Анализ на състава и имунологична активност на олигозахаридите, изолирани от Cistanche Deserticola

Контакт: emily.li@wecistanche.com

Резюме.Олигозахарид (CDOS) се получава отCistanche deserticolaчрез алкална (pH{{0}}) екстракция, утаяване с етанол и фракциониран в две пречистени фракции (т.е. CDOS-1 и CDOS-2) от Sephadex G-100 и Sephadex G-25 колонна филтрационна хроматография. Монозахаридният състав на CDOS се анализира чрез високоефективна течна хроматография (HPLC). Установено е, че CDOS-1 е съставен само от захароза, а CDOS-2 е съставен главно от захароза, рамноза и манитол, с молно съотношение 1:0,73:3,61. Имунологичните тестове показват, че CDOS има значителен ефект върху индекса на далака на мишката, повишавайки фагоцитната активност на макрофагите и стимулирайки клетъчната пролиферация, произвеждаща антитела. Надяваме се, че CDOS ще бъде разработен във функционална храна или лекарство.

Ключови думи:Цистанчеdeserticola, олигозахарид, пречистване, състав, имунологични активности.

Cistanche deserticola има много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

1. Въведение

Цистанчеdeserticola YCMa. (Семейство Orobanchaceae) е ниско паразитно растение, произхождащо от северозападния Китай. Цялото изсушено растение (без цветовете) е известно като тоник и се нарича "Rou Congrong". В ориенталската медицина то се класифицира като сладко и солено на вкус, топло по природа и се дължи на каналите на бъбреците и дебелото черво, с функция наободряващнабъбреки допълваща есенция, овлажняваща червата и релаксираща червата [1]-[3]. Съвременното фармакологично изследване показа, че може да ускори синтеза на ДНК и да забави процеса на стареене, да увеличи антиоксиданта [4] , да предотврати и лекува сърдечно-съдови заболявания [3]. Освен това може да причини аналгетик ианти-възпалителенефекти [5], подобряват ученето и паметта чрез индуциране на фактори на растежа на нервите [6]. Някои проучвания показват, че екстрактите от C. deserticola могат да активират фагоцитната функция на интраабдоминалния макрофаг при мишки [7]-[9] изасилване натяло's имунитет[10]. Според предишни проучвания това растение съдържа множество активни съставки, които включват фенилетаноидни гликозиди, иридоиди, лигнани, захариди, алкалоиди и др. [11] Както C.deserticolaфенилетаноидгликозидии полизахаридите са признати за основните активни компоненти, множество изследвания са фокусирани върху техните структури и биоактивност през последните десетилетия [12]-[17]. Що се отнася до ценните олигозахариди вC. deserticola, докладите са доста ограничени. Олигозахаридите, захариди с къса верига, съдържащи хомо- или хетеро-захари, са добре известни със своите благоприятни ефекти върху човешкия живот и са били широко използвани от дълго време [18]. Функционалните олигозахариди, които имат физиологична функция като ниска кариесогенност и растежен фактор на бифидобактериите [19], подобряват здравето на хората и животните. Те са били използвани като хранителна съставка. Наскоро бяха докладвани нови функции на олигозахаридите, които имат способността да модулират имунната система при хора, животни и риби [20]. В тази статия ние докладваме първата част от резултатите от изследователската програма, фракционирането от общите олигозахариди, получени от алкалния екстракт на C. deserticola чрез комбинация от ултрафилтрация и гелпроникваща хроматография, и анализ на състава им чрез високоефективна течна хроматография (HPLC). В допълнение, ние също представяме имунологичните активности на олигозахаридите на C. deserticola. Доколкото ни е известно, има малко публикувани доклади за проучвания на имуностимулиращата активност наC. deserticolaолигозахариди.

2. Експериментален

2.1. Материали

C. deserticola е култивиран и събран от Alxa League (Вътрешна Монголия, Китай). Мишки Kunming (клас II, на шест седмици) бяха закупени от експерименталния център по фармакология на университета на Вътрешна Монголия. Сефадекс G-100, Сефадекс G-25, трифлуорооцетна киселина (TFA), 1-фенил-3-метил-5- пиразолон (PMP), D-глюкоза, D- галактоза, D-фруктоза, D-ксилоза, D-маноза, D-галактуронова киселина, D-глюкуронова киселина, захароза, рамноза, манитол, фукоза, рамноза, са закупени от Sigma (St. Louis, MO, USA). Среден RPMI-1640 е закупен от Gibco Invitrogen Co. (Сан Диего, Калифорния, САЩ). Всички други химикали са с аналитичен клас.

2.2. Екстракция на олигозахариди

Изсушените тела на C. deserticola се нарязват на по-малки парчета и допълнително се смилат на прах чрез мелница, екстрахират се с безводен етанол (3 × 5000 ml) при 70 градуса за 3 часа при атмосферно налягане. Рефлуксният кондензатор беше фиксиран за отстраняване на липидите. След това останалият остатък се екстрахира с основа (pH =10) при 60 градуса за 3 пъти (2 часа всеки път). След центрофугиране (2000 g за 15 минути, при 20 градуса), супернатантата се концентрира до една десета от обема в ротационен изпарител при понижено налягане при 50 градуса и се филтрува. След това филтратът се депротеинизира с помощта на реагента Sevag [21] и се обезцветява с активен въглен.

2.3. Изолиране и пречистване на олигозахариди

Изсушените чрез замразяване сурови олигозахариди се разтварят в дестилирана вода, центрофугират се и след това супернатантата се пречиства чрез колона Sephadex G-100 (1 × 50 cm), уравновесена с ултрачиста вода. След зареждане с пробата, колоната се елуира с ултрачиста вода при скорост на потока от 5 ml/min. Различни фракции бяха събрани с помощта на епруветки. Общото съдържание на въглехидрати във всяка епруветка се измерва при 490 nm по метода фенол-H2SO4 [22]. Елуираният с вода разтвор се разделя на две фракции CDOS-1 и CDOs-2. Две фракции бяха съответно пречистени допълнително на Sephadex G-25 колона (2.7×85 cm) чрез използване на свръхчиста вода (при скорост на потока от 1 ml/min). След събиране на пречистената фракция, тя се лиофилизира.

2.4. Анализ на монозахаридния състав

Монозахаридният състав на CDOs беше постигнат чрез HPLC анализ. CDOs (2 mg) се хидролизират първо с безводен метанол, съдържащ 2 М HCl при 8 0 градуса за 16 часа под азотна атмосфера и след това с 2 М TFA при 120 градуса за 1 час. След като TFA се отстрани чрез изпаряване, хидролизатите впоследствие се дериватизират с PMP съгласно описания метод [23] и се анализират чрез HPLC. HPLC разделянето се извършва на EF-2002 HPLC система (компания KNAUER, Германия). Производните на PMP се хроматографират с използване на обем Sugar-PAK (6,5 × 300 mm, компания за чаши вода, Америка) и абсорбцията се измерва при 245 nm. Инжекционният обем беше 20 µL и подвижната фаза, съставена от PBS (разтворител А) и ацетонитрил (разтворител В), беше използвана за изократно елуиране при обемно съотношение от 82 процента (А) към 18 процента (В). Общото време на HPLC е 40 минути и скоростта на потока е 0.5 mL/min.

2.5. Имунобиологични дейности

2.5.1. Фагоцитна функция на моноцити-макрофаги

Шестдесет мишки Kunming (клас II, на възраст шест седмици) бяха закупени от Фармакологичния експериментален център на университета на Вътрешна Монголия и бяха аклиматизирани за 1 седмица преди употреба. Всички мишки бяха разделени на случаен принцип в четири групи, състоящи се от контролна група с физиологичен разтвор, група с висока доза CDO, група с умерена доза и група с ниска доза CDO. Мишките бяха инжектирани интраперитонеално с 0.5mL разтвор на олигозахариди веднъж на ден в продължение на 5 дни. Групата с високи, умерени или ниски дози CDOs получава съответно 10{{10}}, 50 или 25 mg/kg/BW CDOs; и 0,5 ml физиологичен разтвор се инжектира в контролната група. На седмия ден беше проведен експеримент за изчистване на въглеродни частици, според Hou [24], и бяха измерени индексът на далака и индексът на тимуса. Накратко, 0,05 mL/10 g/телесно мастило се инжектира във всяка мишка през vena caudalis, след това 20 μL кръв се получава от vena orbitalis posterior 3 и 7 минути след инжектирането. Кръвните проби се поставят в епруветки с 2 ml 0,1 процента Na2CO3 и стойностите на OD се измерват при 600 nm. Индексът на клирънс (К), фагоцитният индекс () и индексът на имунния орган се изчисляват както следва (1), t2 и t1 означават съответно 7 минути и 3 минути.

2.5.2. Клетъчна пролиферация, произвеждаща антитела

Групи от мишки Kunming (пет на група) бяха имунизирани чрез интраперитонеално инжектиране на 2 х 107 SRBC в 1.0 ml PBS, добавен с 50 ug тестови материали (нито един в контролата). Една седмица по-късно, спленоцити (106 клетки на 2 ml на ямка) от мишки Kunming се култивират със или без тестови материали в продължение на 72 часа в 10 процента RPMI 1640 среда под 5 процента CO2 във въздуха, в три екземпляра за всяка култура. Определя се броят на PFC срещу SRBC на 106 спленоцита [25], [26].

2.6. Статистически анализ

Данните бяха изразени като средни стойности ±SD. Разликата между тестваните групи и контролата се анализира чрез t-тест на Student. P < 0.05="" се="" счита="" за="">

3. Резултати и дискусия

3.1. Изолиране и пречистване на олигозахариди

CDO бяха изолирани от алкалния екстракт на изсушените тела на C. deserticola с добив от 3.{14}}7 процента. Две фракции от CDOS-1 и CDOS-2 бяха изолирани от дестилирана вода елуент чрез колона Sephadex G-100, съответно (фиг.1). Пречистените фракции на CDOS-1 и CDOS-2 показват единичен пик в колоната Sephadex G-25, което показва, че в пробата не присъстват други олигозахариди. Резултатите от монозахаридните състави показват, че CDOS-1 е съставен само от захароза (фиг.2), а CDOS-2 е съставен главно от захароза, рамноза и манитол (фиг.3), с моларно съотношение от 1:0.73:3.61.

3.2. Имунобиологични активности на CDO

Много in vivo и in vitro доказателства показват, че естествените олигозахариди показват имуномодулираща функция чрез стимулиране както на клетъчните, така и на хуморалнитеимунна отговори[27], [28]. В тази статия 100 mg/kg/BW CDOs повишават индекса на далака на мишката, но няма значителни разлики в индекса на тимуса между третираните групи и контролните групи (Таблица 1). Макрофагите са важен компонент на защитата на гостоприемника срещу вирусна инфекция чрез инхибиране на вътреклетъчната репликация на вируси и чрез убиване на инфектирани с вируси клетки [29]. Когато се активират, различни кислородни или азотни междинни продукти и цитокини се освобождават от макрофагите и участват в различни важни биологични функции, като противовъзпалителни и антитуморни дейности [30]-[32]. Следователно фагоцитната активност на макрофагите е важен показател за имунните функции на организма. В това проучване умерените и високите дози CDO повишават фагоцитната активност на макрофагите (Таблица 1). Произвеждащата антитяло клетъчна пролиферация, индуцирана от CDOs, беше изследвана чрез изследване на повишаването на хемолитичния PFC в далака на мишки Kunming, които бяха имунизирани със SRBC плюс тестовия образец. Резултатите показват, че умерени и високи дози CDOs значително повишават клетъчната пролиферация, произвеждаща антитела (Таблица 2). Високите дози CDO причиняват силно значимо увеличение на броя на PFC (P <>

Препратки

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Разпознаване на смесен биологичен сигнал на базата на Wavelet анализ. В: Y. Jiang, et al (eds). Proc. на UK-China Sports Engineering Workshop. Ливърпул: Световен академичен съюз. 2007, стр. 1-8.

[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao, et al. Ефекти на редкоземни елементи върху растежа на клетките на Cistanche deserticola и производството на фенилетаноидни гликозиди. JB io-technol, 2003, 102 (2): 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian и др. Нов натурален продукт от Cistanche deserticola YCMA. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Антиоксидативно действие на гликозидите на Cistanche в тъканта на мишки. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRA Антиноцицептивна и противовъзпалителна активност, причинена от Cistanche deserticola при гризачи. J Ethnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.

[6] Чой, JG; Луна, М; Джеонг, Унгария; Ким, MC; Ким, SY; О, MS Cistanches Herba подобрява ученето и паметта чрез индуциране на фактор за растеж на нервите. Поведенчески изследвания на мозъка. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Сравнение между Cistanche deserticola YC Ma и C, tubulosa (Shenk) Wight относно някои фармакологични действия. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu XF, Zeng GZ и др. Изследване на повишаване на сексуалната сила на C. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ, He W, Wu GL и др. Сравнения между Cistanche deserticola YC Ma и C.tubulosa тегло върху някои фармакологични действия. J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL Имуномодулаторни ефекти на полизахарида от Cistanche deserticola YC Ma. J Zhejiang Univ, Med Sci. 2002, 31(4): 284- 287.

[11] Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Напредък в изследванията на химичните съставки и лечебната активност на Cistanche. Китайски диви растителни ресурси, 2010, 29(1):7-11.

[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Изолиране и идентифициране на фенилетаноидни гликозиди от Cistanche deserticola. Nat Prod R & D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu NS, Liu JL Определяне на фенилетаноидни гликозиди в Cistanche deserticola чрез спектрофотометрия на макроретикуларна смола. Nat Prod R & D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T, et al. Инхибиране на азотен оксид от фенилетаноиди в активирани макрофаги.

European Journal of Pharmacology, 2000, 400: 137- 144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan и др. Структурен анализ на водоразтворим полизахарид SPA, изолиран от стъблото на Cistanche Deserticola Ma. Chemical Journal of Chinese Universities, 2005, 26(3):461-463.

[16] Уанг Сянян. Проучване на имунната фармакология и абсорбционния характер на полизахаридите на Cistanche deserticola. 2011, No.S1, Медицина и здравни науки, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Хепатопротективна активност на фенилетаноиди от Cistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.

[18] Наръчник за амилази и сродни ензими (изд. от The Amylase Research Society of Japan), Pergamon Press (1988)

[19] Арая, С. (ред.) Доклади от 5-та конференция за зъбен кариес и свързваща захар (на японски), Национален институт по здравеопазване, Токио (1980 г.)

[20] Кодо Отака. Функционален олигозахарид и неговия нов аспект като имунна модулация. J. Biol. Macromol. 2006, 6(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Полизахариди от горещи водни екстракти от печени зърна Coffea arabica: Изолиране и характеризиране. въглехидрати. Polym.1999, 40:71–81.

[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Колориметричен метод за определяне на захари и сродни вещества. анален Chem. 1956, 28:350-356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Анализ на монозахаридните компоненти в полизахаридите на Angelica чрез високоефективна течна хроматография. Anal Sci. 2005, 21:1177-1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan и др. Извличане и пречистване на лектин от червен боб и предварителни изследвания на имунната функция на лектина и четири китайски билкови полизахарида. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2010: 1-9.

[25] Cunningham, AJ и A. Szenberg. По-нататъшни подобрения в техниката на плаката за откриване на единични клетки, образуващи антитела. Имунология. 1968, 14: 599-600.

[26] Харухико Такада, Томохико Огава, Фуминобу Йошимура и др. Имунобиологични активности на поринова фракция, изолирана от Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. Инфекция и имунитет. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ Имуномодулираща активност на CVT-E002: патентован екстракт от северноамерикански женшен (Panax quinque folium). J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Структури и връзки структура-активност на три митогенни и комплемент-фиксиращи пектинови арабиногалактани от малийските противоязвени растения Cochlospermum tinctorium A. Rich и Vernonia kotschyana Sch Bip. бивш Walp. Биомакромолекули. 2006, 7:71–79.

[29] Е.-М. Choi, A.-J. Ким, Й.-О. Ким и Дж.-К. Hwang, Имуномодулираща активност на арабиногалактан и фукоидан in vitro. Вестник за лечебна храна. 2005, 8(4):446–453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian, et al. Оценка и сравнение на имунорегулаторната активност на четири хидроразтворими фракции на Angelica Sinensis in vitro върху перитонеалните макрофаги в ICR мишки. Международна имунофармакология. 2010, 10:422-430.

[31] YS Lee, OK Han, CW Park, et al. Експресия на провъзпалителни цитокинови гени и регулиране на азотния оксид на водно екстрахиран Astragali radix в RAW 264.7 макрофагови клетки. Вестник по етнофармакология. 2005, 100 (3): 289–294.

[32] KY Лий и YJ Jeon. Полизахаридът, изолиран от Poria cocos sclerotium, индуцира активиране на NF-κB/Rel и експресия на iNOS в миши макрофаги. Международна имунофармакология. 2003, 3(10-11):1353–1362.