp, кодираща 390 аминокиселини, а молекулното тегло на протеина е 42 8000. CtCHS съдържа каталитичните остатъци Cys164, His303, Asn336, които са запазени в халкон синтазата. Протеинът CtCHS се експресира в Е. coli и се пречиства, за да се получи рекомбинантният протеин. Протеинът CtCHS може да катализира p-кумароил CoA и малонил CoA, за да произведе нарингенин халкон. CtCHS протеинът е локализиран главно в цитоплазмата. Генът CtCHS беше силно експресиран в лилави и червени цветя и относителните нива на експресия бяха съответно 8,44 и 3,21 пъти по-високи от тези в белите цветя.

Заключение CtCHS ген е клониран от цветето наC. tubulosaи се експресира протеин. CtCHSпротеинът има функция на халкон синтаза и експресията на CtCHS гена е по-висока в по-тъмните цветя, което показва, че CtCHSgene може да регулира цвета на цветята на C. tubulosa, което поставя основата за по-нататъшни изследвания нарегулиращ механизъм на цвета на цветята на C. tubulosa.

Ключови думи:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; халкон синтаза; анализ на ензимната активност; субклетъчна локализация; експресионен анализ

НАТИСНЕТЕ ТУК, ЗА ДА ВЗЕМЕТЕ НАТУРАЛЕН ОРГАНИЧЕН ЕКСТРАКТ ОТ ЦИСТАНША С 30% ЕХИНАКОЗИД И 12% АКТЕОЗИД

Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/телефон:+86 15292862950

Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Биосинтетикътпът на флавоноидитезапочва с фенилпропаноидния път.Фенилаланинпърво се превръща в канелена киселина поддействие на фенилаланин амониаза(PAL), а канелената киселина е 4-хидроксилирана от канелена киселина. Ензимът (-4-хидроксилаза на канелена киселина, C4H) и 4-кумараткоензим А лигаза (4-кумараткоензим А лигаза, 4CL) катализират реакцията за генериране на 4-кумароил-КоА [11 ]. Една молекула 4-кумароил-КоА и три молекули малонил-КоА се катализират от халкон синтаза (CHS) за генериране на нарингенин халкон, който има флавоноидни съединения Основният скелет на халкон изомераза, флаванон-3-хидроксилаза, дихидрофлавонол 4-редуктаза и др. генерира различни флавоноиди като изофлавони, флавоноли, антоцианини и др. [12]. Като ключов ензим в биосинтетичния път на флавоноидите, CHS регулира съдържанието на флавоноиди в растенията и също така играе важна роля в регулирането на цвета на растенията [13]. Например, посттранскрипционното генно заглушаване на Gentiana scabra Bunge CHS може да инхибира биосинтезата на антоцианини и да причини специфично избелване на лобовете на венчето [14]. Заглушаване на CHS ген на Actinidia erianthaBenth. CHS намалява съдържанието на антоцианин във венчелистчетата и прави венчелистчетата червени. Венчелистчетата стават по-светли на цвят[15]. Следователно, в това изследване, CtCHS ген беше клониран от цветя на Cistanche tubulosa и върху него бяха извършени биоинформатичен анализ, прокариотна експресия и пречистване, анализ на ензимната активност, анализ на субклетъчна локализация и анализ на експресия в три цвята цветя, за да се изследва функцията на CtCHS протеинът и моделът на експресия на гена CtCHS бяха използвани за предварително изследване на връзката между CtCHS и цвета на цветята на Cistanche tubulosa, което постави основата за изследване на регулаторния механизъм наЦвят на цветя Cistanche tubulosa.

1 Материали и инструменти

1.1 Материали

Цветовете на Cistanche tubulosa бяха събрани от окръг Ютиен, префектура Хотан, Синдзян през май 2018 г. По време на вземането на проби беше следван принципът на случаен принцип и бяха избрани цветя на Cistanche tubulosa с добро физиологично състояние и постоянна височина на растенията. Три щама Cistanche tubulosa с три цвята на цветята - бяло, червено и лилаво, бяха взети и идентифицирани като Cistanche tubulosa (Schenk) Wight от професор Tu Pengfei от Факултета по фармация на Пекинския университет. Те бяха бързо замразени в течен азот и след това транспортирани до Пекин в хранилище със сух лед. Химически компетентните клетки E. coli DH5 бяха закупени от Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., а химически компетентните клетки E. coli BL21 (DE3) бяха закупени от Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Векторът е закупен от Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA е закупен от Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, нарингенин -халкон са закупени от Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., а нарингенинът е закупен от Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Инструменти

спектрофотометър Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, САЩ); градиентен PCR инструмент (Eppendorf Company, Германия); CFX 96 флуоресцентен количествен PCR инструмент, UVP гел изображение, инструмент за гел електрофореза, инструмент за протеинова електрофореза (BioRad Company, САЩ); EnSpire

Четец на микроплаки (PerkinElmer Company, САЩ); инкубатор с постоянна температура (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D с голям капацитет пълнотемпературен осцилатор (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Осцилатор с постоянна температура на водна баня (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); ултрачиста работна маса AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); парен стерилизатор с високо налягане (TOMY Company, Япония); Инструмент за чиста вода Milli Q (Millipore, САЩ); LC-20Високоефективен течнофазов хроматограф (Shimadzu Company, Япония); Масова спектрометрия с висока разделителна способност UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, САЩ); Лазерен конфокален микроскоп FV1200 (Olympus Company, Япония).

2 Експериментални методи

2.1 РНК екстракция и сДНК синтез.

Цветовете на Cistanche tubulosa се смилат в течен азот и след това се подлагат на анализ за екстракция на РНК.

Общата РНК беше извлечена с помощта на комплект (Norgen, Cat 17200), концентрацията и качеството на РНК бяха открити от NanoDrop 2000C и РНК проби със съотношение A260/A280 между 1.8 и 2.1 бяха избрани за обратна транскрипция за синтезиране на cDNA. M-MLV обратна транскриптаза (Promega, M170B) се използва за обратна транскрипция на квалифицираната обща РНК в сДНК. Експерименталните операции бяха извършени съгласно инструкциите.

2.2 Клониране на CtCHS ген

Въз основа на данните за транскриптома на цветя Cistanche tubulosa на нашата изследователска група [16], CtCHS с пълна отворена рамка за четене беше отсеян и софтуерът SnapGene беше използван за проектиране на специфични праймери въз основа на генната последователност (Таблица 1). PCR амплификацията се извършва, като се използва сДНК на цветя на Cistanche tubulosa като шаблон. Системата за амплифициране беше 2 × буфер Phanta Max 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, праймери нагоре и надолу по веригата (10 μmol/L) по 2 μL всеки, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity ДНК полимераза 1 μL, ddH2O 17 μL. Реакционните условия са: предварително денатуриране при 95 градуса за 3 минути; 25 цикъла на денатурация при 95 градуса за 15 секунди, отгряване при 55 градуса за 15 секунди и удължаване при 72 градуса за 1 минута; удължаване на реакцията при 72 градуса за 5 минути. PCR продуктът се открива чрез електрофореза с 1% агарозен гел и комплектът за пречистване на ДНК (Novizan, Cat DC301-01) се използва за възстановяване на гела и след това възстановената ДНК се пречиства чрез комплект за бързо клониране (Novizan, Cat C 601-01). ДНК фрагментът се лигира с pCE2TA/Blunt-Zero вектор, трансформира се в компетентни клетки на Escherichia coli DH5 и след култивиране за една нощ при 37 градуса, единични клонирани щамове се избират и изпращат на компанията за секвениране.

Таблица 1 Праймерни последователности

2.3 Биоинформатичен анализ

Използвайте онлайн софтуер ProtParam за анализ на физичните и химичните свойства на протеина; използвайте онлайн инструмента Prot Scale за анализ на хидрофилността/хидрофобността на протеина; използвайте онлайн инструмента SOPMA за прогнозиране на вторичната структура на протеина; използвайте софтуера за онлайн анализ SWISS-MODEL за предсказване на третичната структура на протеина; използвайте онлайн софтуер TMHMM Предскажете трансмембранната структура на протеина; използвайте софтуера DNAMAN, за да сравните хомологията на CtCHS с аминокиселинните последователности на CHS на други видове; използвайте софтуера MEGA-X, за да конструирате филогенетично дърво, като използвате свързване на съседи (NJ) и корекция на Поасон. Еволюционното разстояние се изчислява с помощта на метода Bootstrap, а броят на повторенията на Bootstrap е 1000 пъти.

2.4 CtCHS прокариотна експресия и пречистване

Проектирайте праймери с рестрикционни сайтове BamHⅠ и XhoⅠ на базата на CtCHS последователността и PCR амплифицира съответните целеви фрагменти. Векторът pET{0}}a и целевият фрагмент се усвояват с помощта на ендонуклеази BamHI и Клонираният щам се секвенира и плазмидът се екстрахира след правилно секвениране. Плазмидът pET-28a-CtCHS, проверен чрез секвениране, се прехвърля в компетентни клетки на Escherichia coli BL21 (DE3). Обърнете се към метода на Ding Ning et al. [17] с изопропил

-D-тиогалактопиранозид (IPTG) се използва за индуциране на протеинова експресия при ниска температура и се пречиства чрез Ni2+ афинитетна хроматографска колона (Cytiva, Cat 17531901). Протеинът се концентрира чрез центрофугиране в ултрафилтрационна епруветка (Millipore, 30 000) и се обезсолява. Съхранявайте в 20 mmol/L KPB буфер (pH 8,0, съдържащ 1 mmol/LEDTA) и съхранявайте в хладилник при -80 градуса за дългосрочно съхранение.

2.5 Анализ на ензимната активност на CtCHS

CtCHS ензимна реакционна система: 100 mmol/L KPB (рН 7,5) 468 μL, 1 mmol/L малонил-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-кумароил-CoA 2 μL, CtCHS рекомбинантен протеин 20 μL, в След взаимодействие във водна баня при 37 градуса за 12 часа, сместа се екстрахира три пъти с 800 μL етилацетат, изсушава се с поток от азот и след това се разтваря в 100 μL метанол. Използвайте високоефективна течна хроматография за откриване на продукта. Условията са колона Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), температура на колоната 30 градуса, обем на пробата 10 μL и вода (A) и ацетонитрил (B) като поток. Фаза, градиент на елуиране: 0~10

мин. 30% В; 10~20 минути, 30%~60% B; 20~25 минути, 60%~70% B; 25~30 минути, 70%~80% B; 30~35 минути, 80%~100% B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Обемната скорост на потока е 1 mL/min и откриването е при дължина на вълната 290 nm.

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS беше използван за по-нататъшно откриване. Условията на течната фаза бяха колона Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), температура на колоната 40 градуса, нарингенин- халкон и нарингенин контроли. Зареждащият обем на продукта е 4 μL, а зареждащият обем на продукта от ензимната реакция е 7 μL. Като подвижна фаза се използва вода (А)-ацетонитрил (В). Градиентът на елуиране е: 0 до 5 минути, 30% В; 5 до 15 минути, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Обемната скорост на потока е 0,3 mL/min. Условията на масовата спектрометрия са електроразпръскващ йонен източник, азот като газ-носител, налягане на обвивния газ 3,5 MPa, налягане на спомагателния газ 1,0 MPa, налягане на разпръскване 3500 V, капилярна температура 350 градуса, температура на нагряване на спомагателния газ 200 градуса, режими на положителни и отрицателни йони, сканиране йонният диапазон m/z е 100-1500, пълната MS разделителна способност е 35 000, разделителната способност dd-MS2 е 17 500, (N)

CE/stepped nce, зададен на 35, 60.

2.3 Биоинформатичен анализ

Използвайте онлайн софтуер ProtParam за анализ на физичните и химичните свойства на протеина; използвайте онлайн инструмента Prot Scale за анализ на хидрофилността/хидрофобността на протеина; използвайте онлайн инструмента SOPMA за прогнозиране на вторичната структура на протеина; използвайте софтуера за онлайн анализ SWISS-MODEL за предсказване на третичната структура на протеина; използвайте онлайн софтуер TMHMM Предскажете трансмембранната структура на протеина; използвайте софтуера DNAMAN, за да сравните хомологията на CtCHS с аминокиселинните последователности на CHS на други видове; използвайте софтуера MEGA-X, за да конструирате филогенетично дърво, като използвате свързване на съседи (NJ) и корекция на Поасон. Еволюционното разстояние се изчислява с помощта на метода Bootstrap, а броят на повторенията на Bootstrap е 1000 пъти.

2.4 CtCHS прокариотна експресия и пречистване

Проектирайте праймери с рестрикционни сайтове BamHⅠ и XhoⅠ на базата на CtCHS последователността и PCR амплифицира съответните целеви фрагменти. Векторът pET{0}}a и целевият фрагмент се усвояват с помощта на ендонуклеази BamHI и Клонираният щам се секвенира и плазмидът се екстрахира след правилно секвениране. Плазмидът pET-28a-CtCHS, проверен чрез секвениране, се прехвърля в компетентни клетки на Escherichia coli BL21 (DE3). Обърнете се към метода на Ding Ning et al. [17] с изопропил

-D-тиогалактопиранозид (IPTG) се използва за индуциране на протеинова експресия при ниска температура и се пречиства чрез Ni2+ афинитетна хроматографска колона (Cytiva, Cat 17531901). Протеинът се концентрира чрез центрофугиране в ултрафилтрационна епруветка (Millipore, 30 000) и се обезсолява. Съхранявайте в 20 mmol/L KPB буфер (pH 8,0, съдържащ 1 mmol/LEDTA) и съхранявайте в хладилник при -80 градуса за дългосрочно съхранение.

2.5 Анализ на ензимната активност на CtCHS

CtCHS ензимна реакционна система: 100 mmol/L KPB (рН 7,5) 468 μL, 1 mmol/L малонил-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-кумароил-CoA 2 μL, CtCHS рекомбинантен протеин 20 μL, в След взаимодействие във водна баня при 37 градуса за 12 часа, сместа се екстрахира три пъти с 800 μL етилацетат, изсушава се с поток от азот и след това се разтваря в 100 μL метанол. Използвайте високоефективна течна хроматография за откриване на продукта. Условията са колона Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), температура на колоната 30 градуса, обем на пробата 10 μL и вода (A) и ацетонитрил (B) като поток. Фаза, градиент на елуиране: 0~10

мин. 30% В; 10~20 минути, 30%~60% B; 20~25 минути, 60%~70% B; 25~30 минути, 70%~80% B; 30~35 минути, 80%~100% B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Обемната скорост на потока е 1 mL/min и откриването е при дължина на вълната 290 nm.

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS беше използван за по-нататъшно откриване. Условията на течната фаза бяха колона Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), температура на колоната 40 градуса, нарингенин- халкон и нарингенин контроли. Зареждащият обем на продукта е 4 μL, а зареждащият обем на продукта от ензимната реакция е 7 μL. Като подвижна фаза се използва вода (А)-ацетонитрил (В). Градиентът на елуиране е: 0 до 5 минути, 30% В; 5 до 15 минути, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Обемната скорост на потока е 0,3 mL/min. Условията на масовата спектрометрия са електроразпръскващ йонен източник, азот като газ-носител, налягане на обвивния газ 3,5 MPa, налягане на спомагателния газ 1,0 MPa, налягане на разпръскване 3500 V, капилярна температура 350 градуса, температура на нагряване на спомагателния газ 200 градуса, режими на положителни и отрицателни йони, сканиране йонният диапазон m/z е 100-1500, пълната MS разделителна способност е 35 000, разделителната способност dd-MS2 е 17 500, (N)

CE/stepped nce, зададен на 35, 60.

2.6 Субклетъчна локализация на CtCHS протеин

На базата на CtCHS последователността и принципа на безпроблемно клониране бяха проектирани праймери с места за рязане на ензим Kpn Ⅰ и BamH Ⅰ и съответните целеви фрагменти бяха амплифицирани чрез PCR. Плазмидът pCAMBIA1300-35S-GFP се усвоява с рестрикционни ендонуклеази Kpn Ⅰ и BamH Ⅰ и целевият фрагмент и векторът се свързват чрез безпроблемния комплект за клониране (Novizan, Cat C115-01) и след това се прехвърлят в Е. coli DH5 компетентни клетки. , изберете единични клонирани щамове за секвениране и извлечете плазмиди от правилните щамове. Плазмидите pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS и pCAMBIA 1300-35S-GFP се трансформират в протопласти на Arabidopsis thaliana с помощта на PEG4000 и се култивират при слаба светлина в продължение на 8 до 10 часа. Субклетъчната локализация на CtCHS протеин се наблюдава под лазерен конфокален микроскоп.

2.7 Анализ на модела на изразяване на CtCHS

Флуоресцентните количествени праймери в реално време са проектирани с помощта на DNAMAN на базата на CtCHS последователността, с F-box като вътрешен референтен ген. Последователностите на праймерите са показани в таблица 1. Относителната експресия на CtCHS в цветя на Cistanche tubulosa с различни цветове се открива чрез флуоресцентна количествена PCR в реално време. Използвайте TransStart Green qPCR SuperMix (пълно златисто, AQ101-02) за измерване с метода на флуоресцентно багрило SYBRGreen. Реакционна система: 2 × TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, праймери нагоре и надолу по веригата (10 μmol/L) 0.2 μL всеки, cDNA шаблон 0,5 μL, 4,1 μL вода без нуклеотидаза беше използвана за реакцията с помощта на двуетапен метод. Реакционната процедура се основава на метода на Dong Xianjuan et al. [18]. Всяка проба съдържа 3 биологични повторения и експериментът се повтаря три пъти. Експерименталните данни бяха анализирани с помощта на Excel, относителният израз на CtCHS беше изчислен с помощта на метода 2−ΔΔCt и GraphPadPrism 8 беше използван за извършване на анализ на значимостта и изчертаване на хистограми.