Цялостно профилиране на секретомни формулировки от фетални и перинатални стволови клетки от човешка амниотична течност, част 1

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:По-рано докладвахме, че c-KIT плюс htaman стволови клетки, получени от амниотична течност, получени от остатъчни проби от рутинна пренатална диагностика на Ⅱ триместър (фетална hAFS), са надарени с регенеративен паракринен потенциал, стимулиращ оцеляването, антифиброзни и пролиферативни ефекти. могат също да бъдат изолирани от проби от клинични отпадъци от III триместър по време на планирани С-сечения (перинатална hAFS), като по този начин предлагат по-лесно достъпна алтернатива в сравнение с феталната hAFS. Независимо от това, малко се знае за паракринния профил на перинаталната hAFS. Тук предоставяме подробна характеристика на общия секретом на hAFS (т.е. съвкупността от разтворими паракринни фактори, освободени от клетките в кондиционираната среда, hAFS-CM) и извънклетъчните везикули ( hAFS-EVs) в него, от фетални клетки от Ⅱтриместър спрямо перинатални клетки от III триместър. Феталните и перинаталните hAFS бяха характеризирани и подложени на хипоксична предварителна подготовка за повишаване на техния паракринен потенциал. Съставите на hAFS-CM и hAFS-EV бяха анализирани за съдържание на протеини и хемокини/цитокини и EV товарът беше допълнително изследван чрез секвениране на РНК. Фенотипът на феталната и перинаталната hAFS, заедно със съответните им секретомни формулировки, се припокриват; все пак феталната hAFS показа незряла активност на окислително фосфорилиране в сравнение с перинаталните. Профилирането на техния паракринен товар разкрива някои разлики според гестационния стадий и хипоксичното прекондициониране. И двата клетъчни източника предоставят състави, обогатени с невротрофични, имуномодулиращи, антифиброзни и ендотелиални стимулиращи фактори, а незрелият фетален hAFS секретом се определя от по-изразен проваскулогенен, регенеративен, про-разтворим и анти-стареене профил. Профилирането на малка РНК показа обогатяване на микроРНК както във феталния, така и в перинаталния hAFS-EV товар, със стабилно експресирано про-разрешаващо ядро ​​като референтен молекулен подпис. Тук потвърждаваме, че hAFS представлява привлекателен източник на регенеративни паракринни фактори; изборът на фетални или перинатални hAFS секретомни формулировки за бъдеща паракринна терапия трябва да бъде оценен, като се има предвид специфичният клиничен сценарий.

Ключови думи:амниотична течност; стволови клетки; паракринни ефекти; извънклетъчни везикули; клетъчно кондиционирана среда; хемокин; цитокини; протеомика; РНК секвениране; микроРНК

Моля, щракнете тук, за да научите повече

1. Въведение

Регенеративната медицина наскоро се разви като нововъзникваща област за осигуряване на функционално възстановяване на увредена тъкан чрез няколко стратегии. Тъй като подходите за тъканно инженерство значително напреднаха през последните години, изследването на паракринните ефекти на стволовите клетки едновременно се засили все повече. Доказано е, че терапевтичният потенциал на трансплантираните стволови клетки се медиира предимно от техните секретирани разтворими фактори, които могат да организират про-регенеративна микросреда в тъканта на гостоприемника, като същевременно задействат активирането на ендогенни механизми за функционално възстановяване [1,2]. Ето защо, секретомът на стволовите клетки включва всички освободени от клетките паракринни трофични молекули, както и мембранно свързани екстрацелуларни везикули, все по-често се предлагат като иновативен лекарствен продукт за терапия от множество независими предклинични проучвания, насочени към сърдечно-съдови, неврологични и/или възпалителни заболяване. Съответно, стволовите клетки могат да се разглеждат като биологични фабрики за използване на техния терапевтичен секретом чрез предлагане на готови за употреба и готови регенеративни лечения. Чрез прилагането на такава клетъчно базирана, но безклетъчна стратегия, много ограничаващи аспекти, свързани с каноничната клетъчна терапия, могат да бъдат преодолени, като същевременно се гарантират благоприятни ефекти.какво е цистанчеВ тази перспектива, мезенхимните стромални клетки (MSC) са широко тествани като предполагаеми кандидати за клетки? Наистина, MSC и стволовите/прогениторните клетки са конструирани и/или стимулирани чрез различни стратегии за предварителна подготовка за подобряване на техния регенеративен капацитет и секреторен потенциал [3,4] с изричен интерес към биологичното значение на техните секретирани извънклетъчни везикули (EV).

EV са частици с нано размери, ограничени от липиден двоен слой и активно секретирани от всички типове клетки. Електрическите автомобили включват много малки (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); те действат като критични биологични транспортьори на междуклетъчно сигнализиране, като доставят молекулярния си товар от родителска клетка до реагираща/целева [5,6]. Като се има предвид, че техният особен паракринен потенциал за упражняване на благоприятни ефекти е сравним с техния произход на клетките, EV на стволовите клетки са възникнали като привлекателни терапевтични възможности в предклинични модели на заболявания, като исхемия, възпаление или нараняване, както е разгледано подробно в [{{3 }}]. От транслационна гледна точка, на върха на клетъчния модулационен потенциал, осъществимостта на изолацията и повишеното самообновяване са ключови аспекти на идеалния източник на терапевтични EVs и разтворими фактори. При такъв сценарий феталните и перинаталните MSC могат да предложат интересна опция, като се има предвид техният пролиферативен потенциал и профил на незрялост в развитието с междинни характеристики между ембрионални и възрастни соматични предшественици [10,11]. Феталните MSC могат да бъдат изолирани от екстра-ембрионални анекси по време на бременността като остатъчна проба, получена по време на пренатален скрининг (т.е. хорионни въси [12-14] и амниотична течност [15,16]) или получени като перинатални прогенитори при раждането, от клинични отпадъчни материали (т.е. амниотична и плацентарна мембрана [17-21], компоненти на пъпната връв [22-24] и термин амниотична течност [25,26]).

Cistanche може да спре стареенето

Трябва да се отбележи, че човешките стволови клетки от амниотична течност (hAFS) са подчертани като обещаващи терапевтични стратегии в регенеративната медицина. и е доказано, че са широко мултипотентни in vitro и in vivo [16,27,28], допринасят за хемопоетичната линия след трансплантация in utero [29] и се присаждат в увредени органи, като същевременно упражняват имуномодулиращи ефекти [26,30] и активират ендогенни репаративни отговори, както е подробно описано в [31]. Нашият екип и други допълнително демонстрираха, че hAFS освобождава секретом, силно обогатен с биоактивни трофични молекули, способни да се насочват към различни репаративни механизми. Съобщава се, че паракринните фактори на hAFS осигуряват стимули за оцеляване с потушаване на възпалението [32], осигуряват кардиопротекция срещу продължителна исхемия [33.34] и кардиотоксичност [35] и стимулират локалната ангиогенеза с повторно влизане в клетъчния цикъл на кардиомиоцитите [ 34,36]. Тъй като е доказано, че повечето от тези ефекти са рекапитулирани само от прилагането на hAFS-EV, независими проучвания са фокусирани върху дисекцията на техния регенеративен профил срещу различни патологични среди, включително увреждане на скелетния и сърдечния мускул, бъбречно заболяване, остеоартрит, остеопороза, некротизиращ ентероколит и невродегенеративни модели [34,37-44].

Въпреки че доказателствата могат да подкрепят клиничния превод на hAFS-EVs за бъдеща паракринна терапия, важно е да се има предвид, че повечето от тези проучвания са изследвали главно модулационния потенциал на феталната hAFS, получена по време на пренатален скрининг през Ⅱ триместър. Наистина, пълен профил на секретома от перинаталното има аналог (т.е. от III триместър цезарово сечение) все още не е проучено в детайли. Перинаталните hAFS през третия триместър са показали отличителни имунорегулаторни свойства в сравнение с тези от ме- и II триместър [26], като същевременно поддържат съответния ендотелен регенеративен потенциал [25].колко цистанче да приематеТрябва да се отбележи, че неотдавнашният доклад за хетерогенната морфология на феталните hAFS [45] предостави нови прозрения за техния профил на стволовост и генна експресия.биофлавоноидиТова като цяло хвърли нова светлина върху регенеративната стойност на различните клетъчни фракции на hAFS [46]. Следователно, цялостната характеристика на различните субпопулации на hAFS привлича нарастващо внимание. По-рано съобщихме, че 24-часовата хипоксична и безсерумна стимулация представлява ефективна стратегия за повишаване на паракринния потенциал на hAFS на плода в Ⅱ триместър [34,35,37]. Тъй като малко се знае за състава на секретома от III триместър hAFS, тук докладваме цялостното сравнение на Ⅱ спрямо Ⅲ триместър hAFS и техните секретомни фракции (включително hats-EV), за да се справим с влиянието на гестационния стадий и хипоксичните клетки прекондициониране на характеристиките на клетката и секретома.

2. Резултати

2.1.Перинатален hAFS Представлява близко фенотипно съвпадение с феталното

Не е оценена статистически значима разлика във възрастта на донора между фетални проби от амниотична течност от триместър II и перинатални III триместър. Фетален c-KIT* hAFS (f-hAFS от проби от амниотична течност от II триместър) и перинатална c-KIT* hAFS (p-hAFS от клинични отпадъци от амниотична течност от III триместър) потвърдиха сходни характеристики с фибробластоподобна и овално-кръгла морфология (Фигура 1A) и мезенхимен стромален фенотип (данните не са показани), както беше съобщено по-рано [16,25]. Както f-hAFS, така и p-hAFS, култивирани in vitro до пасаж 5, показват незначителни нива на стареене от свързано със стареенето- -галактозидаза (SA- -Gal) активиране в около 4 процента от клетките (Фигура 1B) . Както f-hAFS, така и p-hAFS представят високо ниво на ко-експресия на мезенхимните маркери CD107a и CD146, за които наскоро беше съобщено, че определят силно секреторен фенотип [47]. Клетките CD107at CD146* представляват по-голямата част от f-hAFS популацията (приблизително 64 процента,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Фигура 1. Фетална и перинатална фенотипна оценка. (A) Представителни изображения на фетална hAFS (f-hAFS, ляв панел) и перинатална hAFS (p-hAFS, десен панел), култивирани in vitro при стандартни условия; мащабна лента: 200 um. (B) Анализ на стареещия маркер бета-галактозидаза (SA- -Gal, в синьо) чрез цитохимично оцветяване на f-hAFS и p-hAFS след 5 пасажа в култура; представителните изображения са докладвани в левия панел, мащабна лента: 200 um. Съответният процент на -Gal-положителни клетки/поле е отчетен на графиката в десния панел (f-hAFS:4,12±0,58 процента и p-hAFS:3,88±2,10 процента; p=0.1424,n{ {24}} експерименти). (C) Имунофенотип на hAFS, експресиращ CD146 и CD107a мезенхимни маркери. Представителни диаграми на поточна цитометрия на f-hAFS и p-hAFS (ляв панел) и съответните стойности, отнасящи се до двойно положителни CD107a плюс CD146 плюс клетки; CD107a плюс CD146* f-hAFS:63,68±5,82 процента,*p=0.016 в сравнение с остатъкаg36,32±5,82 процента f-hAFS (Други); CD107 при CD146 плюс p-hAFS:52,07±6,76 процента с останалите47. 93±56,76 процента p-hAFS (друго); CD107a плюс CD146 плюс f-hAFS срещу CD107a плюс CD146 плюс p-hAFS p=0.2403,n=4 експерименти. Друго: общо количество оставащи CD107a-CD146~hAFS,CD107a~CD146*hAFS и CD107at CD146-hAFS. Всички стойности са изразени като средна стойност ± sem от независими експерименти. SA- -Gal: Свързана със стареенето- -галактозидаза.

2.2. Феталните hAFS показват различен метаболизъм от перинаталните hAFS

За да се оцени дали гестационният стадий може да повлияе на митохондриалния метаболизъм, f-hAFS и p-hAFS бяха анализирани в стандартни in vitro условия на култура чрез биохимични анализи. Оценката на аеробния метаболизъм показа, че скоростта на консумация на кислород (OCR) и синтезът на АТФ са по-ниски при f-hAFS по отношение на p-hAFS, и двете, когато са стимулирани с пируват плюс малат (P/M;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. Хипоксичната предварителна подготовка не засяга феталната и перинаталната жизнеспособност и поддържа тяхната секреторна активност

За да се определят съставите на hAFS секретом, клетките се култивират в условия без серум, за да се избегне всякакво замърсяване от FBS. По-рано показахме, че условията на 24-часова безсерумна (SF) и 1% O2 хипоксична култура не променят значително жизнеспособността на hAFS на плода през Ⅱ триместър (f-hope), докато поддържат освобождаването на регенеративни паракринни фактори в тяхната клетъчно кондиционирана среда (hAFS-CM) и в извънклетъчните везикули (hAFS. EVs)[34,35,37,49]. Тук, в допълнение към профилирането на секретомните фракции на p-hAFS за първи път, ние оценихме дали p-са представили подобно поведение при същия режим на предварителна подготовка, използвайки условието на нормоксична култура като контрола. f-hAFS и p-hAFS жизнеспособността бяха анализирани след 24 часа при следните настройки: нормоксично (20 процента O2) състояние в пълна контролна (Ctrl) културална среда (Ctrlf-hAFSnormo и Ctrl p-hAFSnormo), нормоксично състояние в SF среда (SF f-hAFSnormo и SF p-hAFSnormo), хипоксично (1 процент O2) състояние в пълна контролна среда (Ctrlf-има хипо и Ctrl p-hAFSnypo) и хипоксично състояние в SF среда (SF f-има хипо и SF p -има хипогликемия, Фигура 3А). Ние потвърдихме, че жизнеспособността на f-has е непроменена както при Ctrl, така и при SF условия и при хипоксична стимулация, като повече от 80 процента (до почти 88 процента) от всички клетки са незасегнати. Ранните и късните апоптотични клетки варират от около. 13 процента до 18 процента в условия на SF, без никакво статистически значимо значение. По същия начин перинаталната жизнеспособност е в диапазона от 80-92 процента, а ранните и късните апоптотични клетки представляват до 18 процента при условия на SF. p-hAFS са незначително повлияни само при комбинирани хипоксични и SF условия; наистина, докато предварителното кондициониране не повлия на клетъчното оцеляване, когато p-hAFS се култивират в пълна среда, съответното SF състояние показва увеличение с приблизително. 4-сгъване (* стр<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Фигура 2. Метаболитна характеристика на фетална и перинатална hAFS. (A) Скорост на потребление на кислород (OCR), синтез на АТФ чрез F1-F.ATP синтаза и съотношение P/O в f-have и-have в присъствието на пируват плюс малат (P/M) или сукцинат (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche АвстралияСравнението на процента на инхибиране на синтеза на OCR и ATP в f-и-hAFS, дължащ се на инхибиторите, посочени по-горе, е докладвано в долния панел B. За OCR експерименти: hAFS плюс Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

След това оценихме добива на секретомни фракции, получени от f-hAFS спрямо p-hAFS на базата на обогатяване с протеини. Общият има секретом, тъй като съвкупността от клетъчно секретираните паракринни фактори тук е представена от hAFS-CM. Протеиновата концентрация на f-hAFS-CM и p-hAFS-CM в SF среда след предварително кондициониране на хипоксични клетки спрямо контролно нормоксично състояние като изходно ниво (а именно f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo и p -hAFS-CMHypo,) се оценява чрез ВСА анализ и се измерва според 10§ клетки.цистанчПолучените резултати предполагат, че f-has-CM и p-hAFS-CM показват еднаква положителна тенденция в обогатяването на протеин след хипоксично праймиране (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 клетки на степен; p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 ug/10 клетки на степен） спрямо техните нормоксични двойници (f-hAFS-CMnormo:105,50±19,89 ug/10 клетки на степен; p- hAFS-CMhypoi 91,12±24,39 ug/10 градусови клетки）. По същия начин повърхностната протеинова концентрация на hAFS-EVs беше измерена в f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo и p-hAFS-EVShypo EVs показаха сравним добив, когато бяха получени от f-hAFS или p-hAFS. Що се отнася до съставите на hAFS-CM, положителна тенденция в увеличаването на протеиновото съдържание на f-hAFS-EVs и p-hAFS. EVs бяха оценени след хипоксична стимулация през съответно нормоксично състояние （f-hAFS-EVSHypo∶2,03±0,67 ug/10 градуса клетки и p-hAFS-EVSHypo∶1,85±0,47 ug/10 градуса клетки;f-have-EVsnormo∶1,28±0,36ug/10 градуса клетки и p -hAFS-EVsnormo∶1,19±0,31 ug/10 градуса клетки, Фигура 3C).

2.4. Фетални и перинатални hAFS освобождаващи EV с аналогична морфология и разпределение по размер

Морфологичният анализ чрез трансмисионна електронна микроскопия (TEM) повиши високия EV-секреторен пролайф както на f-hAFS, така и на p-hAFS (Фигура 4). Допълнително изследвахме размера и площта на f-hAFS-EVs и p-hAFS-EVs (Фигура 4B) след хипоксична предварителна подготовка в сравнение с нормоксичната изходна линия. Феталните и перинаталните са освободили EVs с хетерогенен размер, в диапазона от 40-250 nm, следователно включващи както екзозоми/малки EVs, така и микровезикули/отделящи се везикули. Средният размер на EVs/поле в различните групи беше сравним, феталните hAFS-EVs измерени 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo:97,10±10,10 nm) и перинатални, измерени 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94,60±19,53 nm; p-hAFS-EVShypo:76,43±4.86 nm, фигура 4B, ляв панел). Що се отнася до добива, hAFS, стимулиран при хипоксия, показва положителна тенденция в увеличаването на количеството малки EV, въпреки че това увеличение не е статистически значимо. f-hAFS-EVStypo измерва 40-70 nm, което е почти два пъти повече в сравнение с техния нормоксичен аналог. Перинатален-has-EVSHypo, който измерва 40-70 nm, 70-100 nm и 100-130 nm, е почти утроен от количеството, получено в нормоксична култура (Фигура 4B).

Анализът за проследяване на наночастици (NTA) показа повишен брой частици както в f-hAFS-EV, така и в p-hAFS-EV препаратите и потвърди увеличението на EVs в хипоксичните проби, както се наблюдава и от предишните анализи (f-hAFS- EVsnormo: 182±0.10'частици/10 градуса клетки; f-have-EVshypo: 3.30±0.22×10 градуса частици/10 градуса клетки ;p-hAFS-EVsnormo:2,43±0,80×10 градуса частици/10 градуса клетки;p-hAFS-EVshypo:3,05±0,62×10 градуса частици/10 градуса клетки, Фигура 4C).

Фигура 4. Морфологична характеристика на фетални и перинатални EVs. (A) Представителни изображения на трансмисионна електронна микроскопия (TEM) на f-hAFS и p-hAFS (горен и долен ляв панел, съответно, с черни стрелки, показващи интрацитоплазмени мулти-везикуларни тела с малки EVs/екзозоми в тях) и на f -hAFS-EVs и p-hAFS-EVs (съответно горен и долен десен панел), освободени в условия без серум и при нормоксична спрямо хипоксична предварителна подготовка (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; и f-hAFS-EVshypo, съответно), скални ленти: 200 nm. (B) Ляв панел: TEM анализ на разпределението на размера на hAFS-EVs; десен панел: разпределението на броя f-hAFS-EVs и p-hAFS-EVs за интервали на размер на полето от 40 nm до 250 nm бяха разгледани; стойностите са изразени като средна стойност ± sem от n=3 независими експеримента. (C) Анализ на проследяване на наночастици за размер и разпределение на hAFS. Ляв панел: представително изображение на графичния изход; десен панел: концентрация на hAFS-EVs, измерена като 10 градусови частици на 10 градусови секретиращи клетки; nm: нанометър; mL: милилитър.

2.5. Протеомна характеристика на фетална срещу перинатална hAFS подчертава разликите в състава на техния секретом според гестационната възраст и хипоксичното предварително състояние

Протеомното характеризиране както на f-hAFS, така и на p-hAFS секретомните формулировки беше извършено с помощта на платформа без етикети, базирана на свързването на нано течна хроматография и масова спектрометрия с висока разделителна способност (nLC-HRMS). Четиридесет и осем протеомни профила бяха получени чрез дублиран анализ на три биологични реплики на hAFS-CM и have-EVs от f-hAFS и p-hAFS, подложени на хипоксично клетъчно предварително кондициониране в сравнение с нормоксичното състояние като контрола. Общо 4179 различни протеинови групи бяха идентифицирани с поне един уникален пептид и с молекулни тегла, вариращи от 2 до 3900 kDa и изоелектрични точки от 3,6 до 13. По-висока средна протеинова експресия в hAFS-EVs се наблюдава в сравнение с hAFS-CM . Подравняването на всички получени протеинови списъци беше извършено на базата на идентифицирани протеини. За всяко експериментално състояние беше създаден уникален списък, нормализиращ и осредняващ [50] стойностите на съвпадение на пептидния спектър (PSM), приписани на протеините, които представляват броя на масовите спектри, присвоени на всеки, и индиректно представят тяхното изобилие в пробите. Пълният списък на протеини, идентифицирани в hAFS-CM и have-EV формулировки, е докладван в Таблица S1.

Прилагането на линеен дискриминантен анализ (LDA [51]) в този основен списък позволи извличането на статистически значими протеини (съотношение по-голямо или равно на 4,5 и** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 във формулировките hAFS-CM и have-EV, разглеждани отделно. Докато около 69,5 процента и 69,9 процента от протеините бяха споделени съответно между hAFS-EVs и hAFS-CM състояния, останалото съдържание изглеждаше изключително в различни пропорции, вариращи от 3,7 процента до 13,4 процента, сред формулировките.

За количествено изследване на протеомните промени беше извършен диференциален анализ без етикети с помощта на домашно направения софтуер MAProMa и прилагане на два алгоритъма, DAve (Средна разлика) и DCI (Индекс на диференциална увереност, представляващ съотношението и увереността в диференциалното изразяване, съответно), върху PSM на всеки отделен протеин между двата сравнявани термина. Използвайки строги филтри за DAve и DCI, за да увеличите максимално увереността на идентификацията и да вземете предвид протеини с вариация, по-голяма от кратна промяна от 1,5, сравнения по двойки на f-hAFS-CM спрямо p-hAFS-CM и на f-hAFS-EVs спрямо p-hAFS-EVs бяха направени според клетъчния гестационен стадий. Общо 58 и 109 протеина бяха намерени диференциално експресирани в горните отделения has-CM и have-EV, съответно (Фигура S1B, C за избрани подробности и таблици S2-S3 в разширена форма). Сред тях 30 протеина са довели до регулиране нагоре в f-hAFS-CM и 28 са регулирани нагоре в p-hAFS-CM (Фигура S1B); по същия начин, 44 отделни протеини доведоха до регулиране нагоре в f-have-EVs и 65 бяха регулирани нагоре в p-hAFS-EVs (Фигура S1C). Трябва да се отбележи, че протеини, които са довели до регулиране нагоре в f-have, трябва да се считат за регулирани надолу в p-has и обратно.

отчитат се стойности; вижте таблица S2 за пълния списък и подробни параметри на докладваните протеини. (C) Анализ на обогатяване на биологични процеси на протеини, идентифицирани с честота най-малко 2 във фетален hAFS-CM (ляв панел) и перинатален have-CM (десен панел) според клетъчно хипоксично предварително кондициониране. Въз основа на инструмента FunRich термините на генната онтология са показани в лентови диаграми, отчитащи процента на обогатените гени за всяка категория (розови ленти за-имам-CMnormo, лилави ленти за f-hAFS-CMhypor светлосини ленти за p-hAFS-CMnormo, и сини топчета за p-hAFS-CMhypo).купи цистанчеСамо термини от генната онтология с Bonferroni, коригирани с *p<0.05 are="">

Тази статия е извлечена от Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms