Комбинирането на адоптивна инфузия на NK клетки с допамин-освобождаващ пептид намалява стареещите клетки при възрастни мишки

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

ВЪВЕДЕНИЕ

Стареенето е един от основните рискови фактори за много заболявания [1] и разработването на методи за намеса в стареенето значително ще намали риска от редица свързани с възрастта заболявания като сърдечно-съдови и мозъчно-съдови заболявания [2, 3], рак [4] и болестта на Алцхаймер [5]. Стареещите клетки (SNCs) постепенно се натрупват в тъканите по време на процеса на стареене и се считат за основна причина за заболявания, свързани с възрастта [6-8]. Доказано е, че премахването на SNCs в миши модели предотвратява или забавя тъканната дисфункция и удължава продължителността на живота [9, 10]. Обратно, трансплантирането на малки количества SNCs причинява физиологична дисфункция при млади мишки [1]. Тези проучвания отвориха врати за разработването на методи, които са насочени към премахването на SNCs за подобряване на свързаните с възрастта хронични заболявания.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Насоченото изчистване на SNCs, наречено "сенолитици", е първата химиотерапия, успешно тествана в предклиничен in vivo модел, и в момента съществуват няколко сенолитични агента [12]. Много от тези лекарства са насочени към регулирани нагоре антиапоптотични пътища в SNC за селективно изчистване на определени видове SNC и са показали потенциал за удължаване на продължителността на живота и подобряване на функциите на тялото [13, 14].Екстракт от цистанче против радиацияВъпреки успешното обръщане на свързаната с възрастта патология при животински модели, може да има някои пречки пред използването на сенолитични лекарства при хора поради хетерогенността на SNC и високия риск от токсичност [15]. Следователно трябва да се проучи алтернативен метод, който може безопасно да елиминира широк спектър от SNC при хора.

SNP могат да бъдат разпознати и отстранени от имунната система [16]. Предишни проучвания показват, че SNCs активират естествени клетки убийци (NK) чрез регулиране нагоре на основния хистосъвместим клас I верига, свързан с протеин А и В активиращ лиганд [17]. Въпреки това, с увеличаване на възрастта, ефективността на имунната система намалява, което може да доведе до имунно бягство на SNC [18]. Методи за преодоляване на имунното бягство, причинено от намалена имунна функция, са изследвани в терапията на рак [19]. Наскоро беше постигнат напредък в адаптивното прехвърляне на NK клетки за елиминиране на тумори, което показа известна ефикасност [20]; по този начин беше разумно да се предположи, че адоптивната инфузия на NK клетки може да доведе до цитотоксичност в SNC.

Нервната и имунната система са двете най-важни адаптивни системи на тялото. Няколко проучвания показват, че допаминът (DA) като имунен регулатор е ключ към невроимунната комуникация [21]. DA изпълнява своите биологични функции чрез взаимодействие и активиране на допаминови рецептори (DR), които са разделени на 2 подгрупи, D1-подобни (D1 и D5) и D2-подобни (D2, D3, и D4). По отношение на техните различни функции, ангажирането на D1-like DR стимулира производството на cAMP, докато ангажирането на D2-like DR инхибира производството на cAMP [22]. Предишни проучвания показват, че D1-подобна DR стимулация повишава цитотоксичността на NK клетките както in vitro [23], така и in vivo [24]. Нивата на DA обаче спадат с нарастването на човешката възраст [25]. По този начин предположихме, че допаминергичните лекарства могат да подобрят цитотоксичността на адоптивната инфузия на NK клетки.

Cistanche може да спре стареенето

Тук предлагаме използването на нонапептида Acein, който взаимодейства с ангиотензин-конвертиращ ензим (ACE I), за да индуцира секреция на DA [26], в комбинация със системна NK клетъчна терапия за елиминиране на SNC. Резултатите in vitro показват, че NK клетките премахват SNCs, независимо от индукторите на стареене и клетъчните типове.цистанче билкаВ модел на стареене на мишка, NK клетъчната терапия в комбинация с Acein значително намалява броя на свързаните със стареенето -галактозидаза (SA- -gal)-позитивни клетки в множество тъкани, намалява експресията на свързаните със стареенето гени в основните органи и облекчени секреторни фенотипове (SSPs), свързани със стареенето. Резултатите от това проучване дават представа за възможното възстановяване на имунното наблюдение на хронични SNC, използвайки NK клетъчна терапия в комбинация с Ace.

РЕЗУЛТАТИ

Адоптивната инфузия на NK клетки намалява стареещите CD3 плюс Т клетки в периферната кръв

Двадесет и шест доброволци, които са получили инфузия на NK клетки, са наети за проучването. Характеристиките и свойствата на NK клетките на доброволците са представени в таблица 1. Времевият интервал за събиране на кръв след трансфузия на NK клетки е около 37 (25-57) дни. Пропорцията (Фигура 1А) и абсолютният брой (Фигура 1В) на NK клетките в периферната кръв са обратно пропорционални на възрастта на доброволците. Изненадващо, чистотата на NK клетъчния продукт, повторно влят във всеки индивид, също е обратно пропорционална на възрастта на доброволците (Фигура 1C).растеж на пениса cistancheТова може да се дължи на постепенно намаляващия брой на NK клетките с нарастване на възрастта. За да се отрази анти-стареещият ефект от администрирането на NK клетки, множество маркери за стареене в CD3 плюс Т клетки на периферната кръв, които до голяма степен отразяват свързания с възрастта фенотип на тялото [27], бяха открити преди и след инфузия на NK клетки. В сравнение с маркерите за стареене и SASP фактора на CD3 плюс Т клетките в периферната кръв преди и след автоложна NK клетъчна инфузия, делът на SA- -gal-позитивните Т клетки беше значително намален след инфузия (Фигура 1D). Нивата на mRNA на P16, P21 и инхибитора на плазминогенния активатор 1 (Pai1) бяха значително намалени, докато промените в нивата на mRNA на моноцитния хемоатрактантен протеин-1 (MCP-1) и IL-6 не са значими (фиг. 1E). Няма значима разлика в биохимичните индекси (допълнителна таблица 1) в периферната кръв.

Човешките NK клетки намаляват маркерите за стареене на мастната тъкан и секрецията на провъзпалителни цитокини

Мастната тъкан беше събрана от трима затлъстели индивида, тъй като затлъстяването има тенденция да причинява натрупване на SNC [28]. В допълнение, мастната тъкан се култивира в кондиционирана среда от SNCs за по-нататъшно индуциране на стареене на мастната тъкан. Мастната тъкан, култивирана в кондиционирана среда от не-SNC, се счита за контрола. Експресията на перфорин (Фигура 2А) и CD69 (Фигура 2В) в NK клетките се регулира значително след ко-инкубиране със старееща мастна тъкан в сравнение с ко-инкубиране с контролна мастна тъкан. Експресията на стареещи маркери p16 и p21 в

стареещата мастна тъкан е значително намалена след лечение с NK клетки (фиг. 2C, допълнителна фигура 1A, B). Открихме също, че ключовият компонент на SASP в кондиционираната среда след съвместна инкубация с NK клетки в стареещата група е значително намален (Фиг. 2D). Тези резултати предполагат, че NK клетките могат да елиминират SNC от мастната тъкан и да намалят SASP фенотипа.

Миши NK клетки могат да се активират срещу SNC и да упражняват цитотоксичност

Първо индуцирахме стареенето на миши мастни прогениторни клетки чрез облъчване или адриамицин, както беше описано по-рано [29]. За да се определи дали NK клетките са специфично активирани от SNCs, необлъчени контролни клетки или облъчени SNCs се инкубират съвместно с NK клетки за 24 часа. Проточната цитометрия показа, че нивата на експресия на CD69 (Фигура 3A) и IFN-y (Фигура 3B) в NK клетките са значително повишени в прицелните клетки на SNC в сравнение с контролните прицелни клетки. Междувременно, след съвместна инкубация с NK клетки, апоптотичното ниво на SNCs беше значително по-високо от това на контролните клетки (Фигура 3C). След това открихме експресията на NK клетъчно активиращи и инхибиторни лиганди в SNCs. Резултатите от qPCR показват, че нивото на експресия на активиращи лиганди в NK клетките е значително повишено в сравнение с контролните клетки, а нивото на експресия на някои инхибиторни лиганди, като бета 2 микроглобулин (2m), е понижено в сравнение с контролните клетки (Фиг. .3D). Ние също така изследвахме способността на NK клетките да елиминират SNC in vivo.ползи от цистанче салсаDiR-белязани контролни клетки и DiR-белязани SNCs бяха трансплантирани в коремната кухина на мишки и NK клетки бяха администрирани през опашната вена. Резултатите от in vivo изображения показват, че интензитетът на флуоресценция при мишки, трансплантирани със SNC след третиране с NK клетки, е значително по-слаб от този при мишки, трансплантирани с контролни клетки (Фиг. 3E). Това показва, че способността на NK клетките да убиват SNC е значително по-висока от тази на SNC in vivo. След това определихме дали цитотоксичността на NK клетките срещу SNC е дозозависима и клетъчно-специфична. В същото време ние също използвахме индуцирано от доксорубицин стареене, за да определим дали цитотоксичността на NK клетки срещу SNCs е ограничена до радиационна индукция. Резултатите показват, че NK клетките имат значителна цитотоксична активност срещу SNC по дозозависим начин, но малка цитотоксичност срещу контролните клетки. Различните методи за стимулиране на стареенето нямат ефект върху способността на NK клетките да убиват SNCs (фиг. 3F). Тези резултати предполагат, че NK клетките могат да бъдат специфично активирани от SNCs и да произведат значителна цитотоксичност срещу SNCs in vitro и in vivo.

DA повишава цитотоксичността на миши NK клетки срещу SNC чрез D1-подобни рецептори

С оглед на важната невроимунна комуникационна функция на DA [30], ние оценихме дали DA може да подобри цитотоксичността на миши NK клетки срещу SNC. NK клетките се инкубират съвместно с индуцирани от радиация SNCs и към средата се добавят различни концентрации на DA. Резултатите показват, че DA може да повиши цитотоксичността на NK клетките срещу SNCs (фиг. 4A, B). За да се характеризира сигнализиращият път, чрез който DA усилва ефекта на убиване на NK клетките върху SNCs, бяха оценени промените в експресията на DR, съдържанието на cAMP и фосфорилирането на елемент-свързващ протеин (CREB) на cAMP в NK клетките. В NK клетки, инкубирани съвместно със SNC заедно с DA, съдържанието на cAMP (Фиг. 4C) и нивото на фосфорилиране на CREB (Фиг. 4D, Допълнителна Фигура 2A) са значително повишени в сравнение с NK клетки и SNC съвместна инкубация без DA. За да се изясни защо DA повишава активността на убиване на NK клетки срещу SNCs, ние сравнихме промените на DR върху NK клетки, след като NK клетките бяха съвместно инкубирани със SNCs или контролни клетки. Резултатите показват, че нивото на експресия на D1 и D5 DR е значително повишено, след като NK клетките са били съвместно инкубирани със SNCs в сравнение с контролните клетки (Фигура 4E). След това, DA и D{15}}подобни рецепторни антагонисти или D2-подобни

рецепторни антагонисти бяха добавени заедно в ко-инкубационната система на NK клетки и SNCs. В сравнение с добавянето само на DA, нивото на апоптоза на SNCs беше намалено при добавянето на DA плюс SCH-23300(D1-подобен рецепторен антагонист) (Фигура 4F, G). Междувременно, съдържанието на cAMP (Фигура 4Н) и нивото на фосфорилиране на CREB (Фигура 4l, Допълнителна Фигура 2В) в NK клетките бяха регулирани надолу. Обратно, добавянето на DA плюс халоперидол (D2 рецепторен антагонист) не променя значително нивото на апоптоза на SNCs, съдържанието на cAMP и фосфорилирането на CREB в NK клетки, в сравнение с добавянето само на DA. Тези резултати показват, че DA засилва активността на убиване на миши NK клетки срещу SNCs чрез D1-like Drs.

Ace, комбиниран с миши NK клетки, значително подобрява клирънса на SNC in vivo

Предишно проучване показа, че допаминът намалява с възрастта при хората [22]. Първо измерихме периферното ниво на допамин при млади и стари мишки. Резултатите показват, че плазмените нива на допамин на старите мишки са по-ниски от тези на младите мишки (фиг. 5А). След това периферното освобождаване на допамин след интраперитонеално инжектиране на Acein е изследвано при стари мишки. Открихме, че плазмените нива на допамин се повишават значително след инжектиране на 10 mg/kg Acein (Фигура 5B, Допълнителна Фигура 3). С оглед на това, ние извършихме миши NK клетки, комбинирани с Acein за лечение на възрастни мишки. Открихме статуса на NK клетките в периферната кръв на мишки след лечение и открихме, че броят на NK клетките в периферната кръв при инфузия на NK клетки самостоятелно или NK клетки, комбинирани с Acein, е значително по-висок от този на групата, лекувана с Ace и PBS група, докато броят на NK клетките не се различава значително между групата, третирана с NK клетки, и NK клетките, комбинирани с групата, третирана с Acein (Фиг. 5C, D).cistanche tubulosa дозировка redditПо-нататъшното откриване на нивото на активиране на NK клетките показа, че нивото на експресия на CD69 в NK клетките на периферната кръв в комбинирано третираната група е значително повишено в сравнение с групата, третирана с NK клетки (Фигура 5E). След това оценихме SNCs в тъканта. Установихме, че инфузия на NK клетки самостоятелно намалява експресията на някои стареещи маркери в сравнение с групата на PBS и групата, лекувана с Acein, докато инфузията на NK клетки, комбинирани с Acein, значително намалява SA- -gal-позитивните клетки (фиг. 5F). ), както и нивата на експресия на P16 и P21 (фиг. 5G, допълнителна фигура 4A, B) в мастната тъкан, в сравнение с лечението само на NK клетки. Броят на Ki67BrdU клетките в мастната тъкан също беше значително увеличен (фиг. 5H), което допълнително доказва, че съдържанието на SNCs в мастната тъкан е по-ниско в комбинирано лекуваната група. SA- -gal оцветяването на черния дроб, белите дробове, бъбреците и мастните участъци също показва най-ниското ниво на SNC в комбинирано третираната група (допълнителна фигура 5A-D). Тези резултати показват, че NK клетките, комбинирани с терапия с Acein, повишават нивото на активиране на NK клетките при мишки и причиняват значително елиминиране на SNC in vivo.

Ace, комбиниран с NK клетки, намалява свързаните с възрастта фенотипове при възрастни мишки

За по-нататъшно потвърждаване на свързаните с възрастта фенотипове при мишки, черния дроб, белите дробове, бъбреците, мазнините и очните тъкани бяха събрани за откриване на различни стареещи маркери, включително P16, P21 и SASP фактори. Тези проби са избрани, защото е по-вероятно тези тъкани да претърпят стареене с възрастта [31]. Във всяка тъкан, само след инфузия на NK клетки, нивата на mRNA на P16, P21 и SASP факторите бяха значително по-ниски от тези в контролната група, докато нивата на маркерите за стареене в черния дроб, мазнините и тъканите на Eve в комбинирано лекуваните групата е допълнително намалена в сравнение с групата, лекувана само с инфузия на NK клетки (фиг. 6А). По подобен начин, ние също открихме основния SASP фактор в серума на мишки и резултатите бяха в съответствие с резултатите в тъканите (Фигура 6B). В допълнение, ние също изследвахме нивата на NAD в черния дроб и мастната тъкан, които са свързани със стареенето [32]. Ние открихме, че инфузия на NK клетки самостоятелно или в комбинирана терапия значително повишава съдържанието на NAD в черния дроб и мастната тъкан, като нивото на подобрение е значително по-високо в групата с комбинирана терапия (фиг. 6C). Някои серумни биохимични индекси, включително ALT, AST, CREA, UA, CHOL и BUN, са свързани с нивата на стареене [33]. Установихме, че само UA е значително намален в серума на мишки в комбинирано лекуваната група, докато другите ключови биохимични индекси не са

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ Инфузия на човешки NK клетки

Автоложна NK клетъчна инфузия беше извършена от раковата болница Mengchao в Шанхай (Шанхай, Китай) и всички протоколи бяха одобрени от техния комитет по етика (№ 05,2020, Комитет по медицинска етика на болницата за ракови заболявания Mengchao в Шанхай). Всички доброволци предоставиха подписано информирано съгласие за получаване на периферна кръв. Накратко, 50 mL периферна кръв се екстрахират от всеки индивид, след което се изолират мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMCs) и се прехвърлят в колба T75 с ExCellerate" Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems, USA), съдържаща 1×Cloudz CD2/NKp46 , рекомбинантен човешки IL-2(27ng/mL), рекомбинантен човешки L-12 (10 ng/mL), рекомбинантен човешки IL-18 (10 ng/mL и рекомбинантен човешки L{{ 13}}(10 ng/mL) (R&D Systems, САЩ) за 48 часа и след това се заменя с активирана среда (270 ng/mL рекомбинантен човешки IL-2, 20 ng/mL рекомбинантен човешки IL-12 , 20 ng/mL рекомбинантен човешки IL-18 и 20 ng/mL рекомбинантен човешки IL-21) за по-нататъшна култура. Клетъчната плътност се поддържа при 1 × 10 градуса клетки/mL. На 28-ия ден от културата , малък брой автоложни NK клетки бяха събрани за качествен контрол и интравенозно реинжектирани заедно с автоложни NK клетки при плътност от 4,15×10 градуса (3.76-5.87×10) клетки, с време на инфузия от 30 минути Експерименталният процес беше проведен в съгласие nce с добрата клинична практика. Интервалът от време за второто вземане на кръв беше около 37 (25-57) дни.

Изолиране на човешки периферни кръвни Т клетки и NK клетки Беше получена прясна кръв от здрави доброволци след информирано съгласие и протоколът беше одобрен от институционалния съвет за преглед на Китайския фармацевтичен университет (Номер на разрешение: SYXK2016-0011). Lymphoprep (STEMCELL Technologies, Канада) беше използван за изолиране на човешки PBMC. Човешки CD3 плюс Т клетки бяха получени от PBMC с помощта на магнитни зърна за сортиране на човешки CD3 Т-клетки (Miltenyi Biotec, Германия) в съответствие с протокола на производителя. NK клетките бяха изолирани от периферна кръв с помощта на RosetteSep" Human NK Cell Enrichment Cocktail (STEMCELL Technologies) съгласно протокола на производителя

Разделяне и разширяване на миши NK клетки in vitro

NK клетки от далака на мишка се изолират с помощта на комплект за изолиране на NK клетки (Miltenyi Biotec) съгласно инструкциите на производителя. Накратко, получени са миши далаци, клетки от далак са филтрирани с помощта на 70 μm клетъчен филтър и лимфоцити от далак са получени чрез центрофугиране с градиент на плътност, използвайки комплект за разделяне на лимфоцити от далака на мишка (Solarbio, Китай). Лимфоцитите от далака се събират, за да се получат NK клетки с висока чистота, като се използват магнитни перли за отделяне на миши NK клетки. Изолираните далачни NK клетки се култивират в поддържаща среда RPMI-1640, допълнена с 10 процента фетален говежди серум (FBS), 1 процент L-глутамин, 1 процент пеницилин/стрептомицин, 1 процент минимална есенциална среда (MEM) не- есенциална аминокиселина, 1% натриева пируватна киселина и 50 uM меркаптоетанол (всички от Life Technologies, САЩ). В допълнение, към среден. След това бяха събрани 10 градуса NK клетки и 10 градуса облъчени лимфоцити от далака и 5 mL среда за амплификация (поддържаща среда, допълнена с 1000 IU/mL rlL-2, 10ng/mL ml-15 и 30ng/mL анти -NKp46 антитяло (PA5-46986, Invitrogen, САЩ)).

Фигура 3 SNCs активират NK клетки и са били убити от NK клетки. Проточна цитометрия за откриване на експресията на (A) CD69 и (B) IFN-y се извършва след 24 h съвместна инкубация с миши NK клетки и преадипоцити или индуцирани от облъчване преадипоцити. n =3. Данните са представени като средна стойност ± SD. Разликите бяха оценени чрез двустранен несдвоен непараметричен t-тест. **P<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

Екстракция на преадипоцити и мускулни сателитни клетки

Преадипоцитите се екстрахират, както е описано по-горе [11]. Накратко, човешка или миша мазнина се отстранява при стерилни условия и се нарязва на 1-2 mm парчета, промива се два пъти с PBS и се усвоява с колагеназа ll （Solarbio） при 37 градуса за 1 час. След това клетките се филтруват с 100 μm клетъчен филтър, центрофугират се при 300 g за 5 минути и се събират. Прилепналите клетки се култивират в a-MEM, допълнен с 20 процента FBS за 12 часа и се усвояват с трипсин за събиране на прилепнали клетки. Мускулните сателитни клетки бяха изолирани, както е описано по-горе [34]. Квадрицепсният мускул се нарязва на 1-2 mm парчета и се добавят 5 mL колагеназа II за смилане при 37 градуса С за 12 минути. Сместа се смесва с пипета и се добавят 5 ml пълна среда след допълнително смилане в продължение на 12 минути. Клетките се филтруват с помощта на 70 μm клетъчен филтър и се центрофугират при 300 g за 5 минути. Тогава бяха клетки

култивиран с 5 mL среда, добавена дневно в продължение на 4 дни. Прилепналите клетки се издухват с пипета и се центрофугират при 2000 × g за 5 минути. След смилане с трипсин при 37 градуса за 5 минути, клетките се центрофугират при 2000 × g за 5 минути и се събират. След това се добавят 5 mL F-10 среда на Ham, допълнена с 20 процента FBS и 4 ng/mL основен фибробластен растежен фактор (PeproTech).

Цитотоксичността на NK клетки от далака на мишка към SNCs беше открита чрез тест за лактат дехидрогеназа

SNC бяха индуцирани от 0.2 μM адриамицин (MedChemExpress, САЩ) за 24 часа или чрез продължителна култура в продължение на 20 дни след 10 Gy рентгеново лъчение. След това 5000 SNC бяха поставени в блюдо и NK клетки от далака (жизнеспособност на клетките: 93.5-97.1 процента) бяха добавени при съотношения на ефектора към целта от 50:1,25:1,12,5:1, 6,25: 1,3.125:1 и 1.563:1. Супернатантите бяха събрани след съвместно култивиране при 37 градуса С в продължение на 24 часа и за откриване беше използван комплект за откриване на цитотоксичност на лактат дехидрогеназа (LDH) (Cayman Chemical, САЩ). Цитотоксичността се изчислява по следната формула: цитотоксичност (проценти)=(експеримент на смесена клетка-спонтанна клетка-мишена-спонтанна ефекторна клетка)/(максимум на клетка-мишена-спонтанна клетка-мишена) × 100.

Живо изображение

Дванадесет 10-седмични мишки C57BL/6 бяха закупени от Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (Jiangsu, Китай). След това 1 × 10 градуса 1,1'-октадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианин йодид (DiR) (Invitrogen)-белязан контрол

преадипоцити или индуцирани от радиация стареещи преадипоцити се ресуспендират в 200 uL фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и се инжектират в коремната кухина на мишки с игла 22 калибър. След три дни, 5 × 10 градуса алогенни NK клетки (клетъчна жизнеспособност: 93.6-96.2 процента) в 100uL PBS бяха инжектирани през опашната вена. На 10-ия ден мишките бяха анестезирани с изофлуран. Флуоресценцията беше открита с помощта на MS 100 Series In Vivo Imaging System (PerkinElmer, MA, USA).

Поточна цитометрия

За откриване на апоптоза на SNCs, ко-инкубирани с DiR-белязани NK клетки на далака (клетъчна жизнеспособност: 91.8-93.2 процента), 1 × 10 градуса SNCs се усвояват с точност при 37 градуса за 10 минути и след това се оцветяват с комплект за оцветяване на апоптоза с анексин V и пропидиев йодид (PI) (Multisciences Biotech Co, Ltd., Китай) в съответствие с протокола на производителя. SNC бяха затворени в DiR-отрицателна позиция. За да се тества активирането на NK клетките, миши NK клетки бяха събрани и оцветени с mNK1.1-алофикоцианин (APC)(S17016D) и с миши клъстер на диференциация 69-R-фикоеритрин-цианин7 (mCD{{ 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, САЩ) при 4 градуса за 30 минути. След това клетките се обработват с CytodexCytoperm Plus Kit (BD Biosciences, САЩ) и се оцветяват с миши интерферон гама-брилянтно виолетово 421 (mlFNy-BV421) (XMG1.2) при 4 градуса за 30 минути. Оцветяването с Perforin-APC(S16009A) на човешки NK клетки се извършва, като се използва същият протокол като този, използван за извънклетъчно оцветяване (CD56-флуоресцеин изотиоцианат [FITC](5.1H11), CD69-PE(FN50) ) и вътреклетъчно оцветяване (перфорин-APC) (Biolegend).

За откриване на NK клетки от периферна кръв се събират 100 uL антикоагулантна кръв. За периферна кръв на мишка бяха добавени CD3-FITC, NK1.1-APC и CD69-PE-Cy7. За човешка периферна кръв се добавят CD3-BV421 (OKT3) и CD56-FITC и се инкубират за 20 минути при стайна температура.

След това се добавят 400 μL 1 × еритроцитен лизат（BD Biosciences） и се инкубират за 3 минути, последвано от три промивания с PBS. За да се открие клетъчна пролиферация в мастната тъкан, мишките бяха инжектирани интраперитонеално с 200 μL от 10 mg/mL бромодеоксиуридин (BrdU) 24 и 72 часа преди евтаназията. След евтаназия, ингвиналните мастни депа бяха отстранени и нарязани на фрагменти, усвоени при 37°С в продължение на 30 минути с колагеназа II и DNase и филтрирани с помощта на 100 um клетъчен филтър. Клетките бяха обработени с Cytofix/Cytoperm Plus Kit и оцветени с BrdU-FITC (3D4) и Ki67-PE (16A8). Поточната цитометрия се извършва на поточен цитометър CytoFLEX. Комплектът LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific, САЩ) беше използван за изключване на мъртвите клетки във всички експерименти. Данните бяха анализирани с помощта на софтуер FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA).

Обратна транскрипция-количествена PCR

РНК се екстрахира с помощта на реагент Trizol и се обръща и транскрибира в сДНК с помощта на комплект за синтез на сДНК на 1-ва верига на косата (Yepsen Biotechnology, Китай). Количественият PCR (qPCR) се извършва с помощта на реакционната смес на SYBR Green (Yepsen Biotechnology) на ABC QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, САЩ), като GAPDH служи като вътрешен контрол. Данните бяха анализирани с помощта на метода 2-△ACt. Списъкът с праймерни последователности е докладван в Допълнителен материал (Таблица 2-3).

Оцветяване с галактозидаза, свързано със стареенето

За клетъчно оцветяване, клетките се промиват веднъж с PBS, фиксират се в свързан със стареенето -галактозидаза (SA- -gal) разтвор (Cell Signaling Technology, САЩ) при стайна температура за 15 минути, промиват се три пъти с PBS и се инкубират за една нощ в разтвор за оцветяване SA- -gal при 37 градуса С. Плаката беше запечатана с парафилм, за да се предотврати изпаряването на средата за оцветяване. клетки

бяха промити с PBS и наблюдавани с микроскоп. За оцветяване на замразени срезове срезовете се изсушават при 37 градуса за 30min и се фиксират при стайна температура в SA- -gal фиксиращ разтвор за 15 min. Срезовете се промиват три пъти с PBS и се инкубират за една нощ в разтвор за оцветяване SA- -gal при 37 градуса С. След това се оцветяват с еозин за 1 минута и се изплакват с вода за 2 минути. Данните за SA- -gal оцветяване бяха анализирани с помощта на софтуер Image-Pro Plus 6.0.

Експланти на човешка мастна тъкан

Чрез липосукция е получена мастна тъкан от трима индивида. Един от субектите беше мъж, а двама бяха жени. Средната възраст на субектите е 57.0±7,6 години (средно ±SD: диапазон, 50-65). Средният ИТМ е 40,5±5,1 kg/m² (средно ± SD); диапазон, 36.7-46.2）. Комитетът по етика на болницата за ракови заболявания Mengchao в Шанхай (№ 05, 2020, Комитет по медицинска етика на болницата за ракови заболявания в Шанхай Mengchao) одобри експерименталната схема. Беше получено информирано съгласие за всички доброволци. Мастната тъкан се нарязва на малки парченца с диаметър около 2 mm. Пет парчета тъкан бяха поставени във всяка ямка на 96-плака с ямки и 200 uL от преадипоцити или кондиционирана среда от индуцирани от радиация стареещи преадипоцити, допълнена с 10 процента човешки AB серум, 1 процент L-глутамин, 1 процент пеницилин/стрептомицин, 1 процент MEM неесенциални аминокиселини и 1 процент натриева пируватна киселина, бяха добавени към съвместната култура за 24 часа. След това средата се заменя със свежа среда, съдържаща 5 × 10 градуса автоложни NK клетки (жизнеспособност на клетките: 92.3-95.7 процента 6) и се култивира за още 48 часа, след което NK клетките се събират за поточна цитометрия. Мастната тъкан се промива пет пъти с PBS и същата среда се добавя за допълнителна култура за 48 часа; супернатантата (100 uL) се използва за многофакторно откриване. Преадипоцитите или индуцираните от радиация стареещи преадипоцити са получени от мастната тъкан на същия индивид.

Тази статия е извлечена от Cell Death and Disease (2022) 13:305