Комбинираната пангеномика и транскриптомика разкрива основни и излишни вирулентни процеси в бързо развиващ се гъбичен растителен патоген

Резюме

Заден план

Изучаването на геномни вариации в бързо развиващите се патогени потенциално позволява идентифицирането на гени, поддържащи тяхната "основна биология", присъстващи, функционални и експресирани от всички щамове или "гъвкава биология", варираща между щамовете. Гените, поддържащи гъвкава биология, могат да се считат за „аксесоари“, докато „основният“ набор от гени вероятно ще бъде важен за общи характеристики на биологията на патогенния вид, включително вирулентност върху всички генотипове на гостоприемника. Патогенната за пшеницата гъба Zymoseptoria tritici представлява една от най-бързо развиващите се заплахи за глобалната продоволствена сигурност и беше фокусът на това проучване.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Резултати

Конструирахме пангеном от 18 европейски полеви изолати, като 12 също бяха подложени на профилиране на транскрипция на RNAseq по време на инфекция. Комбинирайки тези данни, ние предвидихме "основен" генен набор, включващ 9807 последователности, които (1) присъстваха във всички изолати, (2) липсваха инактивиращи полиморфизми и (3) се експресираха от всички изолати. Беше дефиниран и голям допълнителен геном, състоящ се от 45% от общите гени. Ние класифицирахме генетичния и геномния полиморфизъм както на хромозомни, така и на индивидуални генни скали. Протеините, необходими за основни функции, включително вирулентност, имат по-ниска от средната променливост на последователността сред основните гени. Както основният, така и спомагателният геном кодират много малки, секретирани кандидат ефекторни протеини, които вероятно взаимодействат с растителния имунитет. Медиирана от вирусен вектор преходна свръхекспресия в planta на 88 кандидати не успя да идентифицира нито една, която индуцира некроза на листата, характерна за болестта. Въпреки това, функционалното допълване на непатогенен делеционен мутант, лишен от пет основни гена, демонстрира, че пълната вирулентност е възстановена чрез повторно въвеждане на единичния ген, проявяващ най-малък полиморфизъм на последователността и най-висока експресия.

Изводи

Тези данни подкрепят комбинираното използване на пангеномика и транскриптомика за дефиниране на гени, които представляват основните и потенциално използваеми слабости в бързо развиващите се патогени.

Ключови думи

Мозаечен вирус на лисича опашка, Septoria tritici, Некротрофен ефектор, Есенциални гени, Допълнителни хромозоми, Дотидеомицети,Хромозомна нестабилност, Mycosphaerella spp

Заден план

Устойчивият контрол на инфекциозните заболявания, засягащи животните и растенията, е предизвикан от еволюцията на причинителите на микроорганизми [1, 2]. Най-трудните за контролиране заболявания са тези, причинени от най-бързо развиващите се видове, които могат бързо да реагират на селективен натиск, включително естествен имунитет на гостоприемника, неблагоприятни условия на околната среда и/или антиинфекциозни лекарства [1, 3]. Потенциалът на микробните патогени да се развиват бързо се определя от няколко характеристики, включително между другото; (1) бърз жизнен цикъл и (2) механизми, които насърчават сексуалното размножаване [4]. Последното може да доведе до големи нива на постоянни генетични вариации, съществуващи в популациите на патогени, които могат да бъдат поддържани и усилени в лицето на външен селективен натиск. Въпреки че има вероятност определени гени да проявяват естествени генетични вариации на последователностите, движещи тяхната еволюция, други не могат да бъдат загубени (или инактивирани чрез мутация), без да се повлияе на годността на патогените. За еукариотните и прокариотните растителни патогени, тази разлика в нивата на полиморфизъм между гените е довела до реализацията на "двускоростни геноми" [5], които включват някои компоненти, които бързо се развиват и се смята, че реагират на външни драйвери (обхват на гостоприемника и имунитет и т.н.), докато по-бавно развиващият се набор съдържа гени с основни домакински и други основни функции. Допълнителните и основните части на патогенните геноми могат да бъдат сглобени в "пангеном", който трябва да представлява почти пълния набор от гени, присъстващи във вида [6]. Размерът на сърцевината и допълнителните части на пангеномите варира в рамките на видовете бактерии, гъбички и оомицети [7–13] и може да даде индикация за потенциала на микробните популации да се развиват бързо до селективен натиск. Възможно е колкото по-голям е допълнителният пангеном спрямо ядрото, толкова по-способни са тези популации да се развиват бързо. Аскомицетният гъбичен патоген на пшеницата, Zymoseptoria tritici, е причинителят на Septoria tritici blotch (STB), глобално важно заболяване, което застрашава продоволствената сигурност [14]. Патогенът също така отдавна се разглежда като моделна система за изследвания върху популационната биология и еволюцията [15–18]. Това е така, защото Z. tritici има висока степен на сексуална рекомбинация, която поддържа големи количества постоянно генетично разнообразие в своите популации и позволява бърза адаптация както в глобален, така и в местен мащаб [17, 19–24]. Като следствие, основните гени на пшеницата, придаващи резистентност към Z. tritici, бързо се преодоляват [25]. В допълнение, повечето от широко използваните търговски фунгициди губят своята ефективност с течение на времето [3]. Комбинацията от тези два фактора представлява заплаха за световното производство на пшеница, която трябва спешно да бъде разгледана. Z. tritici също наскоро се появи като нов модел за патогенна геномика с много висококачествени препратки към геноми, които вече са налични [26] в допълнение към пангеномите, конструирани от голям брой индивидуални изолирани геноми [27, 28]. Може би една от най-интересните характеристики на генома на Z. tritici е наличието на 13 основни хромозоми (1-13), открити във всички изолати, но след това до още 8 по-малки допълнителни хромозоми (14-21), които показват наличието/отсъствието и структурния полиморфизъм между изолатите [26, 29]. За щастие, един от референтните изолати на общността и първият, който е напълно секвениран, холандският полеви изолат IPO323, събран през 1980 г., носи 21 хромозоми, най-големият брой, наблюдаван до момента. Следователно IPO323 служи като отличен еталон за изучаване на вариации в други изолати и като скеле за изграждане на пангеноми.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Цикълът на асексуална инфекция на Z. tritici е типичен за много свързани растителни патогени, засягащи много хранителни култури [30]. Тези гъбички, принадлежащи към семейство Mycosphaerellaceae от разред Dothideomycetes, обикновено нахлуват в растителните тъкани през устицата [30, 31]. След това следва период на дълъг асимптоматичен растеж между растителните клетки, продължаващ най-малко 8 дни, който завършва внезапно с образуването на некротични лезии по листата, ситуация, която за Z. tritici изглежда възниква в резултат на "хиперактивиране" на растението имунитет [32–34]. Смъртта на растителните клетки впоследствие се свързва с образуването на нови структури на спорулация, пикнидии, в субстомалните кухини и последващото екструдиране и разпространение на новообразувани пикнидиоспори по време на периоди на пръскащи валежи. Доказано е, че други гъби Dothideomycetes предизвикват хиперактивиране на растителния имунитет чрез секрецията на протеинови "ефектори", които се разпознават в чувствителните растения, което води до клетъчна и тъканна смърт (некроза или програмирана клетъчна смърт). Тези некротрофни гъби се възползват от този отговор и участващите ефекторни протеини сега се наричат ​​некротрофни ефектори [35, 36]. Въпреки че има някои предварителни доказателства, че Z. tritici може също така да разгърне некротрофни ефектори при преминаване към симптоматичен растеж [37], предизвиквайки лезии на листата, тази хипотеза не е категорично тествана до момента. Двата взаимно неизключващи се начина за защита на бъдещото производство на пшеница от въздействието на STB са (1) повишаване на естествената устойчивост на болести по растенията и (2) идентифициране на нови молекулярни цели, които могат да бъдат използвани за контрол на болести. В идеалния случай те биха позволили селективен контрол на патогена, като същевременно ограничават други въздействия върху околната среда и околната среда до минимум. Геномиката на патогените и по-специално пангеномиката предлагат потенциал за разширяване на двете стратегии. Докато протеините, кодирани от допълнителната, бързо развиваща се част от пангенома, може да съдържат много гени, които взаимодействат с растителния имунитет (напр. ефектори), основният геном може да представлява цели, които мутират по-малко лесно поради придаване на отрицателни наказания за годност (и вирулентност). Поради тази причина земеделските фунгициди обикновено са насочени към основни процеси, които вероятно се считат за по-малко променливи. Въпреки това, както беше споменато по-рано, дори тези мишени могат да се развият до известна степен, за да избегнат химическото инхибиране, както е описано за много настоящи фунгицидни целеви протеини [3, 14]. Повечето фунгициди, използвани досега, са насочени към доста тесен набор от молекулярни процеси (напр. биосинтеза на стерол, дишане и др.) [3]. Има потенциално много други цели, които биха могли да се използват за селективен контрол на гъбични патогени, които трябва да възникнат от комбинирането и анализирането на множество набори от данни omics. Високият потенциал за откриване се подчертава от факта, че обикновено до 40% от всички гени, идентифицирани в последователностите на генома на патогенни гъби (и гъби като цяло) все още са с неизвестна функция. Тези, които присъстват и вероятно са запазени в основния геном на патогенни гъби, могат да бъдат от особено значение.

Pangenomics of rapidly evolving pathogens could be used to identify core, potentially specific gene sets, which could be exploited in future disease control [11]. The premise is that genes which are not evolving, in an otherwise rapidly evolving species, are most likely to be essential for either life or important for key virulence processes of the pathogen. Pangenomes themselves have, to date, largely been defined by sequencing genomic DNA from multiple members of a species. Whilst this is a critical and indispensable step in ascertaining the full potential of a species' genomics, gene expression support is perhaps overlooked for refinement of core and accessory gene calls, particularly in relation to biological processes such as pathogenicity/virulence. For example, if a core gene, predicted through genomic DNA sequence analysis, is not expressed by a successful pathogenic strain/ isolate during infection, it might be more appropriately considered accessory. Pangenome analyses on fungi and yeasts have recently emerged and have highlighted some major differences in the size of core and accessory gene components. For example, one recent study which analyzed the animal pathogenic yeasts, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, the free-living yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the animal filamentous fungal pathogen Aspergillus fumigatus, predicted each to have >80% гени, отбелязани като основни [10]. Въпреки това, други анализи на свързани с растения пламенни гъби са предвидили по-големи допълнителни генни компоненти, включително ~38% за патогените Claviceps purpurea [38] и ~44% в Pyrenophora tritici-repentis [39]. Предишни всеобхватни пангеномни проучвания върху Z. tritici са използвали глобални и исторически популации, включващи голям брой изолати, които са секвенирани както на фрагментирани, така и на пълни геномни скали [27, 28]. Тези проучвания идентифицират голям набор от допълнителни гени (~40% от всички гени) за този вид. В допълнение, това е свързано с екстензивно присъствие/отсъствие и хромозомни структурни полиморфизми, също включващи динамични повтарящи се елементи (включително транспонируеми елементи). По-нататъшният анализ също предполага, че много спомагателни гени също са по-ниско експресирани (средно) от основните гени. Тези изследвания представляват "златен стандарт" за структурата на пангенома на видовете Z. tritici и най-изчерпателните до момента за нишковидни гъбички. Въпреки това остава въпросът за този и други видове до каква степен пангеномиката може да се използва за идентифициране на основните вирулентни гени и процеси. И в рамките на основните набори гени, дали нивата на полиморфизми в цялата популация, засягащи промените на аминокиселините, както и нивата на генна експресия, издават идентичността на ключови гени за вирулентност на патогени?

В това изследване сме комбинирали секвениране на генома и базирани на RNAseq транскриптомични подходи, за да произведем пангеном от скорошна европейска колекция от изолати на Z. tritici. Нашата основна цел беше да тестваме дали гените, присъстващи в основния геном, кодиращи протеини с ниски нива на аминокиселинен полиморфизъм (т.е. в кодиращи последователности) между изолатите, изпълняват важни функции, включително основни роли в основните процеси на инфекция на пшеницата. В съгласие с предишните проучвания [27, 28], ние демонстрираме, че Z. tritici има изключително голям допълнителен геном (~ 45% от всички гени), подкрепящ неговия бързо развиващ се статус. Освен това, ние предоставяме биологични данни, които ясно подкрепят ползата от комбинираното използване на двата omics метода за идентифициране на нови основни вирулентни гени. Обратно, високопроизводителните вирусно-медиирани екрани за функционална свръхекспресия на протеини не успяха да идентифицират кандидат некротрофични ефектори, отговорни за предизвикване на болестни лезии в листата на пшеницата, както от сърцевината, така и от допълнителния пангеном.

растение цистанче, повишаващо имунната система

Резултати

Прегледите за вирулентност на европейска колекция от Z. tritici идентифицират подобни агресивни щамове от географски несвързани места

Тествахме 43 изолата на Z. tritici за вирулентност върху 21 широко чувствителни европейски сорта хлебна пшеница, за да дадем общо 2709 точки от данни (включително три репликации). Информацията за изолата (код и държава на произход) е представена в Допълнителен файл 1: Таблица S1. Всяко взаимодействие беше оценено количествено за следните параметри: (1) продължителността на инкубационния период, (2) времето, необходимо за достигане на пълна некроза (когато се случи) и (3) нива на асексуална спорулация (Фигура 1А). Въз основа както на изчислително, така и на визуално оценяване на заболяването (вижте Методи и Допълнителен файл 2: Фиг. S1), всички изолати след това бяха групирани въз основа на техните профили на вирулентност върху тествания панел от сортове (Фиг. 1B). Положителният контролен изолат IPO323, който служи като глобална референция [26] с напълно секвениран геном, е по-малко агресивен от повечето тествани изолати срещу почти всички сортове. Този изолат е събран през ~1984 г. и оттогава се съхранява на склад, с периодично повторно преминаване през листата на пшеницата; следователно, в момента не е ясно дали това наблюдение би могло (поне отчасти) да е възникнало от съхранението на проби във времето. Идентифицирахме седем изолата, които не бяха в състояние да произведат симптоми на заболяване при нито един от сортовете пшеница (фиг. 1B). Тъй като всички тези изолати произхождат или от Испания, или от Италия, където тетраплоидната (твърда/паста) пшеница (Triticum durum L.) се култивира по-често, е вероятно тези изолати да са специфични за твърдата пшеница [40, 41]. Показателно е, че изолати с подобни профили на вирулентност не са групирани на мястото на тяхното събиране, като изолати, произхождащи от далеч на изток като Словакия до чак на запад като Ирландия, всички групирани заедно (фиг. 1B). Това наблюдение се съгласува добре с високите нива на генетична вариация, съществуваща между изолати и предишни проучвания, които показват, че това е еднакво високо в мащаба на единична лезия на листа на пшеница, както на всички континенти [42]. Много от по-агресивните изолати с различни профили на вирулентност впоследствие бяха избрани за геномно секвениране (маркирано с "#" на Фиг. 1B) и RNAseq анализ (маркирано с "+" на Фиг. 1B).

Фиг. 1 Оценки на вирулентност на европейската колекция от изолати срещу редица хексаплоидни (хлебни) сортове пшеница. Типично времево развитие на заболяването, илюстриращо параметрите, оценени на екрана, включително времето, необходимо за появата на първите видими симптоми и за поява на пълна некроза на листата в инокулираната област. Фигурата показва инфекцията на пшеничен сорт Riband от Z. tritici изолат IPO323. B Профил на вирулентност на изолатите спрямо панела от сортове въз основа на нивата на листна некроза и хлороза. Измерванията бяха направени чрез визуални оценки и чрез използване на софтуера за анализ на изображения LemnaTec и LemnaGrid със сравними крайни резултати. Изолатите бяха класирани и групирани въз основа на данни за вирулентност. Изолатите на Z. tritici, подчертани с #, са геномно секвенирани за конструиране на пангеном. Изолатите, подчертани с +, също бяха анализирани чрез RNAseq транскриптомика. Пшеничният сорт Панорама (маркиран с X) е определено като еднакво и напълно податлив на повечето изолати и е избран като генотип гостоприемник за инфекцията на листата RNAseq. Обърнете внимание, че данните за ниска вирулентност за външната група от седем изолата срещу всички сортове е вероятно да са резултат от това, че тези изолати са адаптирани да причиняват заболяване на тетраплоидна пшеница (твърда или паста). Всички данни са представителни за три заразени листа, анализирани/взаимодействали с два биологични репликативни експеримента (общо 6 листа). C SplitsTree анализ на молекулярната филогенеза на изолати, избрани за геномно секвениране. Страната на произход на изолатите е показана в съкращението (Pl=Полша; GB=Великобритания; Be=Белгия; Cz=Чешка република; Ge {{8 }} Германия; Sw=Швеция; Fr=Франция; Sl=Словакия; Ir=Ирландия). Референтният изолат, IPO323, събран ~1984 г. от Холандия (Ne), също е представен

Геномна последователност и филогенетичен анализ на седемнадесет европейски изолати разкриват високи нива на генетично разнообразие

We used Illumina HiSeq 250 bp paired-end read technology to assemble the gene space of seventeen new isolates (indicated by # in Fig. 1B). BUSCO analysis (core dataset Pezizomycotina) was then performed to assess the completeness of each genome assembly (Table 1). Scores >97% във всички случаи показват добро сглобяване на генното пространство (кодиращи региони) за всички изолати. Няколко избрани BUSCO гени липсваха от всички групи, което предполага, че Z. tritici може да няма ортолози на тези гени. За да определим количеството генетични вариации, засягащи прогнозираните кодиращи региони, след това проведохме SNPEf анализ за всеки щам срещу пангеном, изграден върху пълния геном на референтния изолат IPO323 (Таблица 2). Този анализ показа, че всеки нов щам има повече от 160,000 SNPs срещу получения пангеном. Сред тях бяха повече от 65 000, които или причиниха потенциална загуба на протеинова функция (силен ефект, изместване на рамката, загубен старт, преждевременни стоп кодони) или предизвикаха аминокиселинна промяна в предвидените протеини (умерено). Тези данни демонстрират съществуващото генетично разнообразие между изолатите на Z. tritici.

Беше извършен анализ на разделено дърво върху 17-те ново секвенирани щама и IPO323, за да се определи дали изолатите с подобни модели на инфекция на сорта имат някаква филогенетична връзка и дали това е свързано със страната на произход. Филогенезата се определя с помощта на конкатенация на шест кодиращи и некодиращи последователности (вижте Методи и Допълнителен файл 3: Данни S1). Дървото (фиг. 1C) илюстрира още веднъж, че не е имало ясна връзка между профилите на вирулентност и мястото на вземане на проби за секвенираните изолати, с тясно свързани профили на вирулентност (в сравнение с фиг. 1B), наблюдавани за изолати, събрани от различни европейски страни, които въпреки това са били филогенетично тясно свързани.

Конструкцията и анализът на пангенома предсказва 9807 „основни“ и 8083 „допълнителни“ гена

В допълнение към последователностите на генома, ние избрахме 12 изолата за RNAseq-базирано профилиране на транскрипция (обозначено с + на Фиг. 1B). Всеки изолат беше профилиран в три екземпляра по време на аксеничен растеж в YPD бульон и също при два независими етапа на инфекция на листата; 6 дни след инокулацията (dpi), представляващи средната фаза без симптоми и 9 dpi, в преходната фаза на ранното развитие на симптомите. Универсално чувствителният пшеничен сорт Panorama беше използван за анализи на инфекция, които всички изолати бяха в състояние напълно да заразят с неразличима кинетика. Използвайки тези транскриптомни данни, комбинирани с новите геномни групи и оригиналната референтна последователност на IPO323 като скеле, ние определихме пангеном за европейските изолати, включващи също последователности, присъстващи в други изолати, които не бяха открити в IPO323. Стъпките в конструкцията на пангенома и нашите критерии за категоризиране на гените като "ядро" или "аксесоар" са показани на Фиг. 2. Важно е, че инактивиращият (висок ефект, загуба на функция-LoF) полиморфизъм на последователността и присъствието и отсъствието, съображения също бяха подкрепени от доказателства за генна експресия. По този начин генът трябва да присъства във функционална форма и да се експресира от всички изолати, за да бъде причислен към категорията "ядро". Нашият общ подход (фиг. 2) дефинира общ пангеном от 17 890 гена, включително 2017, които не присъстват в IPO323. Следващите стъпки на филтриране категоризираха 9807, за да пребивават в основния геном, само с малко по-малък номер, 8083, в комплекта аксесоари. Последният представлява ~45% от общия пангеном, леко увеличение спрямо описаното по-рано [28]. Въпреки че тези числа като цяло се съгласуват добре, оценките на допълнителните гени са по-субективни по отношение на пристрастията поради използваните методи (Panseq и т.н.) и не можем да предположим, че допълнителен бъдещ анализ може да не намали броя на допълнителните гени, използвайки, например, ортологично базирани подходи. Всички пангени бяха анализирани за множество характеристики (предсказания за секреция, мембранна асоциация, локализация и съдържание на цистеин) и прогнозирани функции (анотации BLAST, GO и Interpro). Предоставена е таблица, предоставяща цялата налична информация за всички гени (Допълнителен файл 4: Таблица S2). Таблицата също така показва относителните средни нива на генна експресия, получени от RNAseq, определени за всички гени за всичките 12 изолата при трите тествани условия. Като цяло, в сравнение с предишните пангеномни проучвания върху този организъм [27, 28], става ясно, че Z. tritici има един от най-големия брой допълнителни генетични компоненти на гъби, изследвани до момента, което вероятно отразява бързото му развитие природа.

Таблица 1 BUSCO анализ на нови геноми

Таблица 2 Обобщение на въздействието на SNP ефекта за всеки нов геном спрямо референтните генни модели IPO323

Фиг. 2 Резюме на стъпките, използвани за генериране на "основните" и "спомагателните" генни повиквания и номера за новоконструирания европейски пангеном на Z. tritici. Числата представляват броя на гените, идентифицирани на всеки етап от процеса

Структурни особености на вариациите в европейския пангеном на Z. tritici

Целта на това проучване беше да се тества хипотезата, че пангеномиката може да бъде използвана за идентифициране на важни нови гени, или от съществено значение за живота, или за вирулентност в патогенните организми. Ние предположихме, че това ще бъдат гени, присъстващи и функционални във и експресирани от всеки щам на патогена. Освен това спекулирахме, че тези гени ще имат по-ниски нива на SNP мутации с висок и умерен ефект, засягащи кодиращи последователности (по-малко полиморфни) и че те могат да се групират в региони на определени хромозоми.

Използвахме данни за вариация на SNP (висока, умерена и модификатор - вижте Допълнителен файл 4: Таблица S2), както и данни за средна експресия за всички гени, за да изследваме средните нива на кодиращ полиморфизъм и експресия на хромозомна основа, използвайки 21 хромозоми на IPO323 като скеле. Модифициращите SNP представляват нуклеотидни промени, които не предизвикват промяна на аминокиселини. Фигура 3A демонстрира, че не е имало особено отклонение за честотата на мутация, когато кумулативните високи, умерени и модифициращи SNPs са изразени като характеристика на средната дължина на протеина за цяла хромозома. Въпреки това, когато модифициращите мутации, т.е. тези, които не причиняват аминокиселинна промяна, бяха пропуснати, беше ясно, че най-малките 8 хромозоми притежават гени с по-голям брой високи и умерени SNP мутации (фиг. 3B). Този ефект беше допълнително подчертан, когато бяха анализирани само SNP с висок ефект (фиг. 3C). За разлика от нивата, очевидни при основните хромозоми 1-13 (~20%), до 90% от гените, намиращи се в осемте най-малки хромозоми 14-21, са били обект на силен ефект, вероятни мутации със загуба на функция в поне една изолат (фиг. 3C). Кумулативните данни за транскрипция от всичките 12 нови изолата също демонстрират относително ниска средна експресия на гени, присъстващи на хромозоми 14-21 (фиг. 3D), както беше наблюдавано преди това за IPO323 [32, 43, 44]. Взети заедно, тези данни показват ясна геномна компартментализация, като най-малките осем допълнителни хромозоми съдържат последователности, които са силно полиморфни, допълнителни и като цяло слабо експресирани.

Сравняването на всички гени в основния или допълнителния геном разкрива, че ~60% от всички гени в последния са открити в поне един щам с мутация със силен ефект (загуба на функция (LoF)) и че 47% също отсъстват от поне един щам (Допълнителен файл 4: Таблица S2). Подобно на анализа на допълнителните хромозоми, отделните допълнителни гени също бяха много слабо изразени като цяло в тестваните изолати (Допълнителен файл 4: Таблица S2) и имаха много по-голям брой последователности с неизвестни функции (приблизително 80%). Тези наблюдения се сравняват добре с предишни пангеномни проучвания, извършени върху глобални колекции от Z. tritici, събрани през десетилетия [27, 28].

Ние също така извършихме анализ на вариация на присъствие и отсъствие на ген по ген (PAV) за всички гени, предвидени в референтния изолат IPO323, за останалите 17 секвенирани изолати. Тези данни за присъствие/отсъствие бяха нанесени позиционно за всеки ген във всяка от 21-те хромозоми, присъстващи в IPO323. Фигури 3E и F показват данни от представителни основни хромозоми (1 и 7), докато Фигури 3G и H показват данни за представителни допълнителни хромозоми (13 и 14). Данните за останалите хромозоми са показани в Допълнителен файл 2: Фиг. S2. Този анализ идентифицира много гени, присъстващи в IPO323, които липсват в редица повторно секвенирани изолати и ясно показва разликата в цялостното присъствие/отсъствие на ген между "основните" хромозоми на IPO323 (които се намират във всеки щам Z. tritici) в сравнение с 8-те най-малки "допълнителни" хромозоми. Данните също така подчертават регион на хромозома 7 по-специално, между 1,7 Mb и 2,5 Mb, който показва висока честота на отсъствие на ген в новите изолати (фиг. 3F). Интересното е, че този регион съвпада точно с местоположение на генома, за което преди е било установено, че има минимална или никаква генна експресия в IPO323 или по време на растеж в култура, или по време на всяка фаза на инфекция на растението [32, 43]. Този регион също съответства на хромозомна делеция, която беше наблюдавана в йеменски изолат в предишно проучване на пангеном [28]. Заедно тези данни подсилват представата, че Z. tritici представлява бързо развиващ се организъм с високи нива и различни типове на генетично и геномно разнообразие в рамките на неговата популация.

Прогнозите за локализация на протеини разкриват гени в допълнителния пангеном, които могат да функционират при адаптиране към променящите се среди

Прогнозите за локализация на протеин на WolfPsort бяха проведени на всички протеини, кодирани от пангенома. След това изчислихме относителния процент на протеините, предвидени да се локализират във всяка субклетъчна област като характеристика на общия брой протеини за основния или спомагателния пангеном (фиг. 4). Няколко категории за локализация бяха обогатени в основния геном, включително "цитоплазма", "извънклетъчна" и "плазмена мембрана", последната от които съдържа много ключови транспортни функции (фиг. 4). Напротив, местата "ядро" и "митохондрии" са свързани с по-висок процент гени в допълнителния геном (Фиг. 4). Допълнителният геном е обогатен за определени домейни, свързващи цинк, които могат да осигурят гъвкавост на транскрипцията. Обогатяването на тази категория също беше докладвано в предишно проучване на пангенома, което подчертава, че цялостният ни тръбопровод генерира сравними резултати [27, 28]. „Митохондриалното“ обогатяване е интересно, тъй като съществуват псевдогени и паралози на истински митохондриални протеини, които са насочени към противогъбични химикали. Един ясен пример в допълнителния пангеном е паралог на субединица С на сукцинат дехидрогеназа (SDHC3), за която е доказано, че медиира постоянна резистентност към подклас SDHI (инхибитор на сукцинат дехидрогеназа) фунгициди в Z. tritici [45]. Идентифицирахме пълни последователности на този ген само в три от седемнадесетте секвенирани изолати и открихме високо ниво на генна експресия само в един от 12-те впоследствие изследвани от RNAseq (фиг. 5B). Въпреки това, предишното проучване и настоящият ни анализ подчертават, че наистина има важни функции в допълнителния геном, но те вероятно са по-важни за адаптирането към променящите се среди, отколкото за основния начин на живот.

Фиг. 3 Структурни характеристики на пангенома и полиморфизми на присъствие/отсъствие в 21-те хромозоми на референтния изолат IPO323. Общ брой кумулативни SNP мутации, придаващи модификатор, умерени (M) и високи (H-загуба на функция-LoF) промени на въздействието, изразени като характеристика на средната дължина на протеина (aa) на хромозома. B Общ брой кумулативни SNP мутации, придаващи промени с умерено и силно въздействие, изразени като характеристика на средната дължина на протеина на хромозома. C Общ брой кумулативни SNP мутации, придаващи промени със силно въздействие, изразени като характеристика на средната дължина на протеина на хромозома. D Средна средна експресия на всички гени, присъстващи на всяка от 21-те хромозоми във всички изолати. E Полиморфизъм на присъствие и отсъствие (PaV) на гените, предсказани в основна хромозома 1 на изолат IPO323 в 17-те ново секвенирани изолати. F PaV за гени на основна хромозома 7. G PaV за гени на допълнителна хромозома 15. G–F PaV за гени на допълнителна хромозома 15. Данните подчертават широки регионални вариации и отбелязват ясно разграничение между нивата на цялостните полиморфизми на последователностите и присъствието/ отсъствие, очевидно върху основните и допълнителните хромозоми

Фиг. 4 Предвидена локализация на протеини, кодирани от основни и спомагателни гени. Обобщение на прогнозираните процентни локализации на протеини, определени от WolfPsort за категории, посочени спрямо общите протеини, присъстващи в ядрото и допълнителния пангеном

Ефекторните протеини в допълнителния геном показват повече вариабилност между щамовете в експресията, отколкото тези в сърцевината

Над осем процента от гените в основния геном кодират предполагаеми секретирани протеини, брой по-висок от този за допълнителния геном (~5%). Въпреки това, гените в допълнителния геном, кодиращ секретиран протеин, са по-често с неизвестна функция, без разпознаваеми домейни или каталитични региони. Тези протеини с неизвестна функция възлизат на ~ 75% от общия допълнителен секретом спрямо 42% за основния секретом. Много от кандидат (и в някои случаи валидирани) ефектори, присъстващи в основния геном, бяха експресирани в подобни модели и до сравними нива във всичките дванадесет изолата, анализирани от RNASeq. Например, трите LysM (Lysin) домейн-съдържащи ефектори, 3LysM, 1LysM и xLysM, бяха експресирани до много сходни нива и в идентични модели от всеки щам (фиг. 5C-E). Te 3LysM ефекторът остава единственият основен секретиран детерминант на вирулентност на Z. tritici, където този протеин служи за потискане на предизвикания от хитин имунитет на растенията по време на ранна инфекция [46, 47]. Известно е обаче, че и трите LysM ефектора работят заедно за тази цел [48]. Следователно трябва да се отбележи, че има много малка вариация на експресията на тези гени между изолатите, което подсилва предположенията, че това потискане на защитата е основен компонент на инфекцията. За разлика от това, кандидат ефекторите, открити в допълнителния геном, показват както вариации на присъствие, така и на отсъствие и силно променлива експресия между изолатите (фиг. 5F–H). Например, AvrStb6, първият авирулентен ефектор, идентифициран в Z. tritici, [49, 50] показва значителна вариация на експресията (фиг. 5F), въпреки че присъства във всички изолати. Тази променлива на последователността, малък, секретиран протеин, се разпознава от сортове пшеница, съдържащи функционални алели на рецептор-подобната киназа Stb6 [25, 51]. Това разпознаване осигурява устойчивост на болести срещу всички изолати, които съдържат определен алел на този ефектор. Имаше значителна вариация на експресията на AvrStb6 между изолатите и ние идентифицирахме един изолат (Zt118), при който не успяхме да открием никаква експресия в нито едно от трите тествани условия. Поради тази причина в нашия тръбопровод за прогнозиране AvrStb6 беше класифициран в допълнителния геном. Много други кандидат-ефектори на понастоящем неизвестни функции показват значително присъствие/отсъствие и/или вариация на експресия в допълнителния геном (фиг. 5G и H).

Фиг. 5 Вариации на експресия на гени в сърцевината и спомагателния пангеном и установяване на преходна система за свръхекспресия на вируса, разгърната за некротрофични ефекторни екрани. На фигурите е показан ключ за тълкуване на данни. B Наличие/отсъствие и вариация на генната експресия за субединицата C на сукцинат дехидрогеназата, присъстваща в допълнителния геном. C–E Експресионни профили на ZtLysM ефекторите, 3LysM, 1LysM и xLysM, всички присъстващи в основния пангеном. F Експресионен профил на авирулентния ефектор AvrStb6. Липсата на каквато и да е експресия в изолат 118 класифицира ефектора към допълнителния пангеном. G и H Представляват примери за допълнителни кандидат-ефектори в допълнителния пангеном.

Функционалните екрани не предоставят доказателства за некротрофна ефекторна активност нито в основния, нито в допълнителния пангеном

Ние приехме наскоро разработена вирусно-векторно-медиирана протеинова преходна експресионна система за пшеница (и други зърнени и не-зърнени култури), използвайки вируса Foxtail Mosaic (FoMV), за да извършим скрининг със средна до висока производителност на кандидат Z. tritici ефектори от пангенома. Специално имахме за цел да проверим дали някой има способността да индуцира некроза върху малък панел от сортове пшеница, което може да предполага тяхната функция при прехода към симптомите на заболяването като "некротрофични ефектори" [36, 52]. За това проучване направихме някои модификации на публикуваната по-рано система [53]. За да стимулираме секрецията на извънклетъчен протеин в пшеница, използвахме свързаната с патогенезата на пшеницата сигнална пептидна последователност 1 (TaPR1), кодон-оптимизирана към Arabidopsis thaliana, която след това беше слята в рамка с всяка кандидат гъбична ефекторна последователност чрез генен синтез (фиг. 5I). Ефикасността на сигналния пептид TaPR1 да секретира функционални екстрацелуларни протеини на Z. tritici е установена от способността му да индуцира некроза на листата в тютюна, когато е поставен пред некрозата на Z. tritici и подобен на етилен индуциращ протеин (ZtNLP), който е функционален само когато са насочени към извънклетъчна секреция (фиг. 5 Jl) [54]. След това потвърдихме, че векторът може да свръхекспресира протеини еднакво добре в редица сортове пшеница чрез визуализиране на локална и системна експресия на зеления флуоресцентен протеин (GFP) в листата на различни сортове пшеница (Допълнителен файл 2: Фиг. S3). Накрая, след това тествахме способността на добре характеризирания некротрофичен ефектор SnToxA, от свързания пшеничен патоген Parastagonospora nodorum, да индуцира некроза в листата на пшеница на генотипове, притежаващи гена за чувствителност Tsn1 [55]. Както се очакваше, FoMV-медиираната свръхекспресия на SnToxA, със сигналния пептид TaPR1, индуцира некроза само на сорта пшеница, притежаващ Tsn1 (cv Halberd на Фиг. 5K) без симптоми, наблюдавани при сортове без този ген на чувствителност (cv Riband на Фиг. 5K). ). Тези данни потвърждават, че системата за свръхекспресия, медиирана от вирусен вектор, е подходяща за скрининг в по-голям мащаб на кандидат Z. tritici ефектори за идентифициране на всеки с некротрофна ефекторна активност. Общо 88 кандидати бяха избрани и проверени срещу пет сорта пшеница (Допълнителен файл 5: Таблица S3). Те обхващат 66 протеина, намиращи се в основния пангеном и 22 от аксесоара. Избраните гени (Допълнителен файл 5: Таблица S3) варират от основни гени без специфични за щама полиморфизми (мономорфни) и с висока експресия на planta, до тези в допълнителния геном, показващи присъствие/отсъствие и/или значителен полиморфизъм на експресия. Във всички експерименти бяха проведени паралелни технически контроли ToxA срещу cv Halberd и cv Riband и те винаги даваха очакваните резултати. Обратно, нито един от 88-те тествани протеини със свръхекспресия на Z. tritici не индуцира каквато и да е листна некроза на който и да е сорт пшеница. В обобщение, тези резултати не предоставят никакви доказателства за некротрофни ефектори и следователно няма подкрепа за нито един от тестваните кандидати за предизвикване на преминаване към некротрофен растеж по време на инфекция.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Основните гени, кодиращи протеини с демонстрирани или прогнозирани жизненоважни или ключови вирулентни функции, имат по-ниски общи нива на аминокиселинен полиморфизъм

Извършихме търсене в литература, за да идентифицираме всички гени на Z. tritici, които са били обект на функционална характеристика, или във вирулентност, или като основни гени, датиращи до 2018 г. Това генерира списък от 28 протеинови последователности (Допълнителен файл 6: Таблица S4). По подобен начин идентифицирахме списък от 26 протеина, които също бяха функционално характеризирани, но беше доказано, че не играят основна роля във вирулентността или са от съществено значение (Допълнителен файл 6: Таблица S4). След това изследвахме нивата на кумулативни излишни високи и умерени мутации в тези гени и изразихме техните стойности като характеристика на всяка дължина на протеина и след това определихме средните стойности за набора. Фигура 6 подчертава, че публикуваните гени, влияещи върху вирулентността, имат статистически значимо по-ниска честота (p=0.007) на мутация (полиморфизъм) от тези, за които е доказано, че са функционално излишни.

Изследванията, насочени към определяне на жизненоважни (основни) гени във филаментозни гъби (с изключение на дрожди), са малко и към днешна дата съществува само един представител в базата данни на основните гени (DEG), който е от опортюнистичния човешки патоген Aspergillus fumigatus [56–58]. Идентифицирахме ортолога на Z. tritici на всичките 28 гена, за които експериментално е доказано, че са от съществено значение за живота в A. fumigatus, и отново изчислихме относителните нива на мутация на всеки спрямо дължините на последователностите (Допълнителен файл 7, Таблица S5). Още веднъж открихме ясно статистически значимо намаление (p=0.0148) в честотата на високи и умерени SNP мутации в тези кандидат-съществени гени, след това наблюдавани за гени, за които е доказано, че не са от съществено значение нито за вирулентността, нито за живота ( Фиг. 6). Обратно, няма значителна разлика (p=0.2128) между нивата на мутация за експериментално валидирани гени за вирулентност и прогнозираните основни гени (фиг. 6). Тези данни заедно подкрепят концепцията, че нивата на аминокиселинни полиморфизми в популациите могат да се използват за прогнозиране на относителното значение на гените за основния начин на живот на организма.

Фиг. 6 Анализ на основни набори гени от експериментално потвърдена патогенност и/или предсказани основни за живота гени разкрива по-ниски нива на мутация, отколкото се наблюдава при несъществени гени. Средните високи и умерени (H/M) нива на мутация, изразени като характеристика на дължините на протеини (aa) за генни списъци, кодиращи протеини, които са били; 1- експериментално е установено, че няма (или има много малка) роля в вирулентността на гъбичките; 2-експериментално установено, че играе важна роля във вирулентността и; 3-предсказано, че кодира предполагаеми основни за живота гени чрез ортология към протеини, експериментално характеризирани в Aspergillus fumigatus. Символът звездичка (*) показва статистически значима разлика между нивата на мутация между посочените набори гени. Генните списъци и свързаните данни за полиморфизма са показани в Допълнителен файл 6: Таблица S4

Полезността на комбинирания предсказващ подход за разкриване на слабостта на патогена се подкрепя чрез изследвания на генетично допълване на мутант с пет "ядрени" делеция на ген

Z. tritici е податлив на препращане на генетични екрани, базирани на произволна интеграция на T-DNA чрез Agrobacterium-медиирана гъбична трансформация (AMT). Нашата предишна работа беше генерирала един Z. tritici T-DNA мутант по-специално, който не беше в състояние да причини пълно заболяване върху заразени листа от пшеница (фиг. 7A). Този мутант, наречен 23-21 (23-ти кръг на трансформация и 21-ва събрана колония), може да расте нормално като див тип върху богата на хранителни вещества агарна среда (YPD), но не успява да увеличи сравними нива на гъбични хифи, когато се отглежда върху лишена от хранителни вещества среда, включително воден агар (фиг. 7А). Използвахме повторно секвениране на 23-21 на базата на Illumina на целия геном, за да разкрием позицията на потенциално причиняващото вмъкване на Т-ДНК. Този анализ разкрива единична T-DNA интеграция между позиции 899878 и 912699 на хромозома 8, причинявайки делеция/разрушаване на пет предвидени кодиращи последователности (фиг. 7B). SNP и indel анализът не разкри допълнителни немаркирани мутации в щама 23-21 по отношение на дивия тип геномна последователност на IPO323. 23-21 T-ДНК делецията ефективно премахна пет гена, всички от които се намират в основния геном, и със следните функционални (Interpro) прогнози; ген 1=цитохром Р450; ген 2=S-аденозил метионин метилтрансфераза; ген 3=Цинк (2) С6 тип ДНК свързващ протеин; ген 4=Нуклеозид дифосфат киназа (NDK) и ген 5=Гликозил хидролаза 31 (Фиг. 7В). Изследвахме относителния брой високи и умерени мутации във всеки протеин като характеристика на дължината на протеина, което разкри, че протеин 4 (NDK) има много по-малко мутации, засягащи промените в аминокиселинната последователност, отколкото другите четири анализирани последователности в изолирания набор (фиг. 7C и допълнителен файл 2: Фиг. S4). След това изследвахме средната относителна експресия на всичките пет гена във всички тествани изолати. Той също така разкрива, че ген 4 (кодиращ NDK) е значително по-високо експресиран от всички други кандидати (Фиг. 7D и Допълнителен файл 2: Фиг. S5). По този начин ние предположихме, че загубата на най-малко полиморфния и най-експресиран ген, ген 4, NDK, е отговорен за загубата на вирулентност и свързания дефект в разширяването на хифните пламъци. За да тестваме това, трансформирахме всеки от петте кандидат-гена обратно поотделно в мутантен щам 23-21 Z. tritici, като всеки се задвижва от свой собствен ендогенен промотор. Множество трансформанти бяха получени от всеки и повторно тествани за вирулентност върху житни листа и способност за удължаване на нишковидни хифи върху воден агар. Това демонстрира, че повторното въвеждане само на гена NDK (ген 4) напълно възстановява както вирулентността, така и растежа на хифите до нива от див тип (Фиг. 7E и Допълнителен файл 2: Фиг. S6). Повторното въвеждане на всеки от другите четирима кандидати не е причинило никаква промяна във фенотипа от оригиналния мутантен щам 23-21 (Фиг. 7E). За да се гарантира, че всички повторно въведени гени са експресирани в техния съответен допълнен щам, RT-PCR беше направен на всеки от трансформантите и оригиналния 23-21 мутант. Това потвърди очакваната липса на всеки транскрипт в 23-21 мутанта и демонстрира правилна експресия на всеки целеви ген в допълнените изолати (фиг. 7F). Така, повторното въвеждане на единичен ген с най-малко полиморфизми на ниво популация от петте кандидати и най-висока относителна експресия, възстановява дефектните фенотипове в този патоген на пшеницата. Това експериментално наблюдение подкрепя полезността на комбинирането на пангеномика и транскриптомика за прогнозиране на гени, които са потенциално важни за ключови функционални характеристики на живота.

Фигура 7 Тестове за функционално допълване на непатогенен Z. tritici мутант с делеция на пет гена подкрепят комбинираното използване на получена от пангенома степен на мутация и анализ на нивото на експресия като предиктори за важни основни гени за начина на живот. Характеристики на растежа и инфекцията на Z. tritici случайно вмъкнат мутант на T-DNA "23-21". Щамът расте нормално върху богат на хранителни вещества агар, но е дефектен във филаментозния растеж върху беден на хранителни вещества агар и е силно компрометиран по отношение на болестотворната активност по листата на пшеницата. Скалите представляват 1 cm. B Повторно секвениране на целия геном на щам 23-21 разкрива медиирано от Т-ДНК делеция на 13 kb геномна област, разрушаваща или изтриваща пет прогнозирани гена от основния пангеном. C Показва средните събития на висока и умерена мутация за всеки ген (обозначен с 1-5) от пангенома спрямо дължината на кодирания протеин (aa)

Дискусия

Комбинираната пангеномика и транскриптомика могат да се използват като оръжия срещу бързо развиващите се патогени

Pangenomics analyses have been performed on other fungi and yeasts including Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans var. grubii, and Aspergillus fumigatus [10]. All four species are model organisms in eukaryotic genomics and the latter three can also cause human diseases. Recent pangenome analyses on each of these species revealed that > 80% of all genes detected were core and thus found in every strain [10]. Our current study, and those previously [27, 28], clearly highlight that Z. tritici has a larger (>40% от общите гени) допълнителен геном от тези видове. Защо и как Z. tritici и потенциално други патогенни за растенията гъби поддържат такъв голям допълнителен компонент не е ясно. Например най-малките осем хромозоми, идентифицирани в IPO323, нямат ясно изразено голямо въздействие върху вирулентността или други процеси, като само едно проучване в момента предполага, че хромозоми 14, 16, 18, 19 и 21 играят фина роля във вирулентността на избрани сортове пшеница [59]. Въпреки това, комбинациите от тези малки хромозоми се поддържат в популациите. Предполага се, че те осигуряват събития на рекомбинация, които могат да лежат в основата на способността на гъбичките да се развиват бързо, за да се адаптират към напреженията на околната среда, потенциално комбинирани с високи нива на активност на транспонируеми елементи [60–62]. Подобен случай може да се твърди за големия допълнителен геном. Подкрепа за това се осигурява от функционалното значение на два спомагателни компонента на генома, споменати в това проучване, SDH субединица С паралог и AvrStb6, като и двата имат ключова роля във взаимодействието с променливи елементи на външната среда (прилагане на фунгициди и сортове със съвпадение гени за устойчивост на болести, съответно) [25, 45]. Описани са други биологични процеси, които също могат да бъдат загубени в отделни изолати на Z. tritici без ясни дефекти на годност, включително контрол на меланизацията (пигментация) [63]. Нашето проучване подчерта, че спомагателният, бързо развиващ се геном на Z. tritici може потенциално да се използва срещу него, когато вместо това фокусът е поставен върху това, което не може да бъде загубено или има ограничен полиморфизъм. Това проучване се стреми да направи това, като разглежда основните гени като не само присъстващи и функционални във всички изолати, но и експресирани от всички изолати. Ние също възприехме подхода да се опитаме да класираме набори гени в основния геном, въз основа на нивата на променливост на аминокиселинната последователност. Разбира се, има някои предупреждения с методите, които сме използвали, особено в това, че излишните (идентичен тип и позиция) мутации не могат лесно да бъдат отделени от подобен брой мутации, които могат да се появят на уникални позиции във всеки изолат (нередундантни мутации). По този начин нашият метод не е подходящ за класиране на бързо развиващи се гени. Независимо от това, методът позволява гени без и ниска вариабилност да бъдат лесно идентифицирани въз основа на ниски нива на полиморфизми, засягащи аминокиселинните промени. Подходът показа, че експериментално проверените и предсказани жизненоважни гени или гени за вирулентност съдържат значително по-малко полиморфизъм от този тип между изолати, отколкото тези, чиито функции са необходими за тези процеси. И накрая, ние разширихме този подход, за да идентифицираме нова вирулентна функция на нуклеозид дифосфат киназа (NDK), която показва най-малко вариации от всички гени в 5-генна T-ДНК делеция. Въз основа на тези открития, ние предлагаме нивата на полиморфизъм в основните гени, идентифицирани в пангеномиката, да могат да се използват за извеждане на важни функции за кодираните протеини и по този начин да се даде приоритет на гените за функционален анализ, за ​​да се идентифицират нови цели за защита на културите и потенциално здравето на животните.

Появяваща се слабост в биологията на инфекцията на Z. tritici и сродни патогени?

Това проучване също така предоставя допълнителни специфични прозрения за биологията на инфекцията на този важен патоген на пшеницата. Първо, не са получени доказателства в подкрепа на наличието на големи некротрофични ефекторни активности за 88 секретирани протеини, избрани както от основния, така и от допълнителния геном. Не можем да отхвърлим възможността, че не сме избрали правилните протеини или че множество ефектори могат да работят заедно, за да предизвикат смърт на растителни клетки (също предложено от подобни профили на експресия). Ако случаят е последният, това би се различавало от ясното значение на единичните некротрофни ефектори в свързаните гъбички, заразяващи пшеницата, по-специално Parastagonospora nodorum и видовете Pyrenophora [35]. Възможно е също нивата на експресия, които извличаме от преходната FoMV система, да са по-ниски от тези, необходими за ефектори, чието разпознаване е по-слабо изразено от това на SnToxA. Независимо от това, данните, представени тук, не подкрепят идеята, че преходът към симптоматичен растеж и смъртта на растителните клетки се предизвиква от разпознаването на главни (единични) некротрофни Z. tritici ефектори. Следователно е възможно масовото производство на тези протеини при появата на симптомите да служи вместо това за защита на гъбичните хифи от очевидното хиперактивиране на клетъчната смърт и реакцията на растенията. В съответствие с това е доказано, че секретираните ефектори от тази и други гъбички имат способността да инхибират растителни протеази, хитинази и други ензими, атакуващи клетъчната стена, които сами по себе си са индуцирани от растенията по време на защитни реакции [46, 48, 64, 65 ]. Съвсем наскоро беше показано също, че гъбичните ефектори манипулират и ремоделират микро и микробиоми [66, 67].

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Идентифицирането на ключова роля във вирулентността за NDK обаче е важно. Тези протеини са приписани на множество функции от различни прокариотни и еукариотни организми. При гъбите има един доклад, който приписва роля на модулирането на растителния имунитет [68], докато при друг вид (A. fumigatus) е демонстрирана жизненоважна функция [69]. Въпреки това, основната и запазена функция на тези протеини е да фосфорилират нуклеозидни дифосфати, обикновено използвайки АТФ като субстрат, за генериране на други нуклеозидни трифосфати (NTP), необходими за подпомагане на захранването на различни клетъчни процеси [70, 71]. Това е особено важно, когато ограничените ресурси затрудняват генерирането на определени NTP с други средства. От друга страна, NDK представляват ключов спасителен път за регенериране на NTP, който е най-вероятно важен, когато извънклетъчните ресурси са ограничени. Важни роли за няколко други спасителни пътища, и по-специално биосинтетични пътища, наскоро се появиха от други изследвания на генната функция на Z. tritici. Например биосинтезата на лизин е от съществено значение за инфекцията и растежа на хифите върху бедни хранителни вещества [72], както и биосинтезата на пурин [73]. Тези функции са излишни за растеж на цял носител. Предишни транскриптомни данни за много ранния етап на колонизация на повърхността на листата показват, че гъбата е в среда с изчерпани хранителни вещества и зависи от използването на вътреклетъчни запаси [33]. Взети заедно с предишните функционални проучвания и ключовата роля, показана за NDK, става ясно, че Z. tritici е изключително уязвим към инхибиране на ключови биосинтетични и спасителни пътища, когато е на повърхността на листата по време на ранна колонизация и потенциално до индукция на смърт на растителни клетки около 7-10 дни по-късно. По този начин, нови продукти или стратегии за защита на културите могат да бъдат насочени към инхибиране на тези процеси, което може да представлява слабост в Z. tritici и потенциално за голямо разнообразие от други свързани гъби с подобни начини на инфекция.

Изводи

Това проучване предоставя първоначална подкрепа за комбинираното използване на пангеномика и транскриптомика за дефиниране на гени, които представляват основните и потенциално експлоатируеми слабости в бързо развиващите се патогени. Въпреки това, по принцип, подходите могат да се използват за приоритизиране на гени във всяка биологична система, където са налични множество геноми и транскриптоми. Очакваме, че тези подходи биха могли да ускорят откриването на основни биологични процеси в много различни биологични системи.

Препратки

1. Fisher MC, Hawkins NJ, Sanglard D, Gurr SJ. Световната поява на резистентност към противогъбични лекарства е предизвикателство за човешкото здраве и продоволствената сигурност. Наука. 2018;360. https://doi.org/10.1126/science.aap7999.

2. Fisher MC, Henk DA, Briggs CJ, Brownstein JS, Madoff LC, McCraw SL и др. Възникващи гъбични заплахи за здравето на животните, растенията и екосистемите. Природата. 2012;484. https://doi.org/10.1038/nature10947.

3. Лукас JA, Хокинс NJ, Fraaije BA. Развитието на резистентността към фунгициди. Adv Appl Microbiol. 2015;90. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2014.09.001.

4. Heitman J. Сексуално размножаване и еволюцията на микробните патогени. Curr Biol. 2006;16. https://doi.org/10.1016/j.cub.2006.07.064.

5. Dong S, Raffaele S, Kamoun S. Двускоростните геноми на нишковидните патогени: валс с растения. Curr Opin Genet Dev. 2015; 35: 57-65. https://doi.org/10.1016/J.GDE.2015.09.001.

6. Tettelin H, Masignani V, Cieslewicz MJ, Donati C, Medini D, Ward NL, et al. Геномен анализ на множество патогенни изолати на Streptococcus aga‑lactiae: последици за микробния „пангеном“. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102. https://doi.org/10.1073/pnas.0506758102.

7. Lefébure T, Stanhope MJ. Еволюция на сърцевината и пан-генома на стрептокок до кокус: положителна селекция, рекомбинация и състав на генома. Genome Biol. 2007;8. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-5-r71.

8. Tian CF, Zhou YJ, Zhang YM, Li QQ, Zhang YZ, Li DF и др. Сравнителната геномика на ризобия, нодулираща соя, предполага широко набиране на специфични за линията гени в адаптации. Proc Natl Acad Sci US A. 2012;109. https://doi.org/10.1073/pnas.1120436109.

9. Syme RA, Tan KC, Rybak K, Friesen TL, McDonald BA, Oliver RP и др. Сравнителен анализ на генома на Panparastagonospora - прогнозиране на ефектора и еволюция на генома. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy192.

10. McCarthy CGP, Fitzpatrick DA. Пангеномни анализи на моделни гъбични видове. Microb. Геномика. 2019;5. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000243.

11. Yang X, Li Y, Zang J, Li Y, Bie P, Lu Y и др. Анализ на пан-генома за идентифициране на основните гени и основните гени на Brucella spp. Mol Gen Genomics. 2016;291. https://doi.org/10.1007/s00438-015-1154-z.

12. Barber AE, Sae-Ong T, Kang K, Seelbinder B, Li J, Walther G, et al. Пангеномният анализ на Aspergillus‑lus fumigatus идентифицира генетични варианти, свързани с човешка инфекция. Nat Microbiol. 2021;6. https://doi.org/10.1038/ s41564-021-00993-x.

13. Zhang X, Liu B, Zou F, Shen D, Yin Z, Wang R, et al. Ресеквенирането на целия геном разкрива естествена вариация и адаптивна еволюция на Phytophthora sojae. Front Microbiol. 2019;10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019. 02792.

14. Torriani SFF, Melichar JPE, Mills C, Pain N, Sierotzki H, Courbot M. Zymoseptoria tritici: основна заплаха за производството на пшеница, интегрирани подходи за контрол. Гъбични Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.010.

15. Zhan J, Mundt CC, McDonald BA. Измерване на имиграцията и сексуалното размножаване в полеви популации на Mycosphaerella graminicola. Фитопатология. 1998;88. https://doi.org/10.1094/PHYTO.1998.88.12.1330.

16. Zhan J, Kema GHJ, Waalwijk C, McDonald BA. Разпределение на алелите от типа на чифтосване в патогена на пшеницата Mycosphaerella graminicola в пространствени мащаби от лезии до континенти. Гъбични Genet Biol. 2002;36. https://doi. org/10.1016/S1087-1845(02)00013-0.

17. Stukenbrock EH, Banke S, Javan-Nikkhah M, McDonald BA. Произход и опитомяване на гъбичния патоген на пшеницата Mycosphaerella graminicola чрез симпатично видообразуване. Mol Biol Evol. 2007;24. https://doi.org/10. 1016/S1087-1845(02)00013-0.

18. Linde CC, Zhan J, McDonald BA. Структура на популацията на Mycosphaerella graminicola: от лезии до континенти. Фитопатология. 2002;92. https://doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.9.946.

19. Croll D, McDonald BA. Генетичната основа на локалната адаптация за патогенни гъби в селскостопанските екосистеми. Mol Ecol. 2017;26. https://doi.org/ 10.1111/mec.13870.

20. Croll D, Lendenmann MH, Stewart E, McDonald BA. Въздействието на горещите точки на рекомбинация върху еволюцията на генома на гъбичен растителен патоген. Генетика. 2015;201. https://doi.org/10.1534/genetics.115.180968.

21. Dutta A, Croll D, McDonald BA, Barrett LG. Поддържане на вариации във вирулентността и репродукцията в популациите на селскостопански растителен патоген. Evol Appl. 2021;14. https://doi.org/10.1111/eva.13117.

22. Feurtey A, Stevens DM, Stephan W, Stukenbrock EH, Stajich J. Междуспецифичният генен обмен въвежда висока генетична променливост в патогена на културите. Genome Biol Evol. 2019;11. https://doi.org/10.1093/gbe/evz224.

23. Hartmann FE, Sánchez-Vallet A, McDonald BA, Croll D. Гъбичен пшеничен патоген е развил специализация на гостоприемника чрез екстензивни хромозомни пренареждания. ISME J. 2017; 11. https://doi.org/10.1038/ismej.2016.196.

24. Fouché S, Plissonneau C, McDonald BA, Croll D. Мейозата води до широко разпространена вариация на броя на копията и изкривено наследяване на спомагателни хромозоми на патогена на пшеницата Zymoseptoria tritici. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy100.

25. Stephens C, Ölmez F, Blyth H, McDonald M, Bansal A, Burcu Turgay E, et al. Забележителни скорошни промени в генетичното разнообразие на гена за авирулентност AvrStb6 в глобалните популации на патогена на пшеницата Zymoseptoria tritici. Mol Plant Pathol. 2021. https://doi.org/10.1111/mpp.13101.

26. Goodwin SB, M'Barek S, Dhillon B, Wittenberg AHJ, Crane CF, Hane JK и др. Завършеният геном на гъбичния патоген на пшеницата Mycosphaerella graminicola разкрива структура на дозиране, хромозомна пластичност и стелт патогенеза. PLoS Genet. 2011;7. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002070.

27. Badet T, Oggenfuss U, Abraham L, McDonald BA, Croll D. 19-изолиран глобален пангеном с референтно качество за гъбичния патоген на пшеницата Zymoseptoria tritici. BMC Biol. 2020;18. https://doi.org/10.1186/ s12915-020-0744-3.

28. Plissonneau C, Hartmann FE, Croll D. Пангеномни анализи на житния патоген Zymoseptoria tritici разкриват структурната основа на силно пластичен еукариотен геном. BMC Biol. 2018;16. https://doi.org/10.1186/ s12915-017-0457-4.

29. Wittenberg AHJ, van der Lee TAJ, M'Barek SB, Ware SB, Goodwin SB, Kilian A, et al. Мейозата води до изключителна пластичност на генома в хаплоидния гъбичен растителен патоген Mycosphaerella graminicola. PLoS One. 2009;4. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005863.

30. Steinberg G. Клетъчна биология на Zymoseptoria tritici: патогенна клетъчна организация и инфекция на пшеница. Гъбични Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.002.

31. Kema GHJ, Yu DZ, Rijkenberg FHJ, Shaw MW, Baayen RP. Хистология на патогенезата на Mycosphaerella graminicola в пшеница. Фитопатология. 1996; 86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-777.

32. Rudd JJ, Kanyuka K, Hassani-Pak K, Derbyshire M, Andongabo A, Devon-Shire J, et al. Транскриптомно и метаболитно профилиране на инфекциозния цикъл на Zymoseptoria tritici върху пшеница разкрива двуфазно взаимодействие с растителния имунитет, включващо диференциални патогенни хромозомни приноси и вариация на дефиницията на хемибиотрофния начин на живот. Физиология на растенията. 2015;167. https://doi.org/10.1104/pp.114.255927.

33. Keon J, Antoniw J, Carzaniga R, Deller S, Ward JL, Baker JM и др. Транскрипционна адаптация на Mycosphaerella graminicola към програмирана клетъчна смърт (PCD) на неговия чувствителен пшеничен гостоприемник. Mol взаимодействие между растения и микроби. 2007;20. https://doi.org/10.1094/MPMI-20-2-0178.

34. Rudd JJ, Keon J, Hammond-Kosack KE. Пшеничните митоген-активирани протеин кинази TaMPK3 и TaMPK6 се регулират различно на множество нива по време на съвместими взаимодействия на болестта с Mycosphaerella graminicola. Физиология на растенията. 2008;147. https://doi.org/10.1104/pp.108. 119511.

35. Friesen TL, Faris JD. Характеризирането на взаимодействията ефектор-мишена в некротрофните патосистеми разкрива тенденции и вариации в манипулацията на гостоприемника. Annu Rev Phytopathol. 2021;59. https://doi.org/10.1146/annur ev-phyto-120320-012807.

36. Friesen TL, Faris JD, Соломон PS, Oliver RP. Специфични за гостоприемника токсини: ефектори на некротрофна патогенност. Cell Microbiol. 2008;10. https://doi.org/10. 1111/j.1462-5822.2008.01153.x.

37. Ben M'Barek S, Cordewener JHG, Tabib Ghafary SM, van der Lee TAJ, Liu Z, Mirzadi Gohari A, et al. FPLC и масспектрометрия с течна хроматография идентифицират кандидат-некроза-индуциращи протеини от филтрати на културата на гъбичния пшеничен патоген Zymoseptoria tritici. Гъбични Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2015.03.015.

38. Wyka S, Mondo S, Liu M, Nalam V, Broders K. Големият допълнителен геном и високите нива на рекомбинация могат да повлияят на глобалното разпространение и широката гама гостоприемници на гъбичния растителен патоген Claviceps purpurea. PLoS One. 2022;17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.

39. Moolhuijzen PM, Вижте PT, Shi G, Powell HR, Cockram J, Jørgensen LN, et al. Глобален пангеном за гъбичния патоген на пшеницата Pyrenophora triticirepentis и прогнозиране на структурна хомология на ефекторния протеин. Microb. Геномика. 2022;8. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.

40. Kema GHJ, Sayoud R, Annone JG, Van Silfhout CH. Генетична вариация за вирулентност и резистентност в пътната система II на пшеница-Mycosphaerella graminicola. Анализ на взаимодействията между изолати на патогени и сортове гостоприемници. Фитопатология. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-213.

41. Kema GHJ, Annone JG, Sayoud R, Van Silfhout CH, Van Ginkel M, De Bree J. Генетична вариация за вирулентност и резистентност в патосистемата на пшеницата Mycosphaerella graminicola I. взаимодействия между изолати на патогени и сортове гостоприемници. Фитопатология. 1996; 86. https://doi.org/ 10.1094/Phyto-86-200.

42. Zhan J, Pettway RE, McDonald BA. Глобалната генетична структура на патогена на пшеницата Mycosphaerella graminicola се характеризира с високо ядрено разнообразие, ниско митохондриално разнообразие, редовна рекомбинация и генен поток. Гъбични Genet Biol. 2003;38. https://doi.org/10.1016/S1087- 1845(02)00538-8.

43. Palma-Guerrero J, Torriani SFF, Zala M, Carter D, Courbot M, Rudd JJ и др. Сравнителни транскриптомни анализи на щамове на Zymoseptoria tritici показват сложни преходи в начина на живот и вътрешноспецифична вариабилност в профилите на транскрипция. Mol. Растителен патол. 2016;17. https://doi.org/10.1111/mpp.12333.

44. Kellner R, Bhattacharyya A, Poppe S, Hsu TY, Brem RB, Stukenbrock EH. Профилирането на експресията на патогена на пшеницата Zymoseptoria tritici разкрива геномни модели на транскрипция и специфични за гостоприемника регулаторни програми. Genome Biol Evol. 2014;6. https://doi.org/10.1093/gbe/evu101.

45. Steinhauer D, Salat M, Frey R, Mosbach A, Luksch T, Balmer D, et al. Необходим паралог на субединица C на сукцинат дехидрогеназа медиира постоянна резистентност към подклас SDHI фунгициди в Zymoseptoria tritici. PLoS Pathog. 2019;15. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1007780.

46. ​​Marshall R, Kombrink A, Motteram J, Loza-Reyes E, Lucas J, Hammond Kosack KE, et al. Анализът на два растително-експресирани LysM ефекторни хомолози от гъбата Mycosphaerella graminicola разкрива нови функционални свойства и различни приноси към вирулентността при пшеницата. Физиология на растенията. 2011;156. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.

47. Lee WS, Rudd JJ, Hammond-Kosack KE, Kanyuka K. Mycosphaerella graminicola списък с ефектор-медиирана стелт патогенеза подкопава разпознаването чрез cerk1 и cebip хомолози в пшеницата. Mol взаимодействие между растения и микроби. 2014;27. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.

48. Tian H, MacKenzie CI, Rodriguez-Moreno L, van den Berg GCM, Chen H, Rudd JJ и др. Три LysM ефектора на Zymoseptoria tritici колективно обезоръжават имунитета на растенията, предизвикан от хитин. Mol Plant Pathol. 2021;22. https:// doi.org/10.1104/pp.111.176347.

49. Zhong Z, Marcel TC, Hartmann FE, Ma X, Plissonneau C, Zala M, et al. Малък секретиран протеин в Zymoseptoria tritici е отговорен за авирулентността на сортовете пшеница, носещи гена за устойчивост на Stb6. Нов фитол. 2017;214. https://doi.org/10.1111/nph.14434.

50. Kema GHJ, Mirzadi Gohari A, Aouini L, Gibriel HAY, Ware SB, Van Den Bosch F, et al. Стресът и сексуалното размножаване влияят върху динамиката на топлинния патогенен ефектор AvrStb6 и резистентността към стробилурин. Нат Генет. 2018;50. https://doi.org/10.1111/nph.14434.

51. Saintenac C, Lee WS, Cambon F, Rudd JJ, King RC, Marande W, et al. Протеин Stb6, подобен на рецептор-киназа на пшеница, контролира ген-за-ген резистентност към гъбичен патоген Zymoseptoria tritici. Нат Генет. 2018;50. https://doi.org/ 10.1038/s41588-018-0051-x.

52. Тан KC, Оливър RP, Соломон PS, Mofat CS. Протеинови некротрофни ефектори при гъбична вирулентност. Funct Plant Biol. 2010;37. https://doi.org/10. 1071/FP10067.

53. Bouton C, King RC, Chen H, Azhakanandam K, Bieri S, Hammond-Kosack KE, et al. Мозаечен вирус на лисича опашка: вирусен вектор за експресия на протеини в зърнени култури. Физиология на растенията. 2018;177. https://doi.org/10.1104/pp.17.01679.

54. Motteram J, Küfner I, Deller S, Brunner F, Hammond-Kosack KE, Nürnberger T, et al. Молекулярна характеристика и функционален анализ на MgNLP, единственият протеин, съдържащ домейн NPP1, от гъбичния патоген на листата на пшеницата mycosphaerella graminicola. Mol взаимодействие между растения и микроби. 2009;22. https://doi.org/10.1094/MPMI-22-7-0790.

55. Faris JD, Zhang Z, Lu H, Lu S, Reddy L, Cloutier S, et al. Уникален ген, подобен на устойчивост на болести по пшеницата, управлява предизвиканата от ефектор чувствителност към некротрофни патогени. Proc Natl Acad Sci US A. 2010;107. https://doi. org/10.1094/MPMI-22-7-0790.

56. Lu Y, Deng J, Rhodes JC, Lu H, Lu LJ. Прогнозиране на основни гени за идентифициране на потенциални лекарствени цели в Aspergillus fumigatus. Comput Biol Chem. 2014;50. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2014.01.011.

57. Osmani AH, Oakley BR, Osmani SA. Идентифициране и анализ на основни гени на Aspergillus nidulans с помощта на техниката за спасяване на хетерокарион. Nat Protoc. 2006;1. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.406.

58. Hu W, Sillaots S, Lemieux S, Davison J, Kaufman S, Breton A, et al. Основна генна идентификация и приоритизиране на лекарствената цел в Aspergillus fumigatus. PLoS Pathog. 2007;3. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 0030024.

59. Habig M, Quade J, Stukenbrock EH. Предният генетичен подход разкрива зависимо от генотипа на гостоприемника значение на допълнителните хромозоми в гъбичния патоген на пшеницата Zymoseptoria tritici. MBio. 2017;8. https://doi. org/10.1128/mBio.01919-17.

60. Fouché S, Badet T, Oggenfuss U, Plissonneau C, Francisco CS, Croll D. Стрес-управлявана динамика на де-репресия на преносими елементи и еволюция на вирулентност в гъбичен патоген. Mol Biol Evol. 2020;37. https://doi. org/10.1093/molbev/msz216.

61. Möller M, Habig M, Freitag M, Stukenbrock EH. Изключителна нестабилност на генома и широко разпространени хромозомни пренареждания по време на вегетативен растеж. Генетика. 2018;210. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301050.

62. Bertazzoni S, Williams AH, Jones DA, Syme RA, Tan KC, Hane JK. Аксесоарите правят облеклото: допълнителни хромозоми и други незаменими ДНК региони в растително-патогенни гъби. Mol взаимодействие между растения и микроби. 2018;31. https://doi.org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.

63. Krishnan P, Meile L, Plissonneau C, Ma X, Hartmann FE, Croll D, et al. Вмъкванията на преносими елементи оформят генната регулация и производството на меланин в гъбичен патоген на пшеница. BMC Biol. 2018;16. https://doi. org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.

64. Sánchez-Vallet A, Tian H, Rodriguez-Moreno L, Valkenburg DJ, Saleem Batcha R, Wawra S, et al. Секретиран LysM ефектор защитава гъбичните хифи чрез хитин-зависима хомодимерна полимеризация. PLoS Pathog. 2020;16. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008652.

65. Breen S, Williams SJ, Winterberg B, Kobe B, Solomon PS. Пшеничните PR-1 протеини са насочени към некротрофни патогенни ефекторни протеини. Растение J. 2016; 88. https://doi.org/10.1111/tpj.13228.

66. Snelders NC, Petti GC, van den Berg GCM, Seidl MF, Thomma BPHJ. Древен антимикробен протеин, кооптиран от гъбичен растителен патоген за манипулиране на микобиома на растенията. Proc Natl Acad Sci US A. 2021; 118. https://doi.org/10.1073/pnas.2110968118.

67. Snelders NC, Rovenich H, Petti GC, Rocafort M, van den Berg GCM, Vorholt JA, et al. Манипулиране на микробиома от пренасян от почвата гъбичен растителен патоген, използващ ефекторни протеини. Nat растения. 2020 г. https://doi.org/10. 1038/s41477-020-00799-5.

68. Rocha RO, Wilson RA. Нуклеозид дифосфат киназата на Magnaporthe oryzae е необходима за метаболитна хомеостаза и редокс-медиирано потискане на вродения имунитет на гостоприемника. Mol Microbiol. 2020;114. https://doi.org/ 10.1111/mmi.14580